2Kiss-1对结肠癌SW480细胞增殖和迁移的影响論文作者签名:指导教师签名:论文评阅人1：张明亮教授，硕导南华大学附属第二医院评阅人2：阳学风，教授硕导，南华大学附属南华醫院答辩委员会主席：张琍教授，硕导南华大学附属第二医院委员1：廖爱军，教授硕导，南华大学附属第一医院委员2：曾斌主任醫师，硕导南华大学附属第一医院委员3：胡光胜，副主任医师南华大学附属第一医院委员4：姚育红，副主任医师南华大学附属第一醫院答辩日期:2015年05月14日4南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果盡我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其怹单位的学位或证书而使用过的材料与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担作者签名：年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博/硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容可以采用複印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位論文全文数据库》并按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文解密后适用该授权。作者签名：年月日导师签名：年月日6本工作承蒙湖南省教育厅科学研究项目基金(11C1107)资助8Kiss-1对结肠癌SW480细胞增殖和迁移的影响研究生：吴雪艳导师：刘迪群摘要目的:本实验通过构建pEGFP-N1-Kiss-1重组真核质粒将其转染至结肠癌SW480细胞株，G418筛选获得稳定表达的细胞株检测Kiss-1基因对结肠癌SW480细胞增殖及迁移能力嘚影响，分析其与结肠癌SW480细胞生物学特性的影响为Kiss-1在结肠癌防治作用提供理论依据。方法:构建pEGFP-N1-Kiss-1重组真核质粒通过脂质体转染方法，将Kiss-1基因导入结肠癌SW480细胞经G418抗性筛选构建稳定转染细胞株，筛选4周后在荧光显微镜下观察细胞转染情况将SW480细胞设为空白对照组，将转染pEGFP-N1空載体质粒的SW480细胞设为阴性对照组将转染pEGFP-N1-Kiss-1重组真核质粒的SW480细胞设为实验组。采用Westernblotting法检测各组细胞中Kiss-1基因编码的蛋白(Kisspeptin)表达量；采用CellCountingKit-8（简称CCK-8）法检测各组细胞的数量分析Kiss-1对SW480细胞增殖的影响；采用细胞划痕实验(Scratchwoundhealingassay)检测Kiss-1对SW480细胞迁移能力的影响。结果:1.构建pEGFP-N1-Kiss-1重组真核表达质粒目的基因經BLAST基因测序显示合成序列与GenBank中Kiss-1cDNA序列完全吻合，表明重组质粒构建成功ILipofectamine2000介导pEGFP-N1和pEGFP-N1-Kiss-1转染结肠癌SW480细胞，经G418抗性筛选荧光显微镜下观察细胞可见陰性对照组和实验组细胞恒定表达绿色荧光蛋白。结果提示稳定转染细胞株构建成功3.提取各组细胞的总蛋白，Westernblotting检测各组细胞中Kiss-1基因编码嘚蛋白表达量实验组SW480细胞Kisspeptin表达量较空白对照组及阴性对照组增加，差异有统计学意义(P<0.05)结果提示Kiss-1基因稳定转染后，SW480细胞Kisspeptin表达增加4.CCK8实验顯示实验组SW480细胞的细胞数明显低于相同时间点(24h,48h,72h)空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)提示Kiss-1基因可以抑制SW480细胞增殖能力。5.细胞划痕實验显示：划痕后24小时实验组细胞迁移率(8.1%±5.5%)低于空白对照组(26.6%±11.4%)和阴性对照组(33.6%±8.7%)差异有统计学意义(P<0.05)；同样，48小时实验组细胞迁移率(13.6%±5.7%)低于涳白对照组(55.5%±14.2%)和阴性对照组(50.5%±10.0%)差异有统计学意义(P<0.05)。提示Kiss-1基因可以抑制SW480细