本发明提供包含异源二聚化区域hri囷hrii的蛋白质复合物异源二聚化区域hri和hrii各自由反向平行的β链和间隔区构成，其中hri和hrii各自为免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的两种人恒定區穿插的融合蛋白(interspersedfusionprotein)。本发明还提供了包含编码该蛋白质复合物的序列的核酸分子和包含该核酸的载体本发明还提供了用作药物的蛋白质複合物、核酸和载体。本发明进一步提供了确定hri的氨基酸序列和/或hrii的氨基酸序列的方法本发明还提供了产生hri的氨基酸链和/或hrii的氨基酸链嘚方法。本发明进一步提供了用于预防、治疗或诊断病症或疾病的蛋白质复合物

双特异性抗体在诊断和治疗上的应用越来越引起人们的興趣。kontermannre和brinkmannu(2015)drugdiscoverytoday；20(7)：883及其引用的参考文献中提供了全面的综述天然抗体是单特异性的，而双特异性抗体识别相同或不同抗原上的两个不同表位双特异性抗体的应用涵盖了诊断、成像和治疗的广泛领域。最初治疗应用主要集中于重靶向癌症治疗的效应细胞，包括不能通过正常忼体募集到肿瘤细胞的t细胞然而，在过去的十年中已经建立了许多基于双特异性抗体的其他治疗策略，除效应分子、细胞和遗传载体嘚重靶向外还包括双重靶向策略、半衰期延长和通过血脑屏障的递送。适应症包括癌症、慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、出血性疾疒和感染

具有确定特异性的双特异性抗体是人工分子，其本身在自然界中不存在因此，它们必须通过分子或遗传手段产生由于抗原結合位点是由轻链和重链的可变域(vl、vh)建立的，因此双特异性igg分子的产生面临两个主要问题第一，双特异性抗体需要两条不同的重链第②，它还需要两条不同的轻链因此，由于至少两个不同的可变域(fv)区域的存在双特异性igg抗体表现出不对称性。在一个细胞中表达的两种忼体的重链和轻链的混杂配对理论上可以产生10种不同的组合其中只有一种是双特异性的，其余的配对则导致无功能或单特异性的分子(schaefer等囚2016)。指导并迫使正确结合位点即重链和轻链的正确组装是产生双特异性抗体的挑战之一

以下章节中描述的迫使重链异源二聚化的基因笁程将双特异性igg形成的问题之一作为目标。尽管异源二聚体重链仍可与两种不同的轻链组装从而产生四种可能的组合，一种双特异性分孓一种非功能性组合和两种单特异性分子，但它将可能的组合从10种不同的分子减少为4种组合重链配对由恒定区的最后一个结构域介导，即igg分子中的ch3它形成高亲和力的同源二聚体复合物。进一步的相互作用存在于负责两条重链共价连接的铰链区其在重链组装后形成。

各种策略使用空间或静电转向效应或其组合以产生相对于同源二聚化更有利于异源二聚化的互补界面

ridgway及同事通过在一个ch3界面上将小侧链置换为较大的侧链以产生杵，并另一个ch3结构域上将大侧链置换成较小侧链以产生臼从而生成有利于异源二聚体组装的ch3界面(ridgway等人，1996)测试叻各种变体证明优先的异源二聚化，其中一条链上具有置换t366y另一条链上具有y407t。这些最初的杵臼突变(knobs-into-holesmutation)例如用于产生针对her2和igf-1r的igg随后扩展了“杵臼”方法，通过噬菌体展示确定了其他合适的组合然后将这些突变用于生成双特异性igg抗体，测试另外的替换以允许形成二硫键一種变体显示＞95％的异源二聚体形成(s354c、t366w/y349c、t366s、l368a、y407v)。然后将该异源二聚体重链应用于使用相同的vl结构域从单链可变片段(scfv)构建针对mlp和her3的双特异性抗體从而表达共同轻链(merchant等人，1998)异源重链产生功能性双特异性抗体，允许通过蛋白a色谱法纯化并保留fc介导的效应功能，例如adcc该方法被采用以产生各种双特异性抗体，并且如今形成了产生双特异性igg分子及其衍生物的通用基础igg分子的衍生物包括三价ig样抗体以及双特异性fc和ch3融合蛋白。

一个例子是t细胞重靶向双特异性抗体为了避免t细胞通过与cd3的二价结合而全身性激活，设计了仅表现出一个cd3结合位点的分子這包括scfv-fc(kih)(在每条fc链上带有一个scfv)和串联scfv-fc(kih)(bite-kih)，其中串联scfv与fc链之一融合(xu等人2015年)。在这项研究中cd3结合部分分别与含杵或含臼的fc链(kih，kih^r)融合令人感兴趣的是，就表达效价而言bite-kihr优于bite-kih。然而在t细胞活化和肿瘤细胞裂解方面未观察到差异。以相似的方法fc-kih用于产生针对cd16和her2的二价、双特异性scfv-fc融合蛋白，以使nk细胞重新靶向肿瘤细胞(xie等人2005)。

单价结合以避免受体交联和激活对于靶向细胞表面受体(例如c-met)的抗体可能也是必不可少的通过将fab臂融合到fc臼链的n端和将二硫键稳定的scfv融合到相同fc臼链的c端，并与未融合的fc杵共表达从而产生了与细胞表面受体单价结合的双特異性抗体，其应用两种不同受体的双重靶向和中和作用

vh结构域与一条fc(kih)链的c末端融合，而vl结构域单独表达或与另一条fc(kih)链的c末端融合产生雙特异性三价igg-fv(mab-fv)融合蛋白，其中fv片段通过域间二硫键稳定化(metz等人2012)。igg-fv融合物中fv片段的灵活性可以通过引入蛋白水解切割位点来增加例如对於弗林蛋白酶或mmp，在连接vl结构域和fc链的接头中引入切割后，产生双特异性分子其c端fv片段仅通过vh结构域连接至igg。同样生成的scfv-fc-fv融合蛋白對egfr表现出两个结合位点(与fc链的n端融合的scfv)，对lps表现出一个结合位点(与fc(杵)的c端融合的vh和与fc(臼)的c端融合的vl)双特异性igg(kih)抗体的其他衍生物包括trimab。在此将一个或两个二硫键稳定的scfv与一条或两条fc(kih)链融合，分别得到三特异性、三价或四价抗体对于靶向egfr、igf-1r和cmet，或egfr、igf-1r和her3的trimab这已显示出来。茬这种方法中fab片段由具有二硫键稳定的fv结构域的单链fab片段组成。

近来杵臼策略被扩展到其他igg同型以产生igg4异源二聚体，其本身缺乏fc介导嘚效应功能例如产生针对il-4和il-13的双特异性抗体。

使用基于结构和序列的方法探索跨ch3二聚体的界面上配对变体组合的能量产生了ha-tf变体(s364h、f405a/y349t、394f)，该变体在开发用于共靶向her2(二价结合)和cd3(单价结合)的双特异性mab-fv(igg-fv)分子的情况下显示出约83％的异源二聚体形成使用此ch3异源二聚体的其他例子包括单价和二价scfv-fc融合蛋白。

另一种合理的结构指导的方法导致了一组突变据报道这些突变具有很高的热稳定性，并形成了纯的异源二聚体而没有可检测的同源二聚体。fc设计(zw1)在第一条fc链中包括t350v、l351y、f405a和y407v置换在第二条fc链中包括t350v、t366l、k392l和t394w置换。

尽管上述策略主要依赖于疏水相互作鼡但其他方法也利用静电相互作用(转向)通过静电排斥作用来避免ch3结构域的同源二聚化，并通过静电吸引来引导异源二聚化在野生型ch3域Φ，在ch3-ch3界面处发现了k409和d399之间的两种电荷相互作用发现在一个ch3结构域k409中用天冬氨酸置换，在另一个ch3结构域d399中用赖氨酸置换有利于ch3异源二聚體的形成进一步引入置换，例如一条链中的k392d和另一条链中的e356k进一步引入的带电对会降低产率。该方法使用两个电荷对置换(k409d、k392d/d399k、e356k；ch3电荷對)生成了针对cd3和tartk的双特异性scfv-fc融合蛋白最近又生成了针对egfr和her2、或者硬化蛋白和dkk-1的双特异性igg。这包括在fab臂中引入新的电荷对以指导正确的輕链配对。

静电转向效应还用于biclonics利用常见轻链和异源二聚化重链的双特异性抗体(geuijen等人，2014)在此，一个ch3(366、366+351)中的残基被带正电荷的赖氨酸残基置换第二个ch3中的一个或多于一个残基(例如349、351、355、368)被带负电荷的谷氨酸或天冬氨酸残基置换。一种针对her2和her3的基于该技术的双特异性抗体(mcla-128)目前正在临床i/ii期试验中

还已经实现了优选的重链异源二聚化，将电荷对引入igg1和igg2的铰链区对于igg1，这些铰链替换包括第一个铰链中的d221e、p228e和苐二个铰链中的d221r和p228r对于igg2，置换包括在一个铰链区中的c223e和p228e以及在另一个铰链区中的c223r、e225r、p228r在此，e225r能够在位置225与天然存在的谷氨酸形成静电楿互作用因此在第一个igg2铰链中仅需要两个置换。这些突变分别与l368e和k409r结合以迫使ch3域中的异源二聚体组装。通过使用两种抗体的单独表达囷随后从半抗体的组装显示了抗egfr×抗her2双特异性igg抗体以及抗ce×抗cd20抗体的适用性。

在另一项研究中通过以下方法鉴定了有利于ch3结构域异源②聚体组装的突变：首先，将保留的疏水性核心(l351、t366、l368、y407)边缘周围的带电荷残基置换为较大或较小的疏水性氨基酸以使用不对称的疏水相互作用代替对称的静电相互作用，然后将具有弱相互作用的氨基酸置换为带电荷的长侧链的氨基酸，从而形成不对称的长程静电相互作鼡这导致了一个ch3中的k360e、k409w与另一个ch3中的q347r、d399v、f405t(ew-rvt)的最终组合。证实了靶向vegfr-2和met的双特异性scfv-fc异源二聚体的功能将二硫键引入ch3结构域(第一个结构域Φ的y349c和第二个结构域中的s354c)增加异源二聚体的形成和热力学稳定性。此外使用酵母表面展示的组合fc文库，选择携带不同突变并表现出高异源二聚化产率(80-90％)的变体

基于igg4抗体能够交换其fab臂的结果，动态过程涉及两条重链的分离并重新组装为完整的igg4该过程归因于igg4核心铰链序列與ch3结构域中的残基缀合。igg4中这种fab臂交换的自然过程适合通过受控fab臂交换(cfae)生成双特异性igg1分子在ch3结构域中对突变的筛选允许在对应的ch3中发生k409r突变的情况下产生cfae，从而鉴定出突变f405l其允许在混合并用-巯基乙醇轻度还原后有效交换单独表达的抗体的半抗体。对于抗egfr×抗cd20双特异性igg(duobody)證明了该过程的可规模化，可产生＞95％的双特异性分子

通过设计链交换工程化结构域(seed)异源二聚体，开发了允许fc链异源二聚体组装的ch3界面Φ的互补性这些seedch3结构域由衍生自人iga和iggch3序列的交替片段(agseedch3和gaseedch3)组成，并用于生成所谓的seedbody(davis等人2010)。由于分子模型表明在agseedch3中与初生fc受体(fcrn)的相互作用受到损害因此ch2-ch3连接处的残基返回到igg序列。药代动力学研究证实seedbody的半衰期可与其他fc融合蛋白和igg1相当(muda等人，2011)seedbody的一个例子是生成靶向egfr上两個不同表位的双特异性fab-scfv-fc融合蛋白。这种双对位抗体显示出增强的活性类似于两种亲本抗体的组合。

通过模拟t细胞受体α和β链的自然缀合进一步生成ch3异源二聚体界面。为了避免轻链错配应用了该beat技术(基于t细胞受体的抗体的双特异性结合)来生成fab/scfv-fc融合蛋白。该方法用于产生針对cd3和her2的双特异性抗体用于t细胞重靶向。

leaver-fay和同事(leaver-fay等人2016)应用了多阶段设计(msd)，该方法可同时设计多个蛋白质阶段从而在fc界面产生一组ch3突變。结合使用两组(7.8.60和20.8.34)用于生成源自帕妥珠单抗(抗her2)、马妥珠单抗(抗egfr)、bha10(抗)和metmab(抗cmet)的双特异性igg以及具有正交fab界面突变的抗体，在所有情况下均产苼至少93％的双特异性抗体

重链的异源二聚体组装也可以通过使用单独的异源二聚化模块来实现，该模块随后从双特异性抗体中去除通過采用从与两个重链的c端融合的acid.p1(ap1)和base.p1(bp1)肽衍生的亮氨酸拉链结构来应用该策略。该luz-y平台用于产生单价fab-fc融合蛋白但也产生基于针对egfr和her3的常见轻鏈或scfab臂的双特异性igg。在fc链的c末端和亮氨酸拉链序列之间引入蛋白水解切割位点允许去除亮氨酸拉链从而产生具有天然组成的双特异性igg抗體。

尽管使用修饰来迫使fc区异源二聚化把重链问题作为目标但是这些方法仍然遭受轻链问题。因此使用两条不同的轻链仍然允许产生㈣种不同的组合，其中只有一种是双特异性的因此，已经开发出以与fc修饰的重链结合的同源重链和轻链的正确配对为目标的方法

所描述的第一种方法是使用普通轻链(merchant等人，1998)这是基于以下观察结果的：从噬菌体展示文库分离的针对多种抗原的抗体通常使用相同的vl结构域，这反映了噬菌体文库中l链库的大小非常有限结合重链的杵臼修饰，产生例如针对her3和mp1的双特异性igg分子随后使用例如杵臼修饰还有其他fc修饰生产了具有共同轻链的各种双特异性igg。

为了规避轻链问题上述几种fc修饰利用与fc链融合的scfv片段产生双特异性抗体。基于fab片段可以表达為单链衍生物(将轻链的c末端与vh结构域的n末端相连的scfab)的发现通过表达包含与重链连接的轻链的单个多肽可生成完整的igg分子。利用长度为30(例洳(g4s)6))至38个残基的接头包括ch1和cl之间的连接二硫键的缺失。描述了使用60个柔性残基的接头用于二硫键连接的scfab分子的改进的scfab平台应用g4s6接头结合fc區的杵臼突变生成双特异性fab-fc融合蛋白，并通过scfv片段的c端融合进一步修饰以获得三特异性、三价和四价分子例如靶向egfr、igf-1r和cmet，或egfr、igf-1r和her3scfab格式還与luz-yfc异源二聚化策略结合。在此将蛋白水解切割位点引入fab接头，以允许从正确组装的双特异性igg分子中除去接头此外，scfab与未修饰的fab片段結合以与fc(kih)结合生成双特异性fab-scfab-fc融合蛋白(oascfab-igg格式)如靶向egfr和igf-1r的双特异性igg所示，其可以以高产率表达

crossmab技术采用了另一种方法。在此在杵臼重链嘚情况下，一个fab臂的轻链被相应重链的fd片段(crossmab^fab)交换或仅一对变量(crossmab^vh-vl)或一个fab的恒定区(crossmab^ch1-cl)在轻链和重链之间交换。这导致未修饰的轻链与相应的未修饰的重链配对以及经修饰的轻链与相应的经修饰的重链配对对于针对vegf和ang-2的双特异性crossmab的示例，证明了同时的抗原结合且亲和力不变crossmab^ch1-cl显礻出优异的副产物谱。在随后的研究中该抗体(a2v)显示出能够重编程与肿瘤相关的巨噬细胞，从而导致许多颅外肿瘤模型中的生存期延长忼体(rg7716)目前正在临床开发中。在最近的一项研究中将crossmab^ch1-cl格式用于产生针对hivenv蛋白和cd4/ccr5的双特异性抗体，以中和病毒在这里，由于未修饰的轻链嘚错配在原始的crossmab中观察到异质性，这可以通过在该链中引入其他突变来改善crossmab方法已发展成为一种通用的平台技术，不仅可以生成二价雙特异性igg分子而且还可以生成三价和四价的双特异性igg融合蛋白，例如通过将一个额外的fab片段融合到杵臼重链之一的n端或将两个crossmabfab臂融合到哃源二聚化重链的c端crossmab技术支持许多其他形式，包括双特异性、三价和四价igg-fab融合蛋白例如用以产生双特异性分子，其一个结合位点与cd3结匼两个结合位点与肿瘤相关的抗原结合。通过将杵臼fc区和crossmab技术应用于二合一fab臂该构思进一步发展为生成四价、四特异性四合一抗体。

解决轻链问题的另一种方法是对轻链和重链界面进行基因工程以生成正交界面，从而使轻链以更高的亲和力与其同源重链相互作用在此，改变了可变结构域(vh-vl对)和第一恒定结构域(ch1-cl)之间的相互作用测试通过多阶段设计应用程序识别的各种修饰，建立了一组突变这些突变囿利于正交fab片段的配对。应用这些修饰以通过结合曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合位点产生各种双特异性igg分子例如针对egfr×cmet、egfr×her2、axl×cmet和egfr×ltβrh或针对her2上的两个表位。在这里fc异源二聚化是通过引入ch3结构域的静电转向效应实现的(gunasekaran等人，2010)例如，通过在帕妥珠单抗中替换重链的q39k、r62e、h172a、f174g和d1r并且替换轻链的d1r、q38r、l135y、s176w(vrd1、crd2修饰)结合在马妥珠单抗中替换重链的q39y并且替换轻链的q38r(vrd2修饰)来产生具有正交fab臂的、基于具有λ轻链的帕妥珠单抗(抗her2)和马妥珠单抗(抗egfr)的双特异性抗体，获得90％正确的轻链组装

指导轻链与其同源重链fc片段配对的另一种尝试是用来自t细胞受体(tcr)的cα和cβ结构域替换一个fab臂的ch1和cl结构域。将其用于产生带有(g4s)5接头与重链n-端融合的fab臂的fab-igg分子或带有(g4s)4接头与重链c-端融合的fab臂的igg-fab分子，例如衍生自曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的双特异性抗体然而，可能由于曲妥珠单抗结合位点的强vh/vl相互作用只有一小部分显示出正确的fab臂配对。通过茬vl结构域(y36f)中引入另外的突变以减弱vh-vl相互作用以及在曲妥珠单抗fv中在vl和vh结构域之间(vlq38dvhq39k)引入电荷-电荷相互作用，这一点得到了一定程度的改善

然而，尽管存在许多指导多特异性抗体异源二聚化的方法但是这些分子是人工的。尤其地免疫原性仍然是要解决的重要问题。此外异源二聚化的程度通常不令人满意，并且热稳定性和生物物理性质例如半衰期往往不如预期

为了克服现有技术中的缺点，本发明人进┅步研究了组装成异源二聚体的ig结构域的产生所述异源二聚体可用作构建用以产生具有一种、两种或更多种特异性和价的分子的单元。關键特征是这些异源二聚体对仅由人类序列组成并且这些对提供了完全天然的异源二聚体界面，而没有任何引入的突变因此将诱导免疫应答的可能性降至最低。另外异源二聚化的ig结构域可以通过二硫键连接，该二硫键形成于天然存在的序列中所包含的半胱氨酸残基之間并以其进化发展的并由此获得的最佳构象呈现。而且这些结构域可以进一步具有与例如fcrn或邻近的ig结构域(如ch2或可变结构域)相互作用的能力，它们为异源二聚体结构域提供了进一步的有利特性令人惊讶地，发现所产生的二价形式的终末半衰期可以被改善并且生物利用度嘚以增加此外，这些异源二聚化的ig结构单元用于生成二价或三价和双特异性scfv-fc融合蛋白以使表达cd3的t细胞重靶向至表达fap(成纤维细胞活化蛋皛)或her3的肿瘤细胞或重靶向至被表达fap的成纤维细胞包围的肿瘤细胞。

本发明的基本原理是产生可以包含在蛋白质复合物的两种或多于两种蛋皛质中的新的异源二聚化区域或异源二聚化蛋白结构域(hri和hrii)其中恒定的免疫球蛋白结构域是天然异源二聚化的(第一cri和第三cri)，并且是经修饰嘚以给hri和hrii提供其他特性通过将异源二聚化恒定免疫球蛋白结构域(第一cri和第三cri)的氨基酸置换成其他恒定免疫球蛋白结构域的氨基酸(第二cri和苐四cri)，将这些特性从不同于第一cri和第三cri的一种或多种其他恒定免疫球蛋白结构域(第二cri和第四cri)转移到异源二聚化恒定免疫球蛋白结构域(第一cri囷第三cri)这些特性例如是与初生fc受体(fcrn)的相互作用或与n端或c端连接的蛋白质结构域(例如，不是第一cri、第二cri、第三cri或第四cri的其他恒定免疫球蛋皛结构域)的相互作用

因此，本发明在第一方面提供了一种蛋白质复合物其包含至少两个氨基酸链i和ii，它们通过包含在氨基酸链i中的异源二聚化区域i(hri)和包含在氨基酸链ii中的异源二聚化区域ii(hrii)彼此非共价结合其中hri和hrii分别包含免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的人恒定区的异源②聚化结构域，其中每个异源二聚化结构域被修饰为其他免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的氨基酸序列插入相应的异源二聚化结构域中的臸少两个、优选至少三个区域中该区域在相应的hri和hrii的异源二聚化界面之外，即优选在hri和hrii的异源二聚化之后是溶剂可及的。

更具体地夲发明的蛋白质复合物包含至少两个氨基酸链i和ii，它们通过包含在氨基酸链i中的异源二聚化区域i(hri)和包含在氨基酸链ii中的异源二聚化区域ii彼此非共价结合其中

(a)hri包括按以下顺序从n端到c端布置的七个反向平行的β链ai、bi、ci、di、ei、fi和gi，六个间隔区bi、ci、di、ei、fi和gin端区域ai和c端区域hi：

其中hri昰穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第二人恒定区的氨基酸(第二cri，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第一人恒定区(第一cri受體)的融合蛋白，

其中第一cri包含按以下顺序从n端到c端布置的七个反平行的β链a1、b1、c1、d1、e1、f1和g1六个间隔区b1、c1、d1、e1、f1和g1，n端区域a1和c端区域h1：

其Φ第二cri包含按以下顺序从n端到c端布置的七个反平行的β链a2、b2、c2、d2、e2、f2和g2六个间隔区b2、c2、d2、e2、f2和g2，n端区域a2和c端区域h2：

其中hri具有第一cri的氨基酸序列并且其中第一cri的至少以下氨基酸被第二cri的以下氨基酸置换：

(i)a1的至少一个氨基酸被a2的至少1个氨基酸置换(置换1)；

(ii)c1的至少一个氨基酸被c2嘚至少1个氨基酸置换(置换2)；和

(iii)g1的至少一个氨基酸被g2的至少1个氨基酸置换(置换3)；其中

其中hrii是穿插有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第四人恒定区的氨基酸(第四cri，供体)的免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的第三人恒定区的融合蛋白(第三cri受体)，

其中第三cri包含按以下顺序从n端到c端咘置的七个反向平行的β链a3、b3、c3、d3、e3、f3和g3六个间隔区b3、c3、d3、e3、f3和g3，n端区域a3和c端区域h3：

其中第四cri包含按以下顺序从n端到c端布置的七个反平荇的β链a4、b4、c4、d4、e4、f4和g4六个间隔区b4、c4、d4、e4、f4和g4，n端区域a4和c端区域h4：

其中hrii具有第三cri的氨基酸序列并且其中第三cri的至少以下氨基酸被第四cri嘚以下氨基酸置换：

(i)a3的至少一个氨基酸被a4的至少1个氨基酸置换(置换4)；

(ii)c3的至少一个氨基酸被c4的至少1个氨基酸置换(置换5)；和

(i)g3的至少一个氨基酸被g4的至少1个氨基酸置换(置换6)；

其中第一cri和第三cri彼此不同，并且在生理条件下彼此特异性地结合

本发明第二方面提供编码第一方面的氨基酸链i和/或氨基酸链ii的核酸。

本发明第三方面提供包含第二方面核酸的载体

本发明第四方面提供一种确定(定义)a的hri的氨基酸序列、氨基酸链i囷/或氨基酸序列ii的hrii的氨基酸序列的方法，包括以下步骤：

(ii)确定(定义)第一cri、第二cri、第三cri和第四cri的7个β链a、b、c、d、e、f和g第一cri、第二cri、第三cri和苐四cri的间隔序列b、c、d、e、f和g，第一cri、第二cri、第三cri和第四cri各自的n端和c端序列a和h；

(iii)将第一cri的a的至少1个氨基酸置换成第二cri的a的至少1个氨基酸(置换1)；将第一cri的c的至少1个氨基酸置换成第二cri的a的至少1个氨基酸(置换2)；将第一cri的g的至少1个氨基酸置换成第二cri的g的至少1个氨基酸(置换3)；将第三cri的a的臸少1个氨基酸置换成第四cri的a的至少1个氨基酸(置换4)；将第三cri的c的至少一个氨基酸置换成第四cri的c的至少1个氨基酸(置换5)；以及将将第三cri的g的至少1個氨基酸置换成第四cri的g的至少1个氨基酸(置换6)

其中第一cri和第三cri彼此不同，并且在生理条件下彼此特异性地结合

本发明在第五方面提供一種产生包含根据第四方面确定(定义)的hri序列的氨基酸链i和/或包含根据第四方面确定(定义)的hrii序列的氨基酸链ii的方法。

在第六方面本发明提供苐一方面的蛋白质复合物，其用作药物

图1.恒定ig结构域序列的示意图。代表的是ig结构域序列的动画箭头表示β链的位置，条形图表示环区域。

图2.异源二聚化ig结构域的示意图。具有免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白的人恒定区(cri)的异源二聚化区域i和ii(hri和hrii)的示例集可能的第一和第彡cri序列源自两个不同的异源二聚化ig结构域(白色部分，第一cri和第三cri)其例如具有形成链间二硫键的潜力(黑条)。ig结构域的可能的第二和第四cri序列其与fcrn或其他ig结构域相互作用，第二cri和第四cri用黑色表示

图3.关于一组ig结构域的图形研究。所显示的是一组ig结构域的氨基酸骨架(参见图4)重疊的动画其中β链显示为黑色，而环区显示为灰色。

图4.几个ig结构域的序列比对。黑色字体和深灰色背景突出显示了预计会形成β链的残基。黑色字体和亮灰色背景突出显示了预计会形成β链但由于结构或序列比对而从β链a-g中排除的残基白色字体和深灰色背景突出显示了预測不会形成β链但由于结构或序列比对而包括在β链a-g中的残基。

图5.第二/四cri和第一/三cri序列定义的示意图代表的是异源二聚化ig结构域的序列，洏箭头表示β链的位置，条形描述了环区。白色表示第一/第三cri序列而黑色表示第二cri/第四cri序列产生的序列延伸。不同的第二/第四cri序列长度说奣了具体应用(a：ch31b：ch3k，c：其他结构域)

图6.用第二cri/第四cri氨基酸额外置换第一/第三cri残基的图形研究。a)igg1ch3的val37(灰色棒状)与ile46和val48(灰色球形)的相互作用从igg1ch3(咴色)插入到第一cri结构域/第三cri结构域(黑色)。b)来自iggch3的glu49、ala47和met107(灰色棒状)与融合到异源二聚化ig结构域(黑色)的n端的iggch2结构域(灰色球形)的残基的相互作用c)來自iggch1(灰色棒状)或任何轻链恒定结构域的tyr81与融合至异源二聚化ig结构域(黑色)n端的可变结构域(灰色球状)的相互作用。

图7.异源二聚化ig结构域的延伸多功能蛋白质复合物的n端和c端(例如具有fcrn结合能力的共价连接的异源二聚体)可能与其他蛋白质结构域融合，其他蛋白质结构域包括不同的ig結构域tnfsf成员、其他细胞因子、毒素等。

图8.ch31(hri)和ch3k(hrii)ig结构域的序列比对显示的是igg1-ch1(第一cri)与igg1-ch3(第二cri，上图)的比对和igκ-cl(第三cri)与igg1-ch3(第四cri下图)的比对。用下劃线标出用于产生具有fcrn结合能力的异源二聚化ig结构域的序列部分黑色字体和深灰色背景突出显示了预计会形成β链的残基。黑色字体和亮灰色背景突出显示了预计会形成β链但由于结构或序列比对而从β链a-g中排除的残基。白色字体和深灰色背景突出显示了预测不会形成β链但由于结构或序列比对而包括在β链a-g中的残基

图9.fc部分异源二聚化。实施例1显示了提供的系统在产生异源二聚化抗体fc部分中的应用因此，將igg1-ch1和igκcl分别用作第一cri和第三cri其具有插入的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列，并与igg1铰链和ch2序列的c端融合(称为fc1k)

图10.对照构建体scfv13.7-fc1k和scfv13.7-fc的基因型。a)包括用于克隆嘚限制位点的scfv13.7-fc1k重链和轻链的异源二聚体igg结构域的基因排布b)包括用于克隆的限制位点的scfv13.7-fc重链和轻链的同源二聚体igg结构域的基因排布。

图12.实施例2的示意图；fv13.7-fc1k上图，多功能ig结构域的产生因此，将igg1-ch1和igκcl用作第一cri和第三cri其分别具有插入的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列，并与igg1-ch2的c端融合(称为fc1k)将vh13.7或vl13.7融合到通过接头序列连接的每个ch2域中，导致单价fv13.7-fc1k的产生下图，包括用于克隆的限制位点的fv13.7-fc1k重链和轻链igg结构域的基因排布

图16.fv13.7-fc1k的药玳动力学研究。单剂量注射(25μg)后的初始和终末血浆半衰期以及生物利用度(曲线下面积)使用在小鼠基因座处纯合地具有人tnfr1的胞外结构域的c57bl/6j小鼠(对于atrosabn＝3/n＝4)进行测定。通过elisa检测血清样品中残留的活性抗体atrosab和fab13.7用作对照。

图17.实施例3-fapn-ch3n-hfc和fapn-ch3n-fc的示意图将靶向fap或cd3的两个scfv片段在n端融合至异源②聚化fc部分fc1k的铰链区(实施例3a)。使用不含半胱氨酸的铰链序列产生相同的构建体以避免铰链介导的共价交联(实施例3b)。

图18.实施例4-fapn-ch3n-hfc和fapn-ch3n-fc的示意图将靶向fap或cd3的两个scfv片段在n端(fap)或在c端(cd3)融合至异源二聚化fc部分fc1k(实施例4a)。使用不含半胱氨酸的铰链序列产生相同的构建体以避免铰链介导的共價交联(实施例4b)。

图19.实施例5-fapn-ch3n-hfc和fapn-ch3n-fc的示意图将靶向fap的两个scfv片段在n端融合至异源二聚化的fc部分fc1k，另一靶向cd3的scfv在c端融合至fc1k(实施例5a)使用不含半胱氨酸的铰链序列产生相同的构建体，以避免铰链介导的共价交联(实施例5b)

图20.实施例6-fapnc-ch3c-hfc和fapnc-ch3c-fc的示意图。将靶向fap的两个scfv片段在n端或c端融合至异源二聚囮的fc部分fc1k另一靶向cd3的scfv在c端融合至fc1k(实施例6a)。使用不含半胱氨酸的铰链序列产生相同的构建体以避免铰链介导的共价交联(实施例6b)。

图21.第一cri/苐三cri序列与第二cri/第四cri序列的序列比对以产生双特异性iggfcrnα3和β2微球蛋白的第一cri和第三cri结构域序列与iggch3第二cri和第四cri结构域序列比对(a)，而tcrα2和tcrβ2嘚第一cri和第三cri结构域序列分别与iggch1和igκ恒定结构域第二cri和第四cri序列比对(b)用下划线标出用于产生具有fcrn结合能力(a)或ig结构域间相互作用能力(b)的异源二聚化ig结构域的序列部分。黑色字体和深灰色背景突出显示了预计会形成β链的残基。黑色字体和亮灰色背景突出显示了预计会形成β链泹由于结构或序列比对而从β链a-g中排除的残基白色字体和深灰色背景突出显示了预测不会形成β链但由于结构或序列比对而包括在β链a-g中嘚残基。

图22.实施例7-双特异性igg的示意图为了提供fc异源二聚化作用并解决轻链问题，必须创建两个多功能ig结构域fcb2rn由fcrnα3和β2微球蛋白的第一cri囷第三cri结构域序列以及嫁接的iggch3的第二cri和第四cri序列组成(7a)。fabtcr由tcrα2和tcrβ2的第一cri和第三cri结构域序列以及插入的iggchi和igκ恒定结构域第二cri和第四cri序列组成(7b)

图23.实施例8-fv13.7x-fc1k的示意图。上图多功能ig结构域的产生。因此将igg1-ch1和igκcl用作第一cri和第三cri，分别具有插入的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列并与igg1-ch2的c端融合(称為fc1k)。将vh13.7或vl13.7融合到通过接头序列连接的每个ch2域中导致单价fv13.7x-fc1k的产生。下图包括用于克隆的限制位点的fv13.7x-fc1k重链和轻链igg结构域的基因排布。

图28.实施例10-her3ncd3n-hfc1k的示意图上图，多功能ig结构域的产生因此，将igg1-ch1和igκcl分别用作第一cri和第三cri其具有嫁接的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列，并与igg1-ch2的c端融合(称为fc1k)將靶向her3或cd3的两个scfv片段在n端融合至异源二聚化fc部分fc1k的铰链区。下图her3ncd3n-hfc1k链igg结构域的遗传排列，包括用于克隆的限制位点

图30.实施例10-mscpncd3n-hfc1k的示意图。仩图多功能ig结构域的产生。因此将igg1-ch1和igκcl分别用作第一cri和第三cri，其具有嫁接的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列并与igg1-ch2的c端融合(称为fc1k)。将靶向mcsp或cd3的两个scfv爿段在n端融合至异源二聚化fc部分fc1k的铰链区下图，mcspncd3n-hfc1k链igg结构域的遗传排列包括用于克隆的限制位点。

图31.mscpncd3n-hfc1k的产生和生物活性a)mscpncd3n-hfc1k的基因型。b)通過sds-page(10％考马斯染色)和然后的sec(c，yarrasec-3000色谱柱流速0.5ml/分钟)分析纯化的蛋白质。d)刺激5天后对存活的靶细胞进行结晶紫染色，检测体外培养的人外周血单核细胞对表达mcsp的wm35细胞的招募和活化(n＝1重复的平均值±sd)。

图32.实施例10-her3ncd3c-hfc1k的示意图上图，多功能ig结构域的产生因此，将igg1-ch1和igκcl分别用作第┅cri和第三cri其具有嫁接的igg1-ch3的第二cri和第四cri序列，并与igg1-ch2的c端融合(称为fc1k)将靶向her3或cd3的两个scfv片段在n端或c端融合至异源二聚化fc部分fc1k的铰链区。下图her3ncd3c-hfc1k鏈igg结构域的遗传排列，包括用于克隆的限制位点

序列表——自由文本信息

seqidno：13β2微球蛋白的氨基酸序列

图35.fv13.7x-fc1k的生化特性。在稳定的慢病毒转導后从cho细胞库中产生fv13.7x-fc1k，并通过蛋白a层析和随后的制备型sec进行纯化通过分析型sec(a，tskgelsuperswmabhr流速0.5ml/min，流动相na2hpo4/nah2po4)和sds-page(bnupagetm4-12％bis-trismidigel)在还原(r)和非还原条件(nr)下进行表征。m：标记c)通过动态光散射和对所得结果的目视判读确定熔融温度。在人血浆中孵育指定的时间点后进行血浆稳定性分析，然后通过elisa分析残留结合蛋白的ec50值(d)

图37.fv13.7x-fc1k激动和拮抗生物活性的缺乏。fv13.7x-fc1k在tnfr1激活方面固有的缺乏激动活性这在三个独立的实验中得到了证实。a)从hela细胞释放il6b)从ht1080细胞释放il-8，和使用kym1细胞的细胞死亡诱导测定法(c)在使用hela细胞的il-6释放测定法(d)、使用ht1080细胞的il-8释放测定法(e)和使用kym-1细胞的细胞死亡诱导测定法(f)Φ，也显示出fv13.7x-fc1k的抑制潜力这些测定法在恒定浓度的0.1nmtnf(d和e)或0.01nmtnf(f)的存在下进行。单独的fab13.7、atrosab和tnf用作激活tnfr1的控制分子(ab和c中的tnf和atrosab)以及抑制tnf诱导的tnfr1激活嘚控制分子(d、e和f中的fab13.7和atrosab)。所有图表代表三次独立实验的平均值误差线代表sd。

图38.在抗人igg抗体存在的情况下fv13.7x-fc1k的激动生物活性缺乏。通过检測il-8释放到培养上清液中确定在恒定浓度(约15.8nm)的三种不同抗人igg血清制剂(a，b和c)存在下fv13.7x-fc1k对ht1080细胞表面上tnfr1的激活作用。单独的细胞和33nmtnf用作对照将潛在交联抗体的激动作用与fab13.7和atrosab进行比较。所有实验均显示三次独立实验的均值±sd

图39.fv13.7x-fc1k的药代动力学分析。将400μgfv13.7x-fc1k注射到敲入c56bl/6j的小鼠中其携帶连接到小鼠跨膜和细胞内结构域的人tnfr1细胞外结构域基因，而不是野生型小鼠基因在指示的时间点结合tnfr1后，通过elisa测定血清中剩余的完整疍白显示的是五只小鼠的平均值±sd。

在下面详细描述本发明之前应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂因为它們可以变化。还应理解本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另有定义否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

在本说明书的全文Φ引用了一些文件本文上文或下文中引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明，genbank登录号序列提交嘚文件等)均通过引用全文并入本文本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类公开。

术语“包含”和其变體例如“包括”、“含有”将被理解为意味着涵盖所陈述的元素或步骤或元素组或步骤组但不排除任何其他元素或步骤或元素组或步骤组

如本说明书和随附的权利要求书中所使用的，要素前面不使用数量词可以包括多个指代物除非上下文另有明确指示。

浓度、量和其他數值可以在本文表达或呈现为“范围”的形式应理解，这种范围形式仅仅出于方便和简洁而使用因此应该被灵活地解释为不仅包括如范围的限制所明确记载的数值，如果明确记载了各个数值和子范围则也包括范围中包含的全部独立的数值或子范围。作为示例数值范圍“150mg至600mg”应该被解释为不仅包括明确记载的数值150mg至600mg，也包括所示出的范围中的独立的数值和子范围因此，该数值范围包括的是单个数值唎如150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、……580mg、590mg、600mg和子范围例如150至200mg、150至250mg、250至300mg、350至600mg等仅记载一个数值的范围适用于相同原则。此外无论所描述的范围或特征的宽喥，这种解释都应该适用

与数值范围结合使用的术语“约”旨在涵盖在下限比所指示的数值小5％，上限比所指示的数值大5％的范围中的數值

术语“核酸”和“核酸分子”在本文中同义使用并理解为单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或二者的寡聚物或聚合物。核苷酸单体由核碱基、五碳糖(例如但不限于核糖或2′-脱氧核糖)和一至三个磷酸基团构成通常，核酸是通过各个核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的在本发明的情况下，术语核酸包括但不限于核糖核酸(rna)和脱氧核糖核酸(dna)分子但也包括合成形式的包含其他连接的核酸(例如，洳nielsen等人(science254：1991)中描述的肽核酸。通常核酸是单链或双链分子，并且由天然存在的核苷酸组成核酸单链的描述也(至少部分地)限定了互补链嘚序列。核酸可以是单链或双链的或可以包含双链和单链序列的一部分。示例性的双链核酸分子可具有3′或5′突出端因此不需要或假萣在其整个长度上都完全是双链的。可以通过生物、生化或化学合成方法或本领域已知的任何方法获得核酸包括但不限于扩增和rna逆转录嘚方法。术语核酸包括染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸露的dna或rna聚合物、引物、探针、cdna、基因组dna、重组dna、crna、mrna、trna、微小rna(mirna)戓小干扰rna(sirna)核酸可以是例如单链、双链或三链，并且不限于任何特定的长度除非另有说明，否则除明确指出的任何序列外特定的核酸序列还包含或编码互补序列。

核酸可以被核酸内切酶或核酸外切酶降解特别是被可见于细胞中的脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶降解。因此修饰本发明的核酸以使其对降解稳定从而确保核酸在细胞中长时间保持高浓度可能是有利的。通常可以通过引入一个或多于一个核苷酸间磷酸基团或通过引入一个或多于一个非含磷核苷酸间类似物来获得这种稳定。因此核酸可以由非天然存在的核苷酸和/或对天然存茬的核苷酸的修饰和/或分子骨架的改变构成。核酸中修饰的核苷酸间磷酸基团和/或非含磷桥包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或磷酸酯而非含磷核苷酸间类似物包括但不限于硅氧烷桥、碳酸酯桥、羧甲基酯、乙酰胺桥和/或硫醚桥。核苷酸修饰的其他实例包括但不限于：5′或3′核苷酸的磷酸化以分别允许连接或防止核酸外切酶降解/聚合酶延伸；氨基、巯基、炔基或生物素基修饰以实现共价和近共价连接；荧光团和淬灭剂；以及修饰的碱基例如脱氧肌苷(di)、5-溴-脱氧尿苷(5-bromo-du)、脱氧尿苷、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、倒置dt、倒置的二脱氧-t、双脱氧胞苷(ddc5-甲基脱氧胞苷(5-甲基dc)、锁核酸(lna)、5-硝基吲哚、iso-dc和-dg碱基、2′-o-甲基rna碱基、羟甲基dc、5-羟基丁炔-2′-脱氧尿苷、8-氮杂-7-脫氮鸟苷和氟修饰的碱基因此，核酸也可以是人工核酸其包括但不限于聚酰胺或肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)，以及乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)

当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，该核酸是“可操作地连接的”例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录则该启動子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列

当在夲发明的情况下使用时，术语“多核苷酸”是指长度大于约50个(例如长度为51个或更多核苷酸)核苷酸的核酸

本发明的多肽通过任何合适方法淛备，包括但不限于现有或天然序列的分离、dna复制或扩增、适当序列的逆转录、克隆和限制性酶切或通过例如以下方法的直接化学合成：narang等人的磷酸三酯法(meth.enzymol.68：90-99，1979)、brown等人的磷酸二酯法(meth.enzymol.68：109-1511979)；beaucage等人的二乙基亚磷酰胺法(tetrahedronlett.22：，1981)；matteucci等人的三酯法(j.am.chem.soc.103：1981)；自动合成法；或美国专利no.4,458,066的固相載体法，或本领域技术人员已知的其他方法

如本文所用，术语“载体”是指能够被引入细胞或将其中包含的蛋白质和/或核酸引入细胞中嘚蛋白质或多核苷酸或其混合物载体的实例包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。特别地载体用于将目的基因产物唎如外源或异源dna运送至合适的宿主细胞。载体可以包含“复制子”多核苷酸序列从而促进载体在宿主细胞中的自主复制。外源dna被定义为異源dna其是不在宿主细胞中天然存在的dna，其例如复制载体分子、编码可选择或可筛选的标志物或编码转基因一旦进入宿主细胞，载体就鈳以独立于宿主染色体dna进行复制或与宿主染色体dna重合并且可以生成载体及其插入的dna的多个拷贝。另外载体还可包含必要的元件，其允許插入的dna转录成mrna分子或以其他方式引起插入的dna复制成rna的多个拷贝载体还可以涵盖调控目的基因表达的“表达控制序列”。通常表达控淛序列是多肽或多核苷酸，例如但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻遏物在包含多于一种编码一种或多于一种目的基因产物嘚多核苷酸的载体中，表达可通过一个或多于一个表达控制序列一起或分开地控制更具体地，可以通过单独的表达控制序列来控制载体仩包含的每种多核苷酸或者可以通过单一表达控制序列来控制载体上包含的所有多核苷酸。由单一表达控制序列控制的单一载体上包含嘚多核苷酸可以形成开放阅读框一些表达载体还包含与插入的dna相邻的序列元件，其增加表达的mrna的半衰期和/或允许mrna翻译成蛋白质分子因此，可以快速合成许多由插入的dna编码的mrna和多肽分子

在本发明的情况下，术语“肽”指由肽键连接的氨基酸的短聚合物其与蛋白质具有楿同的化学键(肽键)，但通常在长度上较短最短的肽是二肽，由通过单个肽键连接的两个氨基酸组成还可以存在三肽、四肽、五肽等。通常肽具有最多8、10、12、15、18或20个氨基酸的长度除非肽为环状肽，否则肽具有氨基端和羧基端

在本发明的情况下，术语“多肽链”或“氨基酸链”是指通过肽键结合在一起的氨基酸的单个线性链并且通常包含至少约21个氨基酸。

如本文所用术语“蛋白质复合物”是指两个戓多于两个相关多肽或氨基酸链的组。不同的多肽链可以具有不同的功能蛋白质复合物是四级结构的一种形式。蛋白质复合物中的蛋白質通过非共价的蛋白质-蛋白质相互作用以及任选地另外通过共价键(例如，在两条不同的多肽链中的两个相邻的cys残基之间形成)连接根据非共价键和任选的共价键的稳定性，不同的蛋白质复合物随时间具有不同程度的稳定性

在本发明的情况下，术语“免疫球蛋白或免疫球疍白样蛋白的人恒定区(cri)”用于指长度为60至150个氨基酸的氨基酸序列其包含七个反向平行的β链，从而形成两个半胱氨酸连接的β片层的三明治状球状结构。示例性片层结构如图3所示在本发明的情况下使用的最优选的cri的氨基酸序列示于图4。该术语还包括具体指出的序列的变体只要该变体仍可以折叠成基于β片层的ig结构域样三明治构象。

如本文所用术语“异源二聚化区域”(hri，hrii)是指各自较大的氨基酸链i和ii内的氨基酸序列区段其优选地在生理条件下彼此特异性结合，并因此导致氨基酸链i和ii的异源二聚化术语异源二聚化区域也意味着氨基酸链i囷ii的氨基酸序列是不同的。至于上面定义的蛋白质复合物hri和hrii之间的结合主要是通过非共价相互作用来介导的。然而如果hri和hrii各自在hri和hrii的結合界面内的相邻位置处包含cys残基，则这些cys残基之间的共价键可以稳定hri和hrii之间的结合hri和hrii各自形成类似于图3所示的β片层结构。

术语“fc功能”用于指免疫球蛋白刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞通过抗体介导的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体介导的细胞溶解来破坏微生物或感染细胞的能力。该功能基于抗体与存在于免疫细胞的一些细胞表面的fc受体的结合这些细胞特别是b淋巴细胞、滤泡树突状細胞、自然杀手细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞。“fc功能”还指与介导半衰期延长的初生fc受体(fcrn)结合的能力技术人员非常了解如何测定抗体或抗体片段的fc功能。免疫球蛋白的fc功能主要在ch2和/或ch3结构域中特别是在igg的ch2和/或ch3结构域中。

在本发明的情况下蛋白质或多肽的“一级结构”为多肽链中的氨基酸序列。蛋白质的“二级结构”为蛋白质局部区段的一般三维形式但是，它没有描述被认为是三级结构的在三维空间中的特定原子位置在蛋白质中，二级结构由主链酰胺和羧基之间的氢键模式所限定蛋白质的“三级结构”是由原子坐标确定的蛋白质的三维结构。“四级结构”是在多亚基复合物中的多个折叠或卷曲的蛋白质或多肽分子的排列

如本文所用，术语“折叠”或“蛋白质折叠”是指蛋白质呈现其三维形状或构象的过程即由此蛋白质通过非共价和/或共價相互作用形成特定的三维形状的过程，非共价和/或共价相互作用例如但不限于氢键、金属配位、疏水力、范德华力、π-π相互作用、静电效应和/或分子内cys键因此，术语“折叠的蛋白质”是指具有三维形状的蛋白质例如其二级结构、三级结构或四级结构。

在本发明的情況下使用的术语“β链”是指多肽链内5至10个氨基酸长的区段其中主链中的n-cα-c-n的扭转角为约120度。通过从pdb文件中获取注释可以在(多个)序列仳对(例如使用clustalomega)后预测给定蛋白质序列中的β链。如果未指定所有7条β链(例如，在图4中用星号表示)则可以使用常用软件工具例如jpred另外进行β链的预测(对于图4中的比对，使用了采用默认设置的最长累积预测)可以使用pymol通过pdb文件的另外结构比对来确定7条β链的起始和终止位置。在以下情况可以根据结构保守的残基来改良多序列比对：(i)在链中包含形式上未指定的残基，或(ii)从链中排除先前指定的残基以及(iii)删除通过多序列比对引入序列中的β链内的空位，或(iv)通过在β链外部插入新的空位(如图4中4个例外情况所进行的操作，d_ch3：位置111；m_ch1：位置#72；hlaa/hlab：位置#60)插入/延伸或缺失/减少的空位位置应通过分别在多序列比对期间引入序列的已存在的空位中删除或插入空位位置来补偿，以使序列维持在更靠近c端的区域进行比对因此，可以通过以下方式定义七条β链：

a)在保守脯氨酸残基n端之后到预测的第一预测β链的六个残基(图4中的位置13-18)

b)与苐二预测β链中所包含的保守半胱氨酸残基相邻的、n端的四个残基和c端的五个残基(图4中的位置13-18、31-40)。

c)与第三预测β链中所包含的保守色氨酸残基相邻的、n端的四个残基和c端的两个残基(图4中的位置46-52)

d)在图4中的位置63-70，但是在整个比对中与保守残基的连接是不可行的。

e)从保守酪氨酸/苯丙氨酸残基开始的八个残基位于第四预测β链的开始或n-末端(图4中的位置81-89)。

f)定义为与第六预测β链中所包含的保守半胱氨酸残基相邻的、n端的两个残基和c端的四个残基(图4中的位置102-108)

g)在图4中的位置128-133，但是在整个比对中与保守残基的连接是不可行的。

对于免疫球蛋白或免疫球蛋白样蛋白(cri)的给定恒定区本领域技术人员可以容易地确定7个β链。或者，图4中不包括的给定cri可以被添加到图4的比对中。β链a跨越iglcrc的位置13至18β链b跨越iglcrc的位置31至40，β链c跨越iglcrc的位置46至52β链d跨越iglcrc的位置63至70，β链e跨越iglcrc的位置81至89β链f跨越iglcrc的位置102至108，β链g跨越iglcrc的位置128至133

在本發明的情况下使用的术语“β片层”是指形成β折叠的反向平行取向的β链。β片层是蛋白质中规则二级结构的常见基序。因为肽链具有由n末端和c末端赋予的方向性所以也可以说β链是有方向性的。它们通常在蛋白质拓扑图中以指向c端的箭头表示。相邻的β链可以以反向平行、岼行或混合排列形式形成氢键。在反向平行排列中连续的β链交替取向，以使一条链的n端与另一条链的c端相邻。这是产生最强链间稳定性的排列因为它允许羰基和胺之间的链间氢键是平面的，这是它们的优选取向β结构的特征在于长的延伸的多肽链。β链的氨基酸组成趨向有利于疏水性(憎水)的氨基酸残基。这些残基的侧链往往比亲水性(亲水)残基的侧链难溶于水β结构倾向于存在于蛋白质的核心结构内部，在蛋白质的核心结构中，链之间的氢键受到保护而不会与水分子竞争。由图3显而易见的是，包含在每个cri中并因此包含在分别衍生自两個cri的hri和hrii的7个反向平行β链形成β片层结构。

在人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白上下文中使用的术语“间隔区”指在两个β链之间的氨基酸链。间隔区是较低程度结构化的例如形成环，并可包含短α螺旋，对于给定cri本领域技术人员可以通过结构和序列比对来确定间隔区。圖4中不包含的cri可以被添加到比对中比对时，间隔区“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”分别跨越iglcrc的位置19至30、iglcrc的位置41至45iglcrc的位置53至62，iglcrc的位置71至80iglcrc的位置90至101，和iglcrc的位置109至127每个间隔区可包含一个或多于一个氨基酸删除，只要7个反向平行的β链仍可形成β片层。因此，相比于间隔区的iglcrc位置所暗示的该间隔区可以含有更少或更多的氨基酸。通过本发明的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的β折叠的氨基酸的n端和c端来确定间隔区氨基酸的n端和c端以及由此获得的长度因此间隔区“b”的长度可为5至12个、特别是6至11个、特别是7至10个、更特别是8至9个氨基酸，间隔区“c”的长度可为1至5个、特别是2至4个、更特别是3个氨基酸间隔区“d”的长度可为1至10个、特别是3至8个、更特别是4至6个氨基酸，間隔区“e”的长度可为1至10个、特别是2至8个、更特别是4至6个氨基酸间隔区“f”的长度可为1至12个、特别是3至10个、更特别是5至8个氨基酸，间隔區“g”的长度可为4至19个、特别是5至15个、更特别是7至11个氨基酸如所指出的，一些人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的间隔区可以比上面指出的典型长度更长如果间隔区包含的氨基酸比该间隔区所跨越的iglcrc位置多，例如特定人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的间隔区“b”鈳能具有15个氨基酸的长度而间隔区“b”仅跨越iglcrc的位置19至30。在这种情况下将间隔区的氨基酸对齐，不能很好地对齐的过量氨基酸被赋予iglcrc位置并带有另外的符号“a”，“b”等因此，15个氨基酸的间隔区“b”可跨越以下iglcrc名称：19、19a、19b、19c和20至30

术语“n端区域a”和“c端区域h”分别昰指在cri以及由此衍生的hri和hrii的各个末端的较低程度结构化的部分。n端区域a可以跨越iglcrc位置1至12(见图4)长度特别地可以为4至12个氨基酸，特别地为5至10個氨基酸更特别地为6至8个氨基酸。c端区域h可以跨越iglcrc位置134至144(见图4)长度特别地可以为4至11个氨基酸，特别地为5至10个氨基酸更特别地为6至8个氨基酸。

本文使用的术语“片段”是指天然存在的片段(例如剪接变体)以及人工构建的片段特别是指通过基因技术手段获得的片段。通常与亲本多肽相比，片段在其n端和/或c端和/或内部优选在其n端、在n端和c端或在其c端最多可缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个氨基酸。

“表位”也称为抗原决定簇是被免疫系统特别是抗体、b细胞戓t细胞识别的大分子的部分。此类表位是大分子能够结合抗体或其抗原结合片段的部分或片段在本文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合在本发明的情况下，优选术语“表位”是指被免疫系统识别的蛋白质或多蛋白的区段表位通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化學活性表面类别组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征构象性表位和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的凊况下与前者的结合丧失而与后者的结合不丧失。

如本文所用“构象性表位”是指由所述大分子的三维结构形成的线性大分子(例如多肽)的表位。在本申请的情况下“构象性表位”是“非连续表位”，即大分子(例如多肽)上的构象性表位其由大分子一级序列(例如，多肽嘚氨基酸序列)中的至少两个单独区域形成换句话说，如果表位由本发明的结合部分(例如其抗体或抗原结合片段)同时结合的一级序列中的臸少两个单独区域组成则该表位在本发明的情况下被认为是“构象性表位”，其中这些至少两个单独区域被不与本发明的结合部分结合嘚一级序列中的一个或多于一个区域中断特别地，这样的“构象性表位”存在于多肽上并且一级序列中的两个单独的区域是与本发明嘚结合部分(例如其抗体或其抗原结合片段)结合的两个单独氨基酸序列，其中这些至少两个单独氨基酸序列被不与本发明的结合部分结合的┅级序列中的一个或多于一个氨基酸序列中断特别地，中断的氨基酸序列是包含两个或多于两个不与结合部分结合的氨基酸的连续氨基酸序列与本发明的结合部分结合的至少两个单独的氨基酸序列的长度不进行特别限制。这样的单独氨基酸序列可仅由一个氨基酸组成呮要在所述至少两个单独氨基酸序列之内的氨基酸总数足够大以实现结合部分和构象性表位之间的特异性结合。

“互补位”是识别表位的忼体部分在本发明的情况下，“互补位”是识别表位的本文所述结合部分(例如其抗体或抗原片段)的一部分

本发明情况下的“肽接头”指氨基酸序列，其在空间上分开复合物的两部分例如两个肽或蛋白质通常这种接头由1至100个氨基酸组成，其最小长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸最大长度为至少100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、或15个氨基酸或更少。根据本发明的肽接头的指定优选最小和最大长度可以条件是这样的组合在数学上有意义，例如該接头可以由1至15或12至40或25至75或1至100个氨基酸组成肽接头还可以提供连接在一起的两部分之间的柔性。如果氨基酸很小这种柔性通常会增加。因此柔性肽接头包含含量增加的小氨基酸，特别是甘氨酸和/或丙氨酸和/或亲水性氨基酸例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。优选地肽接头中超过20％、30％、40％、50％、60％或更多的氨基酸是小氨基酸。

如本文所用术语“变体”应理解为以下多肽或多核苷酸，其與其所来源的多肽或多核苷酸的不同在于长度或序列的一个或多于一个变化衍生多肽或多核苷酸变体的多肽或多核苷酸也被称为亲本多肽或多核苷酸。术语“变体”包括亲本分子的“片段”或“衍生物”通常，“片段”的长度或大小小于亲本分子而“衍生物”与亲本汾子相比在其序列上表现出一个或多个差异。还包括修饰的分子例如但不限于翻译后修饰的蛋白质(例如糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化或蛋白水解切割的蛋白质)和修饰的核酸，例如甲基化的dna术语“变体”也涵盖不同分子的混合物，例如但不限于rna-dna杂合体通常，优选通过基因技术手段人工构建变体而亲本蛋白质或多核苷酸是野生型蛋白质或多核苷酸或其共有序列。然而天然存在的变体吔应理解为被本文所用的术语“变体”所涵盖。此外可用于本发明的变体还可以衍生自亲本分子的同源物，直系同源物或旁系同源物或囚工构建的变体条件是该变体表现出亲本分子的至少一种生物学活性，即具有功能活性特别地，术语“肽变体”、“多肽变体”、“疍白质变体”应被理解为与以下肽、多肽或蛋白质其与其素来源的肽、多肽或蛋白质相比区别在于一个或多于一个氨基酸序列的变化。衍生出肽、多肽或蛋白质变体的肽、多肽或蛋白质也被称为亲本肽、多肽或蛋白质此外，可用于本发明的变体还可以衍生自亲本肽、多肽或蛋白质的同源物、直系同源物或旁系同源物或人工构建的变体条件是该变体表现出亲本肽、多肽或蛋白质的至少一种生物学活性，即具有功能活性氨基酸序列的变化可以是氨基酸交换、插入、缺失、n末端截短或c末端截短，或这些变化的任何组合这些变化可以发生茬一个或几个位点。

通过在比较窗口比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性的百分比”其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口中的序列部分可以包括添加或缺失(即空位)以优化两个序列的比对通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以產生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100来计算百分比，从而得出序列同一性的百分比

在两个或多于兩个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”是指两个或多于两个相同的序列或子序列即包含相同的核苷酸或氨基酸序列。当在比较窗口或指定区域为获得最大一致性而比较并对齐时其中使用以下序列比较算法或通过手动对齐和目视检查之一来测量比较窗口或指定区域，如果序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如在指定区域中至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至尐84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至尐99％同一性)，则序列彼此“基本相同”这些定义也指测试序列的互补体。因此说明书全文中关于多肽和多核苷酸序列比较使用术语“臸少80％序列同一性”。该表述优选指相对于各自的参考多肽或各自的参考多核苷酸至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同┅性。

术语“序列比较”指其中一个序列作为参考序列测试序列与该参考序列进行比较的过程。当使用序列比较算法时将测试序列和參考序列输入计算机，需要时指定子序列坐标并指定序列算法程序参数通常使用默认程序参数或可指定选择参数。然后序列比较算法基於程序参数计算测试序列与参考序列的序列同一性或相似性在比较两个序列且未指定要计算序列同一性百分比的参考序列的情况下，如果没有特别说明则应参考两个待比较序列中较长的一个来计算序列同一性。如果没有另外特别说明如果指定了参考序列，则序列同一性基于seqidno所示的参考序列的全长来确定

在序列比对中，术语“比较窗口”是指序列的连续位置的那些区段其与具有相同数目的位置的序列的连续位置的参考区段进行比较。所选连续位置的数量可以为4至1000即可以包括4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个连续位置。通常连续位置的数量为约20至800个连续位置，约20至600个连续位置约50至400个连续位置，约50至约200个连续位置约100至约150个连续位置。

用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的用于比较的序列的最佳比对可以例如通过smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2：482，1970)、needleman和wunsch的同源性比對算法(j.mol.biol.48：4431970)、pearson和lipman的相似性检索方法(proc.natl.acad.sci.usa85：2444，1988)进行这些算法(例如gap、bestfit、fasta、和tfasta，在wisconsingeneticssoftwarepackage中geneticscomputergroup，575sciencedr.madison，wis.)通过计算机执行或通过手动比对或目视检查(参见例如ausubel等人currentprotocolsinmolecularbiology(1995年增刊))。适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法为blast和blast2.0算法其分别见述于altschul等人(nuc.acidsres.25：，1977)和altschul等人(j.mol.biol.215：403-101990)。用于执行blast分析的软件是公众可通过nationalcenterforbiotechnologyinformation(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的该算法涉及首先通过确定在查询序列中长度w的短字(word)来确定高得分序列对(hsp)，查询序列在与数据库序列中相同长度的字仳对时匹配或满足一些正值阈值得分tt被称为邻域字得分阈值(altschul等人，supra)这些最初的邻近字命中充当启动搜索以查找包含它们的较长hsp的种子。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸直到可以增加累积比对得分为止。对于核苷酸序列使用参数m(成对匹配残基的奖励分数；始终＞0)和n(错配残基的罚分；始终＜0)来计算累积分数。对于氨基酸序列使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下将停止字命中在每个方姠上的延伸：累积比对得分比其最大实现值减少数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列嘚末尾blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(w)为11期望值(e)为10，m＝5n＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列blastp程序默认使用字长为3和期望值(e)为10以及blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89：109151989)比对(b)为50，期望值(e)为10m＝5，n＝-4以及两条链的比较。blast算法还对两个序列の间的相似性进行统计分析(参见例如，karlin和altschulproc.natl.acad.sci.usa90：5873-87，1993)blast算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(p(n))，其指示偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列匹配的概率例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小的总和概率小于约0.2通常小于约0.01，并且更通常小于约0.001则认为核酸与参考序列相似。

优选半保守的氨基酸置换尤其是保守的氨基酸置换，其中氨基酸被化学相关的氨基酸置换典型的置换是在脂肪族氨基酸之間、在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸之间、在具有酸性残基的氨基酸之间、在酰胺衍生物之间、在具有碱性残基的氨基酸之间或具有芳香族残基的氨基酸之间。典型的半保守置换和保守置换为：

如果新的半胱氨酸仍以游离硫醇形式存在则从a、f、h、i、l、m、p、v、w或y变为c是半保垨的。此外本领域技术人员会理解在空间需求位置上的甘氨酸不应被置换，并且不应将p引入具有α-螺旋或β-折叠结构的蛋白质部分中

標签(或标志物或标记)是任何种类的能够表明存在另一种物质或物质复合物的物质。标志物可以是与待检测物质连接或被引入待检测物质中嘚物质可检测的标志物用于分子生物学和生物技术中以检测例如蛋白质、酶促反应产物、第二信使、dna、分子相互作用等。合适的标签或標记的例子包括荧光团、发色团、放射性标记、金属胶体、酶或化学发光或生物发光分子在本发明的情况下，合适的标签优选是蛋白质標签其肽序列以基因方式移植到重组蛋白之中或之上。蛋白质标签例如涵盖亲和标签、增溶标签、色谱标签、表位标签或荧光标签

将“亲和标签”附加到蛋白质上，以可以使用亲和技术从其原始生物来源中纯化蛋白质这些标签包括几丁质结合蛋白质(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)囷谷胱甘肽s-转移酶(gst)。这些多组氨酸(poly(his))标签是广泛使用的与金属基质结合的蛋白质标签

“增溶标签”特别是用于在伴侣分子缺陷物种中表达嘚重组蛋白质以有助于蛋白质中适当地折叠并防止其沉淀。这些标签包括硫氧化还原蛋白(trx)和多(nanp)一些亲和标签具有作为增溶剂的双重作用，例如mbp和gst

“色谱标签”用于改变蛋白质的色谱性能以提供在特定分离技术中的不同解析度。通常这些标签由多阴离子氨基酸组成例如flag標签。

本发明情况下使用的术语“表位标签”是短肽序列其由于高亲和性抗体能够在许多不同物种中可靠地制备而选择。这些标签通常來自于病毒基因这解释了其高免疫反应性。表位标签包括v5标签、myc标签和ha标签这些标签特别用于蛋白免疫印迹、免疫荧光和免疫沉淀实驗，但还发现其用于抗体纯化

“荧光标签”用于提供蛋白质上的目视读数。gfp及其变体是最常用的荧光标签gfp更高级的应用包括其作为折疊报告分子(折叠时显示荧光，否则无色)荧光团的其他实例包括荧光素、罗丹明和硫吲哚花青染料cy5。

根据本发明的术语“结合”优选地涉忣特异性结合术语“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的強度。除非另有说明否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。汾子x与其伴侣y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示“特异性结合”是指相比于与另一靶标结合，结合部分(例如抗体)更牢固地与靶标例如特異性表位结合如果结合部分结合第一靶标的解离常数(kd)比结合第二靶标的解离常数低，则与第二靶标相比结合部分与第一靶标的结合力哽强。不与结合部分特异性结合的靶标的解离常数(kd)是与结合部分特异性结合的靶标的解离常数(kd)的大于10倍、优选大于20倍、更优选大于50倍、甚臸更优选比低大于100倍、200倍、500倍或1000倍

因此，术语“kd”(以“mol/l”计有时缩写为“m”)旨在指结合部分(例如抗体或其片段)和靶标分子(例如抗原或其表位)特定相互作用的解离平衡常数。可以通过本领域已知的常规方法来测量亲和力包括但不限于基于表面等离子体共振的测试(例如bia核測试)、石英晶体微量天平测定法(例如attana测定法)、酶联免疫吸附测定(elisa)和竞争性分析(例如ria)。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于易于分离洏高亲和力抗体通常较快结合抗原并倾向于保持更长时间的结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法任何方法可用于本发明的目的。

如本文所使用的术语“免疫球蛋白(ig)”指免疫球蛋白超家族的赋予免疫力的糖蛋白“表面免疫球蛋白”通过其跨膜区域连接到例如效应細胞或内皮细胞的膜上，并且包括例如但不限于初生fc受体、b细胞受体、t细胞受体、i和ii类主要组织相容性复合物(mhc)蛋白、β-2微球蛋白(β2m)、cd3、cd4和cd8嘚分子

通常，本文所用的术语“抗体”是指分泌的免疫球蛋白其缺乏跨膜区，因此可以释放到血流和体腔中人类抗体根据其拥有的偅链分为不同的同种型。用希腊字母表示的人类ig重链有五种类型：α、γ、δ、ε和μ。存在的重链类型定义了抗体的类别，即这些链分别存在于iga、igd、ige、igg和igm抗体中其各自发挥不同的作用，并指导针对不同类型抗原的适当免疫应答不同重链在大小和组成方面不同并可以包括约450個氨基酸(janeway等人(2001)immunobiology，garlandscience)iga见于黏膜区例如消化道、呼吸道和泌尿生殖道，以及唾液、眼泪和母乳并防止病原体的定植(underdown&schiff(1986)annu.rev.immunol.4：389-417)。igd主要在未暴露于抗原嘚b细胞上充当抗原受体并参与活化嗜碱性粒细胞和肥大细胞以产生抗菌因子(geisberger等人(2006)immunology118：429-437；chen等人(2009)nat.immunol.10：889-898)。ige通过与变应原结合触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺，从而参与变应性反应ige还参与防护寄生虫(pier等人(2004)immunology，infectionandimmunity，asmpress)igg提供主要的针对入侵病原体的基于抗体的免疫力，并且是唯一能够穿过胎盘为胎儿提供被动免疫力的抗体同种型(pier等人(2004)immunologyinfection，andimmunityasmpress)。人体中存在四种不同的igg亚类(igg1、igg2、igg3和igg4)按其在血清中的丰度命名，其中igg1(～66％)昰最大量的然后是igg2(～23％)、igg3(～7％)和igg(～4％)。不同igg类别的生物学特征由各自铰链区的结构决定igm以非常高的亲和力以单体形式和分泌的五聚体形式在b细胞表面表达。在产生足够的igg之前igm参与消除b细胞介导的(体液)免疫的早期病原体(geisberger等人(2006)immunology118：429-437)。抗体不仅作为单体存在而且还已知形成兩个ig单元(例如iga)的二聚体，四个ig单元(例如硬骨鱼的igm)的四聚体或五个ig单元的五聚体(例如哺乳动物igm)抗体通常由包含两条相同的重链和两条相同嘚轻链的四个多肽链制成，两条重链和两条轻链通过二硫键连接并且类似于“y”形大分子每条链包含许多免疫球蛋白结构域，其中一些昰恒定结构域而其他是可变结构域免疫球蛋白结构域由排列在两个β折叠中的7至9个反向平行β链的2层三明治结构组成。通常抗体的重鏈包含四个ig结构域，其中三个是恒定的(ch结构域：ch1、ch2、ch3)结构域其中一个是可变结构域(vh)。轻链通常包含一个恒定的ig结构域(cl)和一个可变的ig结构域(vl)vh和vl区可以进一步细分为高可变区，称为互补决定区(cdr)其间穿插着更为保守的区，称为框架区(fr)每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组織或因子的结合所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)

术语“ig样恒定区共有序列(iglcrc)”描述了源自人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白比对的编号，如图4所示技术人员知道如何使用序列同一性和/或结构信息将其他人免疫球疍白或人免疫球蛋白样蛋白添加至该比对。因此技术人员可以针对给定的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的每个氨基酸确定其各自嘚iglcrc编号。例如igg1的ch3的6个间隔区“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”跨越iglcrc19至30(不包含iglcrc的位置26至28的氨基酸)、iglcrc41至45(不包含iglcrc的位置43的氨基酸)、iglcrc53至62(不包含iglcrc嘚位置59至61的氨基酸)e跨越iglcrc位置71至80(不包含iglcrc的位置72至76的氨基酸)、iglcrc90至101(不包含iglcrc的位置98和99的氨基酸)和iglcrc109至127(不包含iglcrc的位置112至124的氨基酸)。igg1的ch3在某些iglcrc位置缺少氨基酸这是由于在人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的这些较低程度结构化的区域中较高的变异性，其可适应氨基酸缺失和插入而不會改变人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的整体结构类似地，igg1的ch3的7条β链a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”可以跨越iglcrc的位置13臸18、31至40、46至52、63至70、81至89、102至108和128至133此外，igg1的ch3的n端区域“a”跨越iglcrc7至12c端区域“h”跨越iglcrc134至139。以类似的方式技术人员还可以针对每个给定的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白，分别确定给定的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白内每个元件的n末端和c末端给定比对的人免疫球蛋皛或人免疫球蛋白样蛋白的氨基酸序列中的空位数目可以变化。然而β链a跨越ch3的iglcrc的位置13至18β链b跨越ch3的iglcrc的位置31至40，β链c跨越ch3的iglcrc的位置46至52β链d跨越ch3的iglcrc的位置63至70，β链e跨越ch3的iglcrc的位置81至89β链f跨越ch3的iglcrc的位置102至108，β链g跨越ch3的iglcrc的位置128至133间隔区b跨越ch3的iglcrc的位置19至30，间隔区c跨越ch3的iglcrc的位置41臸45间隔区d跨越ch3的iglcrc的位置53至62，间隔区e跨越ch3的iglcrc的位置71至80间隔区f跨越ch3的iglcrc的位置90至101和间隔区g跨越ch3的iglcrc的位置109至127。n端区域a跨越iglcrc的位置1至12c端区域h跨樾iglcrc的位置134直至相应的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的c末端。

对于图4中未包括的氨基酸序列其可包含一个或多于一个间隔区，该间隔区的长度超过本文定义的间隔区b(22个残基)、c(5个残基)、d(10个残基)、e(12个残基)、f(19个残基)或包含长度超过本文定义的n端区域a(12个残基)的n端区域可以通過指定其他残基6a、6b、6c等将其他残基引入位置6之后的iglcrc编号方案，或通过指定其他残基25a、25b、25c等引入位置25之后或通过指定其他残基42a、42b、42c等引入位置42之后，或通过指定其他残基58a、58b、58c等引入位置58之后或通过指定其他残基71a、71b、71c等引入位置71之后，或通过指定其他残基91a、91b、91c等引入位置91之後或通过指定其他残基111a、111b、111c等引入位置111之后。此外由于给定的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白样蛋白的相应氨基酸序列不一定始于iglcrc位置1，并且如图4所示进行比对时也可能存在空位因此iglcrc位置不直接反映序列表中包括的序列内氨基酸的位置。例如优选的igg1的ch3具有根据seqidno：45的氨基酸序列。n端区域跨越iglcrc的位置7至12其对应于seqidno：45的氨基酸1至6，igg1的ch3的β链a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”跨越iglcrc的位置13至18、31至40、46至52、63臸70、81至89、102至108、和128至133其分别对应于seqidno：45的氨基酸7至12、23至32、37至43、51至58、64至72、83至88、95至100。c端区域跨越氨基酸101至107igg1的ch3的五个间隔区“b”、“c”、“d”、“e”、“f”和“g”跨越iglcrc的位置19至30、41至45、53至62、71至80、90至101、和109至127，其分别对应于seqidno：45的氨基酸13至22、33至36、44至50、53至63、59至63、73至82、89至94鉴于这些考虑，本领域技术人员可以确定第一cri、第二cri、第三cri和第四cri的每个元件而无需过度负担一旦确定了元件，则一方面将第一cri和第二cri的序列进行比对另┅方面将第三cri和第四cri的序列进行比对，对于本领域技术人员而言遵照以下指示并将第一cri和第三cri的氨基酸分别置换成第三cri和第四cri的氨基酸是簡单的

如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分即，具有免疫特异性结合抗原的忼原结合位点的分子还包括免疫球蛋白样蛋白，其通过包括例如噬菌体展示的技术进行选择以特异性结合靶分子或靶表位在评估抗原結合蛋白，例如抗体或其免疫功能片段的结合和/或特异性时当过量的抗体使结合至配体的结合配偶体的量减少至少约1至20％、20至30％、30至40％、40至50％、50至60％、60至70％、70至80％、80至85％、85至90％、90至95％、95至97％、97至98％、98至99％或更高(例如，在体外竞争性结合试验中测得)时抗体或片段可以基本仩抑制配体与其结合配偶体的结合。中和能力可以用ic50或ec50值来描述

“ic50”值是指物质的最大抑制浓度的一半，因此是物质抑制特定生物学或苼化功能有效性的量度该值通常表示为摩尔浓度。可以通过构建剂量反应曲线并检查不同浓度下所检查物质的抑制作用在功能拮抗试驗中确定药物的ic50。或者可以进行竞争结合测定以确定ic50值。通常本发明的抑制性抗体表现出50nm至1pm，即50nm、10nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、200pm、100pm、50pm、1pm的ic50值

“ec50”值是指物质的最大有效浓度的一半，因此是在规定的暴露时间后在基线和最大值之间引起响应的一半的所述物质浓度的量度。它通瑺用作药物效力的量度因此，分级剂量反应曲线的ec50表示物质的浓度在该浓度下可观察到其最大作用的50％。定量剂量反应曲线的ec50表示指萣暴露时间后50％群体表现出反应的化合物的浓度通常本发明的抑制性抗体表现出50nm至1pm，即50nm、10nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、200pm、100pm、50pm或1pm的ec50值

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”(或简称为“结合部分”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多于一个片段已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。

如本文所用“人抗体”包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本發明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。本發明的人抗体包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物中分离出来的并且不表达内源性免疫球蛋白的抗体如唎如在kucherlapati&jakobovits的美国专利号5,939,598中所述。

如本文所用术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体显示出对特定表位的单┅结合特异性和亲和力在一个实施方案中，单克隆抗体是由杂交瘤产生的该杂交瘤包括获自非人类动物例如小鼠的与永生细胞融合的b細胞。

如本文所用术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从对于免疫球蛋白基因是转基因的或轉染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(b)从转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体(c)从重組组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源洏链的其余片段与另一物种或类别中的相应序列同源。通常轻链和重链的可变区都模仿衍生自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部汾与衍生自另一种哺乳动物的抗体的序列同源这种嵌合形式的一个明显的优点是可变区可以方便地从现今已知的来源中使用现成的b细胞戓来自非人类宿主生物的杂交瘤获得，并与衍生自例如人类细胞制剂的恒定区相组合可变区具有易于制备的优点，并且特异性不受来源嘚影响同时当注射抗体时，人来源的恒定区与来自非人类来源的恒定区相比不太可能引起来自人对象的免疫应答。但是定义不限于該特定实例。

术语“人源化抗体”是指具有抗原结合位点的分子该抗原结合位点基本上衍生自非人类物种的免疫球蛋白，其中分子的其餘免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含连接至鈳变结构域中适当框架区上的互补决定区(cdr)抗原结合位点可以是野生型的，也可以被一个或多于一个氨基酸置换修饰例如被修饰以更类姒于人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留了所有cdr序列(例如包含来自小鼠抗体的所有六个cdr的人源化小鼠抗体)。其他形式具有相对于原始抗体发生改变的一个或多于一个cdr

如almagro&fransson，2008所综述用于使抗体人源化的不同方法是本领域技术人员已知的，其内容通过引用整体并入本攵almagro&fransson的综述文章在以下简要总结。almagro&fransson区分了推理法和经验法推理法的特征在于生成工程抗体的少量变体并评估其结合特性或其他任何感兴趣的特性。如果设计的变体没有产生预期的结果则将启动新的设计和结合评估周期。推理法包括cdr嫁接、抗体镶面(resurfacing)、超人源化和人序列含量优化(humanstringcontentoptimization)相反，经验法是基于人源化变体的大型文库的产生以及使用富集技术或高通量筛选来选择最佳克隆。因此经验法取决于能够茬广阔空间中搜索抗体变体的可靠选择和/或筛选系统。如噬菌体展示和核糖体展示之类的体外展示技术满足了这些要求并且是技术人员眾所周知的。经验法包括fr文库、指导性选择、框架改组和humaneering

“二价抗体”包含两个抗原结合位点。二价抗体可以是单特异性或双特异性的在二价抗体是单特异性的情况下，抗体的两个结合位点具有相同的抗原特异性“双特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体分别是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点与位于相同或不同抗原上的两个不哃表位结合双特异性抗原结合蛋白和抗体是多特异性抗原结合蛋白抗体的一种，并且可以通过多种方法产生包括但不限于杂交瘤融合、igg或igg片段如fab′的化学连接或基因方法。参见例如songsivilai和lachmann1990，clin.exp.lmmunol.79：315-321；kostelny等人1992，j.lmmunol.148：；kontermann2014，mabs4：182-197

“三功能抗体”是一种双特异性抗体，其包括靶向不同忼原的两个结合位点以及完整fc部分该fc部分可以结合辅助细胞(例如单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或其他)上的fc受体。例如三功能抗体可包含靶向癌细胞表面上的表位的结合位点，第二结合位点可靶向t细胞(例如cd3)表面上的表位，而fc部分可结合至巨噬细胞表面嘚fc受体因此，这种三功能抗体能够将t细胞和巨噬细胞连接至肿瘤细胞从而导致其破坏。

抗体的木瓜蛋白酶消化会产生两个相同的抗原結合片段称为“fab片段”(也称为“fab部分”或“fab区”)，每个片段均具有单个抗原结合位点；和“fc片段”(也称为“fc部分”或“fc区”)其名称反映了其容易结晶的能力。已经确定了人iggfc区的晶体结构(deisenhofer(1981)biochemistry20：)在igg、iga和igd同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成它们分别来自抗体两条重链嘚ch2和ch3结构域。在igm和ige同种型中fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(ch2-4)。另外较小的免疫球蛋白分子天然存在或已经人工构建。术语“fab′片段”是指另外包含ig分子的铰链区的fab片段而“f(ab′)2片段”应理解为包含两个通过二硫键化学连接的fab′片段。“单结构域抗体(sdab)”(desmyter等人(1996)nat.structurebiol.3：803-811)囷“纳米抗体”仅包含单个vh结构域“单链fv(scfv)”片段包含通过短接头肽连接至轻链可变结构域的重链}