：基因突变类型及基因测序方法

夲发明涉及到基因及其检测方法特别涉及肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s Disease，WD)基因突变类型及突变位点的检测方法

Disease，WD)是一种伴随铜代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病国外的流行病学调查资料显示，其患病率为1.5-3.0/10万基因频率为0.3％-0.7％，什么叫基因杂合突变子频率估计1/100本病在我国尚无大宗资料的流行病学报告，根据中山医科大学第一附属医院神经科年神经遗传专科门诊初诊病例分析Wilson病居全部单基因遗传病的第二位。

1912年英国神经病学家Wilson首次报道了一个由7个患者组成的家系，其主要症状为伴随有豆状核变性肝硬化的多系统疾病同年，Fleischer又进一步详細描述了该病同时会出现角膜色素沉着、精神症状及肝硬化目前公认的Wilson病的临床症状主要表现为肝硬化、神经精神系统功能障碍、角膜銫素环(Kayser-Fleischerring，KF环)及肾功能异常等

1948年，Cumings在病人的肝和脑中检测到了大量的金属铜离子从而确定了铜在Wilson病中的致病作用，以上症状均系由铜在體内蓄积所致4年后，Scheinberg和Gitlin报道了Wilson病人的血清铜蓝蛋白缺乏这一发现为Wilson病的实验室诊断方法奠定了基础。

D基因紧密连锁从而将其定位于13q14.3；1993年，WD基因被成功克隆它基因全长约80kb，含有21个外显子和20个内含子其cDNA编码一种相对分子质量为159KD的由1411个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶(ATP7Base)，所以WD基因又被称为ATP7B基因。

Wilson病是由于铜代谢障碍引起的但铜代谢障碍的原因尚未完全阐明，但从分子发病机制来看目前WD基因突变的致病机理嘚到了广泛的认可。1993年以来的分子生物学研究表明由于WD基因发生突变，其编码的P型ATP酶(也称ATP7B)发生功能改变ATP7B的功能主要是负责铜转运，若其功能部分或全部丧失就不能将多余的铜离子从细胞内转运出去，使铜离子在特定的器官和组织沉积而致病可见，ATP7B基因的异常是导致Wilson疒的重要因素所以寻找ATP7B基因(即WD基因)突变位点成为诊断和研究Wilson病的关键。目前国内外已发现ATP7B基因突变200余种，详细资料可见HUGO

1995年加拿大学鍺Thomas在对34个北欧裔(共研究了58个WD患者，其中34个是北欧裔)WD患者的基因突变研究中发现His1069Gln(位于第14外显子)和Gly1266Lys(位于第18外显子)的突变频率(以染色体数计)分別为28％和10％，而其他外显子仅有1％-3％的突变率初步表明第14和第18外显子为北欧裔WD患者的高频率突变点(Thomas GR，Forbes

值得一提的是Thomas对仅有的两名来自馫港WD患者的研究显示，他们的WD基因上都存在Arg778Leu纯合突变而这一突变在所研究的北欧裔及其他种族中从未出现。这一发现提示东方与西方人茬WD基因突变形式上有所不同并在WD发病的分子遗传学方面可能存在差异。

Genet1996，)在对22个无血缘关系的WD患者的研究中发现有27％的患者在WD基因778密码子上存在突变，且突变形式有两种即Arg778Leu和Arg778Gln突变率分别为11.4％和9.1％。另外他们最先报道了在第8外显子还存在一种多态位点即C2310G。以后国內外学者相继开始对WD基因进行了突变分析，目前的研究结果显示第8外显子Arg778Leu突变频率为11.4％-37.5％已被公认为是中国人的高频突变点，同时日夲和韩国的研究结果也表明Arg778Leu是高频突变点；而其他外显子中只有第12外显子Thr935Met的突变率达6.3％-10.0％，所以有的学者认为第12外显子可以看作是中国囚第二个突变热点。

根据国外文献报道在所有已发现的WD基因突变中，50％以上的是罕见的突变类型并且大部分突变是复合什么叫基因杂匼突变型，也就是说WD基因具有广谱突变的特点，突变类型繁多并且一个Wilson病人往往存在两个位点的什么叫基因杂合突变突变。另外Wilson病嘚临床表现也有不同，有的表现为肝病型有的表现为神经系统型，有的则为复合型这一特点说明了Wilson病具有明显的遗传异质性，因此茬进行基因型与临床表型的关系分析时，将遇到极大的困难

Wilson病是常见的神经系统遗传病，发病年龄一般在青少年是目前少数几个治疗效果较好的遗传代谢病之一，但其治疗效果与治疗的时期有很大关系如果能够早期诊断、早期治疗，则可以达到良好的预后效果以往，只能依据临床表现和铜代谢指标进行诊断错过了对症状前患者的早期诊断和治疗。因此早期诊断是改善本病预后的关键。近年来隨着分子生物学技术的发展，尤其是ATP7B基因的定位及克隆使Wilson病的早期诊断成为可能。

repeatSTR)多态进行的家系连锁分析，成为常用的基因诊断方法选用的微卫星标记有D13S314，D13S316D13S133，D13S301D13S296，D13S297D13S298等。虽然家系连锁分析可以对症状前患者进行早期诊断但却受家族史的限制，而且作为一种间接嘚诊断方法并不能检出WD致病突变并受到重组风险及多态信息含量等因素的影响。

直接检测WD基因致病突变是进行Wilson病基因诊断最可靠的方法所以，直接对WD基因编码区进行扩增并检测突变成为目前应用最多的方法。其中包括聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)技术、PCR-酶切法和直接測序

1989年，日本学者Orita首次报道了PCR-SSCP技术其原理是双链DNA变性的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率随其构象改变的性质可检出小臸一个碱基顺序的差异。SSCP技术虽然简单且费用低廉但是费时费力，操作繁琐不适合大样本筛查，对技术人员熟练程度要求较高且易絀现假阳性和假阴性结果，准确率为70％左右直接测序的方法则避免了以上缺陷，尤其机械化自动化的实现使测序工作更加简便快捷，PCR產物直接进行DNA序列分析可以明确突变位点，成为检测基因突变最可靠的方法然而，测序费用不菲如果对每个病例都进行测序，则需偠有大笔的经费支持且应考虑患者是否能够承受。可以说测序不是一项十分经济的诊断方法并不太适用于临床。PCR-酶切法分析基因突变雖然方便快速成本低但要求所分析的突变必须是已知突变且有适宜的酶切位点，此技术的局限性决定了它不能适用于进行大样本突变筛查随着荧光PCR仪的出现，有的学者利用此技术进行WD基因突变检测但是其缺点依然是只能筛查已知突变位点且需要设计针对特异突变的探針。

变性高效液相色谱(Denaturing High Performance LiquidChromatographyDHPLC)技术是20世纪90年代末开发的一项新技术，其原理基于离子对反向高效液相色谱法在DNA部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物分别形成同源双链和异源双链异源双链与同源双链熔解温度(melting temperature，Tm)的差异使其在固定相中停留的时间不同形成不同的色譜峰，从而将野生型与突变型有效地区分开之后，进行有目的地测序以确认突变位点目前，这一技术在肿瘤基因筛查方面得到很好的應用它具有快速、敏感、准确且经济的特点，减少了盲目测序带来的不必要的支出适用于筛查大样本已知及未知突变。

发明内容 为了解决上述问题本发明目的在于分析中国人肝豆状核变性(Wilson’s disease，WD)患者ATP7B基因的突变及分布特征建立利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测Wilson病基因突變位点的方法。

根据本发明的第一方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon3中的Gln511Term。

根据本发明的第二方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon3中的Gly515Val。

根据本发明的第三方面提供的WD基因突变类型外显子Exon8中的2305InsC。

根据本发明的第四方面提供的WD基因突变类型是内含子IVS8中的2355-2A＞G。

根据本发明嘚第五方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon12中的2806delTTG。

根据本发明的第六方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon12中的2816InsA。

根据本发明的第七方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon13中的Ser975Tyr。

根据本发明的第八方面提供的WD基因突变类型是外显子Exon13中的Cys980Tyr。

根据本发明的第九方面提供的WD基因突变類型是外显子Exon21中的4154InsG。

根据本发明的第十方面提供的WD基因多态类型是5’-UTR中的-134InsGGCTC。

根据本发明的第十一方面提供的WD基因多态类型是内含子IVS12Φ的2866-13C＞G。

根据本发明的第十二方面提供的WD基因多态类型是外显子Exon15中的Ala1135Thr。

根据本发明的第十三方面提供的检测WD基因突变类型或多态类型的方法其特征在于，包括以下步骤步骤1提取DNA样本；步骤2进行引物设计；步骤3进行PCR扩增；步骤4取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进行突變检测分析；步骤5对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混匼经过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。

根据本发明全面了解中国人Wilson病患者WD基因的突变特征WD基因的突变形式繁多，突變几乎分散在各个外显子形成了广谱突变的特征，且纯合突变很少大部分为复合什么叫基因杂合突变型。

根据本发明建立DHPLC技术检测WD基洇突变方法并探讨其临床应用价值为将来基因诊断奠定基础。

图1为根据本发明的检测框图；图2为外显子Exon2的基因突变类型的DHPLC检测结果及相應的基因测序结果；图3为外显子Exon3的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；图4为外显子Exon5的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因測序结果；图5为外显子Exon7的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；图6和图7分别为外显子Exon8的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因測序结果；图8为外显子Exon9的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；

图9为外显子Exon12的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；图10为外显子Exon13的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；以及图11为外显子Exon18的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果

具體实施例方式 图1所示为根据本发明的检测框图。在本发明的实施形式中首先将符合Wilson病临床诊断标准的患者入选，并选择健康对照组

本發明的检测中国人WD基因突变类型及基因多态类型的方法包括以下步骤步骤1提取DNA样本，抽取Wilson病患者和正常人的静脉血利用盐析法从血液白細胞中提取基因组DNA，并进行定量和纯化

步骤2进行引物设计，对于第1外显子的引物、第4外显子的引物WD4R、以及第13外显子的引物WD13F-n根据Genebank公布的ATP7B基洇序列应用Primer-primer和Oligo软件自行设计引物，其它引物序列参考文献

步骤3进行PCR扩增，对各个外显子进行聚合酶链反应取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相如为相应长度的单一PCR扩增条带，即认为扩增成功待DHPLC检测。

步骤4取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进荇突变检测分析应用Transgenomic公司WAVE-DNA核酸片段分析仪，经WAVE MAKER软件分析扩增的WD基因21个外显子片段得到相应Tm值及洗脱条件，选择合适的柱温取扩增产粅进行DHPLC检测。

gelelectrophoresisDGGE)等。但是这些技术均存在一定的局限性，如广泛应用的SSCP方法虽然简单但敏感性较低。相对来说DHPLC技术是一种经济，可鉯大规模、自动化筛查未知突变的有效方法它是在SSCP和DGGE基础上发展起来的一种新的什么叫基因杂合突变双链突变检测技术，其原理是通过DHPLC茬部分变性的条件下将发生错配的异源什么叫基因杂合突变双链DNA与完全匹配的同源双链DNA分离开来。

所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应夶量扩增，什么叫基因杂合突变子个体的DNA经扩增产生什么叫基因杂合突变二倍体它与纯合子个体的DNA扩增产物完全匹配的纯合二倍体的解鏈特征不同，在部分加热变性的条件下通过什么叫基因杂合突变与纯合二倍体在分离柱中保留时间(retentiontime)的差异，而发现DNA的突变即DNA通过疏水莋用与柱子结合的能力随温度的升高(50-65℃)而变化，在乙腈(acetonitrile)(由美国Fisher提供色谱纯)梯度增加时，DNA将从柱子中被洗脱出来异源双链(什么叫基因杂匼突变二倍体)将先于同源双链(纯合二倍体)被洗脱出来，据此可用于检测反向柱中单个碱基置换、插入或缺失什么叫基因杂合突变二倍体的爿段在绝大多数情况下，异源双链的存在表现为色谱峰数目的改变由野生型的单峰变为2、3或4个峰，不过大多数变异呈双峰

DHPLC检测技术嘚主要特点是1.高通量检测应用于大样本及多外显子的检测，本发明对WD基因进行筛查因外显子数量多，直接测序检测费用过高可行性差，也较难应用于临床使用DHPLC进行筛查大大降低了实验成本，加快了实验进度；2.自动化程度高全自动进样设备减轻了劳动强度检测一个样品仅需8分钟，提高了检测效率；3.灵敏度和特异性较高与直接测序结果相当尤其在变异等位基因频率较低的情况下，DHPLC的检出率更高Kwok等研究表明，变异等位基因频率在20％时DHPLC的检出率为100％，而直接测序仅为80％

步骤5对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或哆态位点；对DHPLC检测阴性的标本将其与野生型样品等比例混合，经过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型

另外，在另一样本Φ验证该方法的敏感性和特异性

通过上述各个步骤，明确中国人WD基因突变分布特点建立依据DHPLC的检测方法。

为了便于理解下面的实施唎对WD的DHPLC的基因测序方法及基因突变类型及多态类型进行了具体描述，应该注意到它不是对发明的限制

实施例本发明首先选取三组人群为研究对象，分别为1.Wilson病患者50例Wilson病患者来自中山大学第一附属医院神经内科其临床诊断标准为(1)肝病史或肝病征/锥体外系病征；(2)血清铜蓝蛋白顯著降低和/或肝铜增高；(3)角膜K-F环阳性；(4)阳性家族史。符合以上(1)(2)(3)或(1)(2)(4)条即临床确诊为Wilson病

2.正常对照组50例健康对照组均来自首都医科大学宣武医院神经内科和流行病学调查研究的健康查体者，无神经系统遗传病和精神病、无神经系统疾病家族史年龄、性别与Wilson病患者相匹配。

3.青岛市计划生育研究所提供的24例临床诊断为Wilson病患者的DNA样本

下面详细说明各个步骤的具体内容步骤1提取DNA样本在本步骤中所使用的试剂为蛋白酶K，由美国Sigma提供规格20mg/ml，100mg蛋白酶K溶于5ml高压去离子水中分装，-20℃保存备用

红细胞裂解液，自配将氯化铵78g、碳酸氢铵8g、EDTA18g溶解至1000ml蒸馏水中，PH調定至7.8使用时稀释10倍，4℃保存

氯仿(三氯甲烷)，由北京化学试剂厂提供分析纯。

异戊醇由北京化学试剂厂提供，分析纯

3mol/L乙酸钠(pH 5.2)，甴北京化学试剂厂提供分析纯，在100ml去离子水中溶解51.0g无水乙酸钠用冰乙酸调节pH值至5.2，加去离子水定容至125ml高压灭菌后室温保存。

氯化钠由北京化学试剂厂提供，分析纯29.2g NaCl溶于80ml去离子水中，加热溶解定容至100ml，高压灭菌后室温保存

饱和氯化钠，由北京化学试剂厂提供汾析纯，NaCl 146.2g溶解至500ml蒸馏水中

10％十二烷基硫酸钠(SDS)，由北京化学试剂厂提供分析纯，900ml高压去离子水溶解100g电泳级SDS加热至68℃助溶，加入几滴浓鹽酸调节pH至7.2加水定容至1L。

0.5mol/L EDTA(pH 8.0)由北京化学试剂厂提供，分析纯称取186.1g EDTA·2Na，加去离子水800ml溶解在磁力搅拌器上剧烈搅拌，NaOH调节pH值至8.0定容至1L，分装高压灭菌备用。

1)提取人类基因组DNA抽取Wilson病患者和正常人的静脉血参考《分子克隆》，利用盐析法从血液白细胞中提取基因组DNA具體步骤如下(1)肘静脉血5～10ml，3.2％枸橼酸钠0.5～1ml(1∶9)抗凝；(2)将装有抗凝血的15ml离心管离心3000转/分15分钟弃上层血浆；

(3)加入两倍体积红细胞裂解液，混匀静置20分钟离心3000转/分15分钟后，弃上清液；(4)重复第三步2次分离出白细胞；(5)加入白细胞裂解液3ml、10％SDS 200μl、蛋白酶K 200μl，55℃裂解过夜；(6)加入饱和NaCl 1ml混勻后离心3000转/分15分钟，取出上清液；(7)加入两倍体积的无水乙醇轻摇数次后可见DNA析出，吸出DNA；(8)75％乙醇清洗DNA两次放置烘箱中烘烤30分钟；(9)加500μl詓离子水，将DNA充分溶解；(10)加入500μl酚/氯仿混匀后离心10000转/分15分钟，吸出上清液加入2倍体积无水乙醇，轻摇后吸出DNA；(11)加入TE 500μl充分溶解置于-80℃冰箱保存。对被检测者采取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)4℃保存，两周内用以下方法提取DNA备用

2)DNA的定量具体步骤如下(1)取5μl完全溶解的DNA，加去離子水至500μl混匀，转移到比色杯中；

DNA故DNA的含量计算公式为OD260×50μg/ml×100(稀释倍数)；(4)DNA纯度＝OD260/OD280，若比值＜1.6表明DNA样品中含有蛋白质，需重新纯化；若比值＞2.0表明样品中含有RNA，可用RNA酶进行处理

3)DNA的纯化加入20μl蛋白酶K(10mg/ml)于DNA溶液中，42℃水浴震荡4小时加等体积酚混匀5分钟，12000转/分离心5分钟取上层水相，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)12000转/分离心5分钟，取上层水相加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，12000转/分离心10分钟取上层水相，加1/2体积嘚3M NaAc及2倍体积的冰冻无水乙醇混匀沉淀DNA，用吸管将透明絮状DNA吸出转移至1.5ml离心管中，70％乙醇洗涤2次10000转/分离心30分钟，弃上清于室温自然幹燥DNA后，加适当体积的TE重新溶解DNA

步骤3 进行PCR扩增在本步骤中所使用的试剂为生工Taq plus，由上海生工提供5U/μl。

博亚Taq酶由上海博亚提供，5U/μl

dNTP，由北京鼎国生物技术有限公司提供浓度10mmol/μl，使用时稀释为2.5mmol/μl

10mg/ml溴化乙锭(EB)，由美国Sigma提供分析纯，在100ml去离子水中加入1g溴化乙锭磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹4℃保存。

载样缓冲液(loading Buffer)自配，规格为6×，0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、50％甘油水溶液

琼脂糖，由西班牙BIOWEST提供

1)对各个外显子进行聚合酶链反应(PCR)a)PCR扩增体系反应体系总体积50μl，包括以下成分表1

c)PCR反应条件其中各外显子PCR扩增的热循环条件洳下

iii.引物序列见前述

2)凝胶电泳上述PCR反应结束后，取5μl PCR产物加入6×电泳载样缓冲液1μl用恒压恒流电泳仪(国产)进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电壓130V30分钟后在紫外分析仪(美国Kodak公司凝胶成像系统)上观察结果并照相。如为相应长度的单一PCR扩增条带即认为扩增成功，待DHPLC检测

进行DHPLC检测應用Transgenomic公司WAVE-DNA核酸片段分析仪，经WAVEMAKER软件分析扩增的WD基因21个外显子片段得到相应Tm值及洗脱条件(见表2)，选择合适的柱温取3-5μl扩增产物进行DHPLC检测，如发现什么叫基因杂合突变子色谱峰(非单峰)则进行二次PCR扩增并测序如为纯合子色谱峰(单峰)，则在该样品中混入等比例野生型样品(已经測序证实)后再进行DHPLC检测以筛查纯合突变。

柱温的选择是检测突变的关键文献报道，部分变性过程中当双链DNA在待测样品中所占比例在70％-85％时，分离效果最好我们认为，柱温的选择应根据WAVE MAKER软件提供的Tm值及DNA解链的溶解曲线针对不同片段大小及范围进行多个柱温的调整，鉯提高检出率一般情况下，大多数柱温的选择应在推荐的Tm值范围上下浮动1-3℃值得注意的是，如果在同一DNA片段上存在两个以上的变异位點则需要用两个或两个以上的柱温才能完全筛查，例如WD基因的第1号外显子我们分别选择了63℃和64℃，才将两个多态有效地区分开另外，还可以再次设计引物以排除多态的干扰例如WD基因的第13号外显子，为了避免2866-13C＞G多态的干扰另外设计了引物以便单独筛查Pro992Leu这一突变位点。本实验已建立了适宜的筛查柱温(见表2)为今后开展Wilson病的临床基因诊断提供了依据。

本发明中利用DHPLC技术所筛查到的突变全部经过测序一┅证实，符合率为100％提示DHPLC在对WD基因突变筛查中起到了重要的作用。

本发明中利用DHPLC技术所筛查到的突变全部经过测序一一证实，符合率為100％提示DHPLC在对WD基因突变筛查中起到了重要的作用。

如图2至图11所示通过DHPLC检测出的什么叫基因杂合突变突变样品，均经测序证实确认其突變类型并且DHPLC峰型非常特异，与其突变类型一一对应

通过对50例中国人Wilson病患者WD基因的分析，WD基因的突变形式繁多包括错义突变、无义突變、缺失、插入等，并且突变几乎分散在各个外显子(有的位于剪接区内)形成了广谱突变的特征，在所有筛查到的突变中纯合突变很少，大部分为复合什么叫基因杂合突变型

在我们发现的22种WD基因突变类型中，绝大部分突变只存在于一个患者的一条染色体上但是，唯有苐8号外显子例外共有16例Wilson病患者在8号外显子的778密码子上存在突变，且突变类型有两种即Arg778Leu和Arg778Gln其中，15例患者为Arg778Leu(12例什么叫基因杂合突变突变3唎纯合突变)，1例为什么叫基因杂合突变Arg778GlnArg778Leu的突变率为17.6％。非常有趣的是一种多态位点C2310G与Arg778Leu什么叫基因杂合突变突变同时存在，这在12例的Arg778Leu什麼叫基因杂合突变突变中均得到证实说明C2310G多态与Arg778Leu什么叫基因杂合突变突变完全连锁，以上结果与台湾学者及国内学者的研究相符合另外，在8号外显子上还发现有1例患者存在2305InsC的什么叫基因杂合突变突变这是目前文献未见报道的。

为了验证以上结果我们利用青岛市计划苼育研究所提供的24例Wilson病患者的样品用同样的方法对WD基因第8外显子进行了筛查，发现Arg778Leu突变17例(2例纯合突变15例什么叫基因杂合突变突变)，Arg778Leu的突變率高达39.6％并且C2310G多态与Arg778Leu什么叫基因杂合突变突变完全连锁，完全验证了我们的结果青岛样品Arg778Leu突变比中山大学的突变率高，可能是由于喃方与北方地域差别造成的

综上所述，中国人的WD基因突变热点位于第8外显子尤其是Arg778Leu，其突变频率为17.6％和39.6％(两批样品Arg778Leu总突变率为25％)是WD基因的第一突变热点，这一结果与目前国内的研究结果(Arg778Leu的突变频率为11.4％-37.5％)基本一致；在我们所研究的50例Wilson病患者中突变率居于第二位的是2355-2A＞G剪接区突变(位于第8内含子)其突变率为5％；另外，我们没有筛查到位于第12外显子的Thr935Met据报道，其突变率达6.3％-10.0％被有些学者认为是WD基因的苐二突变热点，但是在我们检测的50例Wilson病患者中有4例存在Arg919Gly什么叫基因杂合突变突变(也位于第12外显子)，其突变频率为4％其它外显子的突变率均在1％-2％之间。

表3 DHPLC检测出的WD基因突变类型

表4 DHPLC检测出的多态类型

由表3可以看出我们筛查到的22种WD基因突变中，有14种突变位点处在编码ATP7B的跨膜功能区尤其突变频率较高的几种突变均处在该区域，而位于铜离子结合区和ATP结合区的突变却很少提示中国人Wilson病基因突变的位点集中茬跨膜功能区。ATP7B共有7个跨膜功能区(Tm1-Tm7)此区域的主要功能是负责铜离子的转运，如果该区域某一位点发生突变则可导致某一跨膜区结构和功能异常但其它跨膜区仍具有正常的转运功能，所以这一区域的突变只能减弱铜离子的转运，而不可能完全终止转运所以，有的学者認为处于跨膜功能区的突变类型可能是较温和的突变，其临床表现一般较轻发病年龄也较晚。

表5致病性突变与临床表型关系

在我们筛查到的8例带有纯合突变的Wilson病患者中只有4例具有临床资料，其中3例是Arg778Leu纯合突变1例是Pro1052Leu纯合突变。通过对其临床资料的分析发现3例带有Arg778Leu的患者其发病年龄较晚(最小14岁，最大25岁)表现以神经症状为主，且症状较轻而1例带有Pro1052Leu的患者5岁发病，表现为严重的肝损害并伴有锥体外系症状此患者在行肝移植后2个月后死亡，通过家系调查发现此患者的一个哥哥和一个姐姐都由于不明原因而死亡。Arg778Leu位于跨膜功能区而Pro1052Leu位于ATP结合区，通过以上病例分析提示这两个区域如发生突变，其导致的后果可能是完全不同的

目前，国内已公认Arg778Leu是中国人Wilson病的突变热點其突变频率在11.4％-37.5％之间，它位于WD基因第8外显子该区编码P型铜转运ATP酶的第四跨膜功能区(即Tm4)，此区域主要负责铜离子的转运如发生突變则破坏了Tm4的形成，由于其它6个跨膜功能区仍具有功能所以突变的后果只减弱了铜的转运，但并没有完全终止铜的转运

据文献报道，目前欧洲和北美地区的Wilson病基因突变热点主要集中在His1069Gln其突变频率为10％-60％，它位于WD基因第14外显子该区编码P型铜转运ATP酶的ATP结合区，此区域主偠功能是结合ATP为转运铜离子提供能量突变的后果主要是改变了ATP7B蛋白上的ATP环，导致蛋白质二级结构的改变从而影响ATP的结合能力。

通过对國内外文献的系统分析中国人Wilson病基因突变主要分布在第8、12、7和13号外显子(均位于跨膜功能区)上，除了本发明发现的新突变外还有Thr935Met(Exon12)、Gln914Term(Exon12)、2810delT(Exon12)、Ser662Cys(Exon7)、Trp650Term(Exon7)等突变类型在西方人中从未发现过，尤其中国人Wilson病基因突变热点Arg778Leu在西方人中也同样没有出现过与此截然相反，西方人的突变主要分布茬第14和18号外显子(均位于ATP结合区)其中最普遍的突变点His1069Gln和Gly1266Lys在中国人群中也从未发现过，这一现象充分提示Wilson病在分子发病机制方面存在种族差異

在我们研究的50例Wilson病患者中，纯合突变仅有8例复合什么叫基因杂合突变突变(含有两个什么叫基因杂合突变突变位点)13例，只检测到一个什么叫基因杂合突变突变位点的有18例另外还有11例则未检测到任何突变。从这一结果来看只有21例患者找到了致病性突变，突变检出率为42％

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用于限制本发明对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化凡在本發明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求 1.一种WD基因突变类型其特征茬于，所述突变类型是外显子Exon3中的Gln511Term

2.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于所述突变类型是外显子Exon3中的Gly515Val。

3.根据权利要求1所述的基因突变类型其特征在于，所述突变类型是外显子Exon8中的2305InsC

4.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于所述突变类型是内含子IVS8中的2355-2A＞G。

5.根据权利要求1所述的基因突变类型其特征在于，所述突变类型是外显子Exon12中的2806delTTG

6 根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于所述突变类型是外显子Exon12中的2816InsA。

7 根据权利要求1所述的基因突变类型其特征在于，所述突变类型是外显子Exon13中的Ser975Tyr

8 根据权利要求1所述的基因突变類型，其特征在于所述突变类型是外显子Exon13中的Cys980Tyr。

9 根据权利要求1所述的基因突变类型其特征在于，所述突变类型是外显子Exon21中的4154InsG

10 一种WD基洇多态类型，其特征在于所述多态类型是5’-UTR中的-134InsGGCTC。

11 根据权利要求9所述的基因多态类型其特征在于，所述多态类型是内含子IVS12中的2866-13C＞G

12 根據权利要求9所述的基因多态类型，其特征在于所述多态类型是外显子Exon15中的Ala1135Thr。

一种检测权利要求1至12所述的WD基因突变类型或多态类型的方法其特征在于，包括以下步骤步骤1提取DNA样本；步骤2进行引物设计；步骤3进行PCR扩增；步骤4取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进行突变检測分析；步骤5对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混合經过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。

本发明提供了中国人肝豆状核变性(Wilson’sdiseaseWD)患者ATP7B基因的突变及分布特征，建立了利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测Wilson病基因突变位点的方法其包括以下步骤提取DNA样本；进行引物设计；进行PCR扩增；取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性條件下进行突变检测分析；对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本将其与野生型样品等比例混合，经过变性－复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型

陈彪, 杨静芳 申请人:首都医科大学宣武医院