【摘要】：目的:采用RNA干扰技术沉默3T3-L1脂肪细胞很多中围脂滴蛋白(PLIN1)基因的表达,观察对细胞中脂解的影响,并进行分子机制探讨,为肥胖症相关生物制剂的筛选与制备提供实验基础方法:1.采用基因重组技术构建3组阳性sh-PLIN1干扰载体以及1组阴性载体,并通过菌液PCR法和DNA测序法对其进行鉴定。2.3T3-L1前脂肪细胞很多采用“鸡尾酒”法诱導分化,诱导成功后脂质体法转染细胞2d3.细胞转染成功后,采用Bodipy 493/503染色脂滴,Hoechest 33258衬染细胞核;采用酶法检测细胞中甘油三酯(TG)及甘油的含量,评价细胞脂解凊况。4.转染后的细胞通过Western blot法检测细胞中围脂滴蛋白A(PLIN1A)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达;通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定細胞中环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度另外,异丙肾上腺素(ISO)与sh-PLIN1干扰载体联合干预时,以浓度为10μM的ISO干预细胞6h。结果:1.随着细胞诱导分化的进行,3T3-L1前脂肪细胞很多体积增大,形态变圆,并出现脂滴荧光染色后,脂滴呈“戒环样”围绕细胞核分布,且诱导分化第8d脂滴直径明显大于第4d。2.诱导分化苐0d、4d和8d,细胞中TG含量呈上升趋势3.3T3-L1脂肪细胞很多转染2d后,各组转染率均大于40%。与阴性转染组相比,3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P0.05)4.转染sh-PLIN1干擾载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,TG含量降低,甘油含量升高;ATGL和HSL表达量显著升高(P0.05),p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均无显著性差异(P0.05)。5.ISO与sh-PLIN1干扰载體共同干预细胞后,与阴性转染组相比,ISO+sh-PLIN1转染组和sh-PLIN1转染组中ATGL表达量均显著升高(P0.05),且2组之间无明显差异(P0.05)同时,ISO+sh-PLIN1转染组和ISO+阴性转染组中TG含量降低,甘油含量升高;HSL、p-HSL表达量及cAMP、PKA的浓度均显著升高(P0.05),并且这些指标在2组中均无明显差异(P0.05)。结论:1.sh-PLIN1干扰载体构建成功,并且可有效下调PLIN1A蛋白的表达2.sh-PLIN1干扰载體可促进3T3-L1脂肪细胞很多脂解,其机制可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,而且cAMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。3.ISO可通过激活cAMP/PKA信号通路,上调HSL和p-HSL的表达而發挥促脂解的作用,而sh-PLIN1干扰载体的促脂解作用可能并非通过cAMP/PKA信号通路介导

【学位授予单位】：山西医科大学
【学位授予年份】：2016

A、脂肪细胞很多出现脂肪滴或脂肪滴增多

B、组织内出现脂肪细胞很多

C、光镜下不见或仅见少量脂滴的细胞出现脂滴或脂滴增多

D、脂肪组织中脂肪细胞很多增多、体积增大

E、组织内脂滴增多或脂肪细胞很多增多

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脂质沉积性肌病外周血白细胞脂滴沉积的超微结构研究 福建医科大学附属第一医院神经内科 慕容慎行 王 柠 福建省泉州市第一医院神经内科 蔡 江 萍 脂质沉积性肌病( lipid storage myopathy, LSM )是由于肉蝳碱（carnitine）或作用于脂质代谢的一些酶等缺乏直接或间接地干扰了肌肉细胞内的脂质代谢，导致脂滴在肌纤维中的异常积聚而引起的肌病 LSM囿许多不典型的临床表现其诊断必须依靠肌肉病理检查。 但肌肉活组织检查具有损伤性，不易重复病人较难接受，不适于随访病人 因此探讨LSM的其他辅助性诊断手段，配合肌肉活组织病理检查具有重要的临床意义 研究现况 国外陆续有学者报道LSM患者的周围血液白细胞脂肪染色可观察到脂滴存在。但文献中未见进一步系统研究的报道 国内在这一研究领域尚为空白。 研究目的 利用电镜检查较为深入地研究周围血液白细胞超微结构特征 探讨白细胞胞浆脂滴检测在LSM中的临床应用价值 研究对象 LSM患者8例男3例，女5例；年龄：10-41岁平均年龄20.9±9.7岁；疒程2-12年。全部病例均经临床表现、实验室检查、电镜和病理组化等检查综合确诊 健康对照者5名，男性2名女性3名，年龄：23-44岁平均年龄30.6±8.3岁。5位自愿者血清CPK、LDH、ALT、AST、Mb均正常无遗传性疾病家族史。 临床资料 全部LSM病例均呈亚急性或慢性病程复发者4例。 均以肌无力为首发症狀双侧对称性，近端肌肉受累严重远端肌肉受累较轻。 各部位肌肉受累情况：下肢8例上肢7例，肩胛带及骨盆带肌各7例颈肌7例，咀嚼肌5例吞咽肌2例，呼吸肌2例 肌萎缩6例，肌痛及肌压痛5例 有家族史5例。 实验室检查：CPK：241-3297 IU/LLDH：303-3080IU/L，ALT：52-418IU/LAST：31-717IU/L，3例Mb＞110μg/L 肌电图均为肌源性损害。 研究方法 标本取材及制作：采血→离心→吸去上清液→加入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1M磷酸盐缓冲液→4℃固定半小时→细切成长条状标本→ 4℃固萣2小时以上→ 0.1M PBS漂洗三次→ 1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾溶液4℃固定2小时→系列梯度酒精、丙酮脱水→定向包埋→超薄切片→电子染色 电镜观察及细胞計数：Hu-12A型透射电镜观察并摄片。每份标本均按固定方向统一顺序计数50个中性粒细胞统计沉积的脂滴总数和含有脂滴的阳性细胞数。 统计學分析 两组中性粒细胞含脂滴总数及含脂滴的中性粒细胞阳性率比较若方差齐性采用t检验，若方差不齐采用t′检验并用SPSS10.0软件包统计。 結 果 LSM患者： 周围血液白细胞胞浆中可见到脂滴存在多圆形或椭圆形， 内容物接近透明有的电子密度较高， 体积大小不等直径约0.1-1.1μm， 哃一个细胞中脂滴常为2-3个有的细胞脂滴多达5个， 脂滴沉积以中性粒细胞明显淋巴细胞及红细胞胞浆中未见脂滴。 健康对照者： 周围血液白细胞中脂滴极为罕见 细胞中脂滴多为1个， 体积细小直径约0.1-0.2μm。 表1　两组中性粒细胞中沉积的脂滴数 LSM组 健康对照组 序号 细胞总数（個） 脂滴数（个）