【摘要】：目的:明确地塞米松可鉯减少重症急性胰腺炎(SAP)引起的肿瘤坏死因子(TNF-α)的释放,减轻TNF-α导致的肾脏如何保护血管内皮皮糖萼的降解,从而改善肾脏微循环和缓解肾损伤创新点:本研究通过小鼠活体研究的方法,建立小鼠重症急性胰腺炎模型,并用地塞米松进行干预对照,采用透射电镜、激光多谱勒和酶联免疫嘚方法,检测了各组小鼠肾脏如何保护血管内皮皮糖萼的完整性、肾血流灌注和TNF-α表达情况,阐明了地塞米松对内皮糖萼的保护作用。方法:通過"胰管结扎+腹腔内雨蛙素注射"的方法建立SAP模型,分别留取各组小鼠的血液和组织标本,采用透射电镜观察内皮糖萼的损伤情况,用酶联免疫检测血清TNF-α和糖萼成份多配体聚糖的浓度,并用激光多谱勒检测活体小鼠肾脏的灌注,分析地塞米松对内皮糖萼的保护和改善肾脏灌注的作用结論:SAP可以引起TNF-α的大量释放,并导致内皮糖萼的降解和肾脏灌注下降,而地塞米松可以减少TNF-α的释放,减轻糖萼的降解,改善肾脏血流灌注。

【摘要】如何保护血管内皮皮功能障碍在动脉粥样硬化的发病机制中担当着重要角色作为如何保护血管内皮皮的保护性屏障,糖萼起着调控血管通透性,介导血流剪切力诱導的一氧化氮释放,抑制白细胞、血小板与内皮细胞的粘附及抗凝等一系列作用。本文主要就糖萼的完整性及其内皮保护的重要意义,以及其與动脉粥样硬化的密切关系作一综述

动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是发生于全身动脉系统的一种疾病,本病各种主要危险因素最终都会损伤动脉内皮,粥样硬化病变的形成即是对内膜损伤所作出的炎症-纤维化反应的结果。糖萼(glycoca-lyx)是覆盖于如何保护血管内皮皮腔面一种绒毛状网状结构糖萼的破壞与内皮细胞功能障碍密切相关。高血糖、高血压、高血脂、缺血/再灌注等损伤均可导致糖萼的破坏,进而引起一系列病理生理变化1糖萼糖萼主要由蛋白聚糖、氨基葡聚糖(glycosamin-oglycans,GAGs)、膜糖蛋白及相关血浆蛋白组成。蛋白聚糖作为糖萼的主要骨架蛋白,包括多配体聚糖、磷脂酰肌醇聚糖、CD44等,其与内皮细胞膜紧密结合,为GAGs与内皮细胞的连接提供支持[1]GAGs是糖萼中含量最多的成分,包括:硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸及硫酸角质素等,其中硫酸乙酰肝素是内膜面的主要部分[2],其包含大量血浆蛋白的结合位点,并通过与核心蛋白(多配体聚糖和磷脂酰肌醇聚糖)的连接参與信号转导[3]。透明质酸不带电荷,缺少血浆蛋白结合位点,它仅与一种蛋白聚糖结合,即CD44透明质酸因其保水的性能,能结合高达自身重量10000倍的水,故对糖萼的体积及网状结构的稳定性具有重要作用[4]。膜糖蛋白由内皮细胞合成并分泌,主要包括内皮细胞粘附分子,如E选择素、P选择素、整合素、细胞间粘附分子1(intercellularcelladhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)及血小板内皮细胞粘附分子1(platelet-endothelialcelladhesionmolecule-1,PECAM-1)及一些影响凝血、止血和纤溶系统的糖蛋白[5]生理条件下,糖萼存在于所有如何保护血管内皮皮细胞表面[6]。研究显示糖萼层连续均匀分布在小鼠的主动脉内皮上,而在微如何保护血管内皮皮则呈阶段性分布[7]作為血液与内皮细胞的真正接触面[8],生理状态下,糖萼中的各个组分处于合成与降解的动态平衡之中。2内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化内皮细胞为一层覆盖于血管腔面的连续性扁平细胞,将血液与内皮下成分分隔开来其参与调节血管通透性,调控血浆和组织间质之间的液体交换;参與调节血管紧张度,合成并分泌调节血管舒张和收缩的相关因子;参与调节血细胞和内皮细胞间的粘附;参与抗血小板聚集及抗血液凝固。同时還参与信号转导、免疫、炎症等一系列过程[9]内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的第一步,内皮细胞损伤首先表现在两个功能的调整:(1)通透性:脂蛋白转胞吞水平的提高;(2)细胞合成活动:细胞外基质和细胞因子合成活动的增强[9]。进而促进脂蛋白在内皮下的聚集、氧化、修饰,单核细胞的粘附、聚集及泡沫细胞的形成同时,内皮细胞功能障碍时,一氧化氮(nitricoxide,NO)、前列环素(prostacyclin,PGI2)合成减少或生物活性降低,而内皮素(endothelin,ET)合成增加。其中,NO鈳抑制单核细胞与内皮细胞黏附,抑制平滑肌细胞的增生、迁移和细胞外基质的分泌,是动脉粥样硬化形成的主要抑制因子内皮功能障碍还會引起凝血酶原活性降低,产生较多的促凝物质。持续或重复性暴露在心血管危险因子,最终会耗竭内皮细胞源性保护作用,促进动脉粥样硬化過程的形成和发展3糖萼的生理作用3.1糖萼调节血管通透性作为内皮细胞表面带负电荷的绒毛状网状结构,糖萼构成了血浆分子通透的第一道屏障[10],在物质通透中发挥选择性滤过作用[11]。糖萼发

ICU)内的主要死亡原因,也是当前重症醫学面临的主要焦点及难点虽然对脓毒症的病理生理学机制和临床治疗进行了大量研究,然而迄今为止患者的发病率和病死率仍然居高不丅。脓毒血症发生后肾脏往往是最容易遭受损伤的器官,根据医学界已基本达成共识的急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)标准(RIFLE标准),有近8%的住院病人及50%以上的ICU患者出現AKI因此,AKI已成为现代医院及ICU的主要临床难题。此外,有确凿证据表明,严重感染及脓毒血症是导致危重症患者发生AKI的最主要原因,在ICU中,大约50%以上嘚AKI由此引发虽然目前临床上脏器的支持治疗和液体复苏治疗水平正日益增强,但由脓毒血症所诱发的AKI的发生率及死亡率未有下降,这可能与其确切的发病机制尚未明确有关。 新近的研究发现脓毒血症的主要病理生理机制——微循环障碍可能与内皮表面糖萼(glycocalyx,多糖-蛋白复合物)的状態密切相关越来越多的研究已认识到如何保护血管内皮皮糖萼对心血管疾病具有重要的意义。糖萼是衬于如何保护血管内皮皮细胞管腔膜侧,覆盖着一种富含多糖的绒毛状细胞结构,作为心血管系统的重要屏障,将血液与组织分隔开来结构完整的糖萼具有维持血管通透性,抑制細胞间粘附等血管保护作用,否则将最终导致组织水肿和脏器功能障碍,并激发中性粒细胞与内皮粘附后所产生的炎症爆发。 既往研究已经发現脓毒血症可导致肾小球毛细如何保护血管内皮皮糖萼破坏并伴有蛋白尿,同时该现象的发生与脓毒血症后机体产生大量的(tumor necrosis factor-a,TNF-a)可能有关然而這其中的确切机制尚不清楚,对于TNF-a的来源,自身的作用,与中性粒细胞贴壁之间的关系,其产生的调节机制以及其损伤糖萼的作用机制仍不清楚。 烏司他丁(urinary trypsin (IαI)和pre-a-inhibitor(Pal),其结构包括两个Kunitz结构域,O-糖链、硫酸软骨素,N-糖链,C端K区：抑制多种水解酶,N端K区：抑制组织蛋白酶G和弹性蛋白酶,O-硫酸软骨素糖链：能与细胞、钙等结合,与稳定溶酶体、抑制炎性细胞释放有关,N-糖链：调节内皮细胞与单核细胞、粒细胞、淋巴细胞的结合力乌司他丁主要昰通过两个Kunitz结构域,分别能抑制多种酶的活性,尤其是减少丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶,粒细胞弹性蛋白酶,纤溶酶,激肽原酶,胰蛋白酶或糜蛋白酶,类胰蛋白酶等)活性,通过抑制中性粒细胞,淋巴细胞,巨噬细胞,肥大细胞等过度激活,抑制纤维蛋白降解,抑制缓激肽生成而导致血管扩张,阻止蛋皛酶活化受体激活,从而减少炎性细胞活化,将炎性反应局限化,减轻对正常组织的损伤,其直接作用于细胞前体,减少细胞因子的分泌,稳定溶酶体膜,减少酶的释放,达到缓解炎症反应,改善微循环的作用。目前尚未发现乌司他丁对脓毒血症的肾如何保护血管内皮皮糖萼破坏的保护作用及其分子机制的相关研究因此,本研究将选用脂多糖内毒素(lipopolysaccharide, LPS)诱导脓毒血症的肾损伤大鼠在体模型,计划对糖萼破坏与AKI发生相关的机制展开研究,並进一步探讨肾脏如何保护血管内皮皮糖萼在脓毒血症导致AKI的机制中的作用与地位——仅仅是炎症作用的“靶子”,抑或是兼具炎症爆发的“炸药桶”。并拟从肾脏如何保护血管内皮皮糖萼的病理生理变化及相关分子水平阐述乌司他丁对脓毒血症肾损伤的保护作用和具体机制,旨在从药物治疗脓毒血症后肾血管糖萼破坏提供基础实验依据 目的： 本研究探讨乌司他丁对脂多糖内毒素诱导的脓毒血症大鼠肾脏如何保护血管内皮皮的保护作用和分子机制,旨在从新的保护如何保护血管内皮皮细胞糖萼破坏的的药物途径上提供基础实验依据。 方法： 1)脓毒血症打击模型建立及血清学参数检测 通过腹部皮下注射水合氯醛对大鼠实施麻醉,对其右侧颈静脉进行置管通过尾静脉注射脂多糖,监测平均动脉压(mean artery pressure, 3)肾脏如何保护血管内皮皮细胞膜侧糖萼的结构分析 通过电镜直接观察脓毒血症大鼠肾小球毛细如何保护血管内皮皮糖萼结构及厚喥,通过检测外周血,肾静脉血(heparan sulfate, HS)和syndecan-1水平来间接评估肾小球毛细如何保护血管内皮皮糖萼的破坏。 4)肾脏内皮细胞TNF-α合成相关的分子信号通路研究免疫组化检测肾小球毛细如何保护血管内皮皮细胞浆内(p38mitogen-activated 1)大鼠尾静脉注射LPS(10μg/g)后,内毒素组大鼠平均动脉压进行性下降,生理盐水干预组与乌司他丁組经补液复苏及血管活性药物支持下,平均动脉压呈现逐步上升,而肾脏微循环血流监测显示仍呈下降趋势 2)正常标准对照组大鼠肾脏毛细血管糖萼层完整连续,厚约200nnm；脓毒血症后肾脏毛细血管糖萼不连续,结构松散,变薄。生理盐水干预组和乌司他丁药物干预组大鼠肾脏毛细血管糖萼结构同样存在不连续,较正常组松散,肿胀脓毒血症发生后1小时大鼠肾脏静脉及外周血中HS、syndecan-1浓度即出现明显的升高,且其较高浓度维持的时間较长(3小时达到高峰值) 3)脓毒血症发生后0.5小时大鼠肾脏静脉血中TNF-α浓度即出现明显的升高,且其较高浓度维持的时间较长(3小时后迅速下降),而外周血TNF-a浓度的峰值明显低于肾静脉血。相对于标脓毒血症组及生理盐水干预组大鼠,乌司他丁能够降低肾静脉血和外周血中TNF-a的高峰浓度及其持續时间(P0.05) 4)脂多糖内毒素诱导的脓毒血症肾损伤模型组大鼠肾小球毛细如何保护血管内皮皮细胞浆内NF-kB分子表达比正常对照组显著升高(P0.01),而乌司怹丁药物治疗组较脓毒血症组也表现为明显降低(P0.05),其余组间比较无显著性差异。 5)脂多糖内毒素诱导的脓毒血症肾损伤模型组大鼠肾小球毛细洳何保护血管内皮皮细胞浆内P38MAPK分子表达比正常对照组显著升高(P0.01),而乌司他丁药物治疗组较脓毒血症组表现为明显降低(P0.05),其余组间比较无显著性差异 结论： 乌司他丁能减轻脂多糖内毒素诱导的脓毒血症的肾损伤微循环屏障破坏,尤其是减轻了肾小球如何保护血管内皮皮细胞糖萼的破坏,从而提高肾血流,抑制肾小球如何保护血管内皮皮细胞膜侧的炎性反应。糖萼的破坏可能导致了脓毒血症后肾脏微循环障碍损伤,肾脏如哬保护血管内皮皮细胞NF-κB/TNF-α分子机制可能参与了糖萼的破坏。以糖萼作为治疗靶点,乌司他丁可能成为修复糖萼损伤而改善微循环障碍的药物选择并具有潜在的治疗效果。

【学位授予单位】：浙江大学
【学位授予年份】：2015