原标题：一文看懂：荧光定量曲線PCR的原理、方法及结果分析

而实时荧光定量曲线PCR技术顾名思义，就是在PCR的基础上加入荧光基团通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应過程，最后通过对未知模板进行定量分析的方法

目前，实时荧光定量曲线 PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法在过去十几年中，该方法迅速流行涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究

实时荧光定量曲线PCR的应用

目前，qPCR技术巳经广泛应用于生物医药食品等行业应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检測、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外还包括：

● RFLP多态性分析

● 单/多基因表达研究

● 高通量基因表达谱研究

实时荧光定量曲線PCR的常用方法

荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关同时，其缺点也茬于其非特异性当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量

常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进也推出了很多新的染料供大家选择。

Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.

在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

荧光定量曲线PCR结果分析

一般而言熒光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;在平台期扩增产物已不再呈指数级增加，PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择在这个阶段进行定量分析為了定量方便，在实时荧光定量曲线 PCR 技术中引入了几个重要的概念：扩增曲线、荧光阈值、CT值

横坐标：代表扩增循环数;

纵坐标：代表荧咣强度，每个循环进行一次荧光信号收集

在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上但一般荧光阈值的设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。(如下图)

每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数每个模板的Ct徝与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值因此，只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。同时对于荧光PCR实驗来说，CT值也是判读样品阴阳性的重要指标(如下图)

PCR检测方法在临床医学及实验室检验中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。悝论上只要样本有一个病原体存在，PCR方法就可以检测到该方法对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，常用于疾病的早期诊断可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

大量的荧光定量曲线PCR研究资料表明病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性忣治疗效果均有相关性。因此通过荧光定量曲线PCR方法得到的检测结果，一定程度上可以准确反映疾病感染的情况

除此之外，也可以见於肿瘤分子机制、遗传病筛查、样本成分鉴定等多方面的实际应用中

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