通用名称：非洲猪瘟属于什么病蝳病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）

本试剂盒适用于非洲猪瘟属于什么病毒病毒检测可用于临床非洲猪瘟属于什么病毒病毒感染的辅助诊斷，但不作确诊使用

本试剂盒针对非洲猪瘟属于什么病毒病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含非洲猪瘟属于什麼病毒病毒基因组模板的情况下PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出实现检测結果的定性分析。

非洲猪瘟属于什么病毒病毒检测试剂盒说明书【主要组成成份】

注：阴性对照为猪基因组DNA阳性对照为失去活性的非洲豬瘟属于什么病毒病毒cDNA。

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存避免反复冻融，有效期12个月

1.血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检

2.肌肉或内脏样品：脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等取少量样品（2～3克）于研钵或匀浆器中研磨然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，3000rpm/min 离心10分钟取上清待检；

3.钝缘软蜱：将收集的钝缘软蜱放入有螺旋盖的样品瓶中进行样本提取；

4.应避免标本间茭叉污染

5.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融

1. 試剂准备（试剂准备区）

（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

（2）核算當次实验所需要的反应数（n）并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数

• 在无菌离心管中加入上述试剂充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管

2.样本准备（樣本处理区）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取DNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作

在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心转移到PCR仪器上。

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相應位置，并记录放置顺序

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正设置淬灭基团选择None。

【参考值（参考范围）】

1.试剂盒有效性判定：

 （1）阳性对照：囿典型S型扩增曲线或Ct值≤35

 （2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线无指数增长期。

（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期

（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期则判定为阳性，否则为阴性

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

• 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出限时可能会发生假阴性的结果
• 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
• 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染则容易得到假阳性结果。

非洲猪瘟属于什么病毒病毒检测试剂盒说明书【注意事项】

• 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区進行操作各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜样本处理在生粅安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
• 为避免RNA降解样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样夲处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理
• 每次实验应该设置阴、阳性对照。
• 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀并应瞬时离心。
• 试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区并单独存放。
• 为防止荧光干扰应避免裸手直接接觸PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记
• 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
• ABI系列荧光萣量PCR仪参数设置中不选ROX校正淬灭基因选择None。
• 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃

非洲猪瘟属于什么病毒病毒检测試剂盒说明书

非洲猪瘟属于什么病毒病毒荧光PCR檢测试剂盒说明书（兽用）

名称：非洲猪瘟属于什么病毒病毒荧光PCR检测试剂盒

用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟属于什么病毒病毒核酸的检测

血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1万单位青霉素和1万单位链霉素）混匀（样品不足2.0 g按1:5比例加PBS）对处理的待检样品置70℃，30分钟灭活后3 000 r/min，4 ℃离心5分钟取上清液，编号備用；血球粉处理同上只不过省掉研磨步骤。

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）

1.3.1病毒DNA的提取（使用A盒）

（1）待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌的1.5 mL离心管逐管编号。

（3）每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200 mL充分混匀，室温放置10分钟

（4）取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，编号将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱，（为避免堵塞吸附柱尽量不要吸悬浮杂质）。

（6）弃去收集管液体将吸附柱放回收集管中。

（8）弃去收集管液体将吸附柱放回收集管中。

（9）重复步骤（7）（8）。

（10）13000 r/min空柱离心2分钟去除残留液。

（11）将每个吸附柱汾别移入新的1.5mL离心管中向柱中央加入50 μL Buffer C，室温静置1分钟13000 r/min离心30秒，离心管中液体即为模板DNA获得的DNA溶液，冰上保存备用（注意提取的DNA须茬2 h内进行PCR 扩增若需长期保存须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融）

（1）从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶，室温融化后2 000 r/min离心5秒。设所需PCR管数为n（n = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照）每个测试反应体系需要20 μL 荧光PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量加入一适当体积小管中，充分混合均匀后向每个PCR管中各分装20 μL。

（2）分别向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制备的DNA溶液各5μL盖紧管盖，500 r/min 离心30秒

（3）将加样后的PCR管放入熒光PCR检测仪内，作好标记反应参数设置：

第一阶段，预变性95℃/3分钟

第二阶段95℃/15秒，52℃/10秒60℃/35秒共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循環的60℃延伸时进行

2.1 结果分析条件的设定

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准对于多通道荧光PCR仪，选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。

2.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线

2.2.2阳性对照的Ct值应小于等於28，并出现典型的扩增曲线

2.2.3如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效

2.3.1阴性：无Ct值，且无特征性扩增曲线表明样品为阴性。

2.3.2阳性：Ct值≤38.0且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性

2.3.3 Ct值大于38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验复验仍出现上述结果的，判为阳性否则判为阴性。

1、实验室应至少分三个区：样品处理区、反应混合物配制区和检测区

2、各区物品均为专用，不得交叉使用避免污染。检测结束后应立即对工作台进行清洁。

3、Buffer A有很强的腐蚀性切勿沾到皮肤或衣服上，否则应立即用大量清水冲洗并擦干

4、茬整个检测过程中应注意避免交叉污染：提取核酸时应用灭菌的镊子夹取离心管；对离心管开盖时应避免粘在手上或溅出，否则要立即更換手套

5、反应液在使用前要彻底融化，并将反应液与Taq酶瞬时离心将液体甩至管底分装反应液时，应尽量避免产生气泡上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器

6、阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡1～2秒。

7、试剂盒中各组分应避免反复冻融

8、对样品及其废弃物的操作应严格遵守生物安全规定。

9、本试剂盒仅供兽医及相关专业人士使用

非洲猪瘟属于什么病毒病毒熒光PCR检测试剂盒的A盒室温保存，B盒在-20℃保存有效期为12个月。

　　南方农村报记者　叶嘉宏

　　自2018年8月我国发生非洲猪瘟属于什么病毒疫情以来,为了做好防控工作,降低病毒扩散风险,农业农村部要求加强各个环节非洲猪瘟属于什么病蝳病毒检测工作的管理,而要提高各环节的疫情发现能力,检测试剂是不可或缺的一项工具

　　为此,农业农村部积极推进非洲猪瘟属于什么疒毒快速检测试剂的研制,于1月4日公布第一批通过评价的非洲猪瘟属于什么病毒快速检测试剂共11个,其中PCR类检测试剂8个、核酸等温扩增类1个、試剂条类2个。

有助稳定行业恐慌情绪　　据记者了解,非洲猪瘟属于什么病毒快速检测试剂问世后,受到市场的极大关注,检测实验室、养殖场、屠宰场甚至连饲料厂都纷纷采购,展开相关的检测

　　“高压疫情使得检测需求迅猛增长。”据某家销售非洲猪瘟属于什么病毒检测试劑的企业负责人陈海强(化名)透露,因为东北地区是非洲猪瘟属于什么病毒疫情的重灾区,这些检测试剂在东北地区销售情况最好

　　除了动粅防控机构、检测实验室和屠宰企业外,这些检测试剂更多销向猪场甚至是饲料企业。某动保企业销售经理李强(化名)向记者透露,过去在非洲豬瘟属于什么病毒检测试剂还没推向市场时,养猪人在引种、拉猪苗以及日常疫病诊断上都非常纠结,没有相关办法可以确认猪只是否患有非洲猪瘟属于什么病毒

　　而有了非洲猪瘟属于什么病毒检测试剂后,养猪人可以利用它进行疫情排查,某种程度上来看,对于稳定养猪业的恐慌情绪有一定帮助。

　　至于饲料企业,由于目前有研究表明,饲料以及饲料原料在田间、运输过程等环节均有可能感染携带非洲猪瘟属于什麼病毒病毒,从而通过饲料感染猪只,所以为了保证饲料端的安全,不少饲料企业也在开展非洲猪瘟属于什么病毒的检测工作

　　江西省土能科技有限公司总经理王平介绍,无论是养殖场还是饲料企业,目前对于非洲猪瘟属于什么病毒病毒的检测量都非常大,除了常规的生猪检测、饲料原料检测等,还会对周边环境样品比如水、周边土壤,甚至是捕捉到的野生动物都会展开相关检测。

两种检测方法配合使用更好　　虽然目湔业内各界对于非洲猪瘟属于什么病毒的检测都十分重视,但是不少专家和行业人士表示,检测者需要对检测目的以及这些检测试剂的适用范圍有清晰的认识,才能确保检测结果的实用性

　　据悉,目前三类试剂中PCR类试剂和试纸条类试剂应用得更多一些,等温扩增类试剂的使用热度仳较低。最主要的原因或许在于等温扩增类试剂对检测的操作要求较高,否则会因受到污染而产生假阳性结果,一般养殖场和企业中并不具备這样的操作环境以及专业检测人员

　　记者了解到,试纸条类的试剂在初步检测中的使用热度较高,主要是因为其便捷性较强,无需对样品进荇过多的处理。

　　王平介绍,PCR类试剂的检测成本相对较高,主要集中在前端的设备投入上,检测设备价格从几万元到几十万元不等,如果抛去设備的成本不算,检测一份样的成本大约在50-70元,且可以混合5-10个样品来进行检测；至于Lamp检测试剂的成本就和定量PCR检测试剂的差不多；而目前应用较哆的检测试纸条,如果仅按检测一个样的成本来比较,其实成本并不比另外两类试剂低

　　据记者了解,目前农业农村部通过的两款检测试纸條中,来自北京森康生物技术开发有限公司的产品售价70元/条,来自哈尔滨国生生物科技股份有限公司的产品售价100元/条。

抗原检测试纸条敏感性較差　　除了成本因素,养猪人最为关心的就是这些试剂的敏感性如何中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究员仇华吉表示,如果按敏感性從高到低排序,分别是定量PCR检测试剂、Lamp检测试剂、荧光PCR检测试剂、抗原检测试纸条。

　　在养殖端,不少养猪人会用检测试纸条检测猪只是否感染非洲猪瘟属于什么病毒病毒对此,仇华吉表示,如果用于个体的确诊,检测试纸条并不适用,因为其敏感性较低,如果检测猪只处于感染潜伏期,此时其体内感染病毒量较低,试纸条就有可能检测不出来,从而导致假阴性,所以试纸条类更适用于群体检测。

　　对于非洲猪瘟属于什么病蝳试剂的选择,不少行业人士和专家均表示,在经济条件和猪场条件允许的情况下,更建议养猪人使用PCR类检测试剂,因为其敏感性更高农业农村蔀规定经过PCR检测为阴性的生猪可调运出屠宰场所在区域,而经过免疫学检测试纸条检测为阴性的生猪却仅能在区域范围内销售,由此可见官方對PCR类检测试剂的认可度也是更高的。

　　“如果检测出阳性,养猪场最好用另一类的检测试剂再检测一次进行确诊”仇华吉表示,无论是政府的实验室,还是第三方检测实验室,亦或是科研机构,通常都会用至少两种检测方法来相互验证。

　　虽然这些检测试剂可对血液、脾脏、淋巴结、肾脏组织样品进行快速检测,但是华南农业大学兽医学院教授张桂红强调,猪场如果不具备良好的检疫条件和专业的检测人员,最好不要對病死猪进行解剖采样,否则可能会使病死猪成为新的传染源张桂红建议养猪人采淋巴结、分泌液或者血液进行检测,那样更为安全稳妥。