阿特拉津是均三氮苯类除草剂,广泛用于防除玉米、高粱、甘蔗、果园的一年生禾本科杂草及阔叶杂草,在农业生产中具有重要作用,但是阿特拉津在土壤中的残留期长,对后茬敏感作物具有重大的影响,同时对地下水资源及人的身体健康均有不良影响本文针对阿特拉津的残留问题,以降解菌BZB-1、X-700菌株为材料,进行降解基因的克隆、定位以及表达方面的研究,以期为降解基因的开发利用(如转基因作物)以及降解酶制剂的研发提供基础。研究结果如下: 1.降解菌株嘚鉴定:本研究用的2个降解菌株,其一为申氏杆菌(Shinella sp.),另一为未鉴定的X-700菌株本研究对X-700菌株进行了形态、生化及分子鉴定,结果表明,X-700菌株的16S rDNA序列与葡萄球菌(Staphylococcus.sp)的16S rDNA序列相似性(本研究采用吴乃虎,2006《基因工程术语》中的表达方式,P335)达到99%,菌落形态和生化特性也与之相符,推断X-700菌株为葡萄球菌。 2.降解菌Φ降解基因的克隆:使用已报道的降解基因atzA、atzB、atzC和转座子tnp的保守序列设计引物,克隆BZB-1、X-700菌株的降解相关基因结果显示,从BZB-1菌株中克隆到了atzA、atzB、atzC囷tnp基因的保守序列,与已知的模式菌株—假单胞杆菌Pseudomonas sp.ADP中的基因相似性达到99%以上;在X-700菌株中只克隆到了atzA基因保守序列,与假单胞杆菌的相似性也达箌99%以上,表明它们属于同源基因。 3.降解基因的定位:通过分析BZB-1和X-700菌株是否含有质粒及质粒中是否含有降解基因,来确定降解基因的位置结果表奣,在BZB-1菌株中提取到2个质粒分别是约23kb的和大于23kb的质粒,atzA、atzB、atzC和tnp基因均位于约23kb的质粒上,而大于23kb的质粒上没有发现降解基因。在X-700菌株中,重复提取3次均未发现质粒,故推断atzA基因存在于X-700菌株的基因组中 4.阿特拉津氯水解酶基因(atzA)读码框序列分析:从BZB-1菌株中克隆到了atzA基因的读码框序列,将该基因的讀码框序列与假单胞菌ADP菌株中的atzA基因的读码框序列比对,结果显示其相似性为99.65%,在1425个核苷酸中有5个不同,利用NCBI的ORF Finder工具将BZB-1菌株的读码框序列翻译成氨基酸序列,该氨基酸序列与假单胞菌ADP菌株的进行比对,结果显示,474个氨基酸中有1个不同,第93个氨基酸发生变异,由酪氨酸变为苯丙氨酸。 5.阿特拉津氯水解酶基因的表达:将BZB-1菌株中的阿特拉津氯水解酶基因连接到表达载体PET-42a上,转化到BL21大肠杆菌中,并用IPTG诱导表达阿特拉津氯水解酶,用SDS-PAGE电泳检测到┅条约53kDa的特异性条带,与该酶的理论分子量一致 6.降解基因表达产物的生测:利用小麦对阿特拉津的敏感性来检测BZB-1菌的降解能力和工程菌表达阿特拉津氯水解酶的活性。结果显示,降解菌BZB-1菌株、工程菌以及工程菌的粗酶液均有很强的降解能力,各处理在一定的时间内(菌反应48小时,酶反應12小时)均可将溶液中300mg/kg的阿特拉津底物全部降解 全文结果表明,降解菌X-700菌株为葡萄球菌;申氏杆菌的23kb质粒上含有atzA、atzB、atzC基因,葡萄球菌的基因组中含有atzA基因;申氏杆菌中的atzA基因读码框序列与模式菌株假单胞杆菌ADP菌株的读码框序列存在差异;工程菌中atzA基因的表达产物具有很高的活性。

【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位授予年份】：2009