第二十二章 高 效 液 相 色 谱 法 第一節 概述 高效液相进样瓶怎么用色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）是20世纪六十年代末在经典液相进样瓶怎么用柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术采鼡高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器发展而成的分离分析方法。 第一节 概述 经典柱色谱法流动相是在常压或低压下运行传质速度慢，所用固定相颗粒粗柱效低，分离时间长；色谱柱不能连续使用；样品用量大灵敏度低；除了用于制备分离外，不 能在线检测HPLC和GC嘚基本理论一致，定性定量原理完全一样均可用计算机控制色谱条件和色谱的处理程序进行在线检测。 第一节 概述 HPLC和GC的不同点为： ①流動相不同：GC用气体做流动相载气种类少，性质接近改变载气对柱效和分离效率影响小。HPLC以液体做流动相且液体种类多，性质差别大可供选择范围广，是控制柱效和分离效率的重要因素之一； ②固定相差别：GC多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液体固定相且粒度粗。HPLC大都是新型的固体吸附剂、化学键合相等粒度小（一般为3～10μm）； ③使用范围更广：GC主要用于挥发性、热稳定性好的物质的分析。因此GC只能分析占有机物总数15%～20%的物质。HPLC可分析高沸点、难挥发和热不稳定的化合物、离子型化合物和高聚物乃至生物大分子等物质 第一節 概述 HPLC采用高灵敏度检测器，如紫外检测器的最小检测量可达纳克(10-9g)级、荧光检测器的灵敏度可达10-11gHPLC的特点：分离效率高、分析速度快、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流动相可选择范围宽、流出组分容易收集、操作自动化、适用范围广。 第二节 高效液相进样瓶怎么用色谱仪 高效液相进样瓶怎么用色谱技术得到迅速发展基本原理和色谱流程都是相同的，仍然由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检測记录数据处理系统组成 溶剂贮器1中的流动相经混合室2混匀，被泵3吸入然后输出，导入进样器5被分析样品用注射器6由进样器处注入，并随流动相一起依次通过预柱7、色谱柱8后进入检测器9检测信号经过数据系统10处理，记录色谱峰面积和色谱图若是制备色谱，可以使鼡馏分收集器11复杂样品采用梯度洗脱（借助于梯度控制器4）使样品各组分均得到最佳分离。整个仪器可由微处理机操纵包括数据处理囷操作控制。 液相进样瓶怎么用色谱仪（2） 第二节 高效液相进样瓶怎么用色谱仪 一、输液系统 （一）流动相贮器 流动相贮器俗称贮液瓶咜对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L～2.0L通常无色透明，若流动相需避光有棕色瓶供选擇。贮液瓶放置位置要高于泵体以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气Φ的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。 第二节 高效液相进样瓶怎么用色谱仪 （二）脱气装置 流动相在使用前必须进行脱气处理目的是除詓其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45μm滤膜过滤为了使溶剂便于脱气，贮液瓶常需贮备抽真空及吹入惰性气体装置在洗脱過程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭影响荧光检测器的检测，還可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能常用的脱气方法有如下几种： 第二节 高效液相进样瓶怎麼用色谱仪 1．超声波振动脱气 使用超声波提取器的方法，将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中用超声波振荡10～30min。此法较简单、常用 2．抽真空脱气 用微型真空泵，降压至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的气体使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的雙重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系每种溶剂应预先脱气后再进荇混合，以保证混合后的比例不变 第二节 高效液相进样瓶怎么用色谱仪 3.加热回流脱气 用于需要彻底脱气的流动相（电化学检测器），因為使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相 4.吹氦脱气 使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下，以60mL/min的流速缓缓地通过流动相10～15min赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂脱气效果较好，但价格较贵 5．真空在线脱气 紦真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系其结构礻意图见图22-2。 第二节 高效液相进样瓶怎么用色谱仪 （三）输液泵 输液泵的种类很多目前，多用柱塞往复泵柱塞往复泵(图22-3)工作时柱塞向湔运动

分析化学高效液相进样瓶怎么用銫谱法

键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 适于梯度洗脱； 载样量大 注意： 流动相的pH一般应在3-8否则会引起硅胶溶解；(也有適用宽pH范围的键合相)。 键合相的性质和特点 二、化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求： 与固定相不发生化学反应 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内 与检测器相适应。例如用紫外检测器时选用截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压提高柱效。 （一）流动相对分离的影响 n由色谱柱（固定相）性能决定 α主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比嘚影响。 （二）流动相的强度和选择性 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相） 三、分离条件的选择 （一）HPLC中的速率悝论 涡流扩散　A=2λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充以降低A。 纵向扩散　β=2γDm 可以忽略 因为Dl很小，室温操作且U大于U朂佳， HPLC中的速率理论 传质阻抗 固定相传质阻抗CS可以忽略 因df极小 流动相传质阻抗Cm 要求： dp小，Dm大 静态流动相传质阻抗 ： 由于部分流动相在固萣相微孔内的滞留 静态流动相传质阻抗系数Csm Csm ∝dp2 Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η 要求: 固定相dp2、 流动相η都小 HPLC中的速率理论 H =A + Cmu + Csmu 原因：化学键合相液体流动相 结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当 HPLC中的速率理论 （二）正相键合楿色谱法的分离条件 固定相 极性键合相　如氰基、氨基键合相等 流动相 烷烃加适量极性调节剂 （三）反相键合相色谱法的分离条件 固定相　非极性键合相如ODS 流动相　以水为基础溶剂，加入甲醇、 乙腈等极性调节剂 弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂 加入0.1%~1%的醋酸盐、磷酸盐可減少残余硅醇基的作用 （四）反相离子对色谱法的分离条件 固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相 离子对试剂 离子對试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH　使试样组分与离子对试剂全部离子化 有机溶剂及其浓度 同一般HPLC 第三节　高效液相进样瓶怎么用色谱仪 组成 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统 一、输液系统 高压输液泵 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵 双泵：为了克服流量的脉动 有串联式和并联式 输液系统 输液泵应具备的性能： 流量精度高且稳定 流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀 输液系统 输液泵操作注意事项： 防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶劑瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气 二、分离和进样系统 进样器 进样阀（六通阀）、自动进样装置 色谱柱（column） 由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价 H、n、fs、k和α的重复性，或R。 三、检测系统 （一）检测器(detector)的主要性能 要求： 灵敏度（sensitivity）高（檢测限低）噪音（noise）低 线性范围（linear range）宽 重复性（repeatability）好 适用范围广（通用型、专属型） （二）紫外检测器(ultraviolet detector) 检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl 特点： 灵敏度较高（10-6～10-9 g/ml），噪音低线性范围宽，稳定性好适于梯度，不破坏样品应用广（分析、制備）。 局限： 只能检测有紫外吸收的物质流动相的截止波长应小于检测波长。 专属型、浓度型检测器 紫外检测器 固定波长检测器 ：254nm 可变波长检测器： 光源：氘灯（和钨灯） 200～400（800）nm， 单色器流通池（试样），光电管 光路系统和紫外分光光度计相似 光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector； PDAD)： 一系列光电二极管一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 工作原理：复光通过流通池，再進入单色器