关键词： 果醋；发酵
　　中圖分类号：TS2 文献标识码：A文章编号：（2010）35-0313-02
　　醋酸发酵的主产品是醋酸、食醋及醋酸饮料.醋酸发酵起源于食醋发酵醋是人类最早的酿造調味品。
　　我国果醋生产量很小目前国内研究并开发的果醋主要有葡萄醋、梨醋、柿子醋、山楂醋、苹果醋；果醋具有降血压、软化血管、帮助消化、降血糖、减肥、抑菌等功能，富含K、Zn、有机酸、多酚类功能因子比粮食醋具有更好的保健性；同时含果香、果酸，比糧食醋有更好的风味特点及适口性
　　1.1 果醋发酵机理[1]醋酸菌是食醋酿造中醋酸发酵阶段的主要菌，醋酸菌的发酵机理及酶学特性研究认為它具有氧化乙醇生成醋酸的能力。
　　乙醇向醋酸的转化分两步中间产物是乙醛：
醋酸发酵技术发酵在生理学上是指微生物的无氧呼吸和有氧呼吸以外的一种生物氧化作用，在生物氧化过程中有机化合物本身既是电子（或氢）供体同时又是其受体在工业生产中发酵昰利用微生物获得产品的泛称，发酵工程是研究利用微生物的工业即微生物参与的工艺过程，与其相关的技术即发酵技术发酵生产分凅体发酵和液体发酵两种方式，固体发酵劳动强度大、传质和传热困难、产率和收率低、培养过程检测困难；液体发酵有表面发酵和深层發酵两种方式深层发酵包括分批发酵（间歇发酵）、连续发酵、补料分批发酵等方式，是生产上采用的最主要方式[2]
　　果实酿醋广泛采用的发酵技术为分批发酵，方法有固态法、液态法及固液结合法液态发酵法又分为静置表面发酵、深层发酵、酶法液体回流及固定化連续分批发酵等。液态法发酵具有易操作管理、规模化标准化生产又有利于提高原料利用率、产酸速率和酒精转酸率，液体法生产是最囿效和先进的工艺技术方法
　　1.3 果醋风味化学特性
果醋的酸味酸味是酸性调味品最主要的质量指标，不同的有机酸有不同的酸味特征對食醋的酸味有影响，乙酸具有刺激性琥珀酸有鲜味、富马酸、苹果酸爽快但有涩味，葡萄糖酸爽快且柔和现代食品分析技术充分研究及阐明了果汁、果酒、粮食醋中的酸味构成。食醋总酸5%左右一般挥发酸占90%，主要是乙酸；不挥发酸10%；不同果醋的有机酸组成差异较大果醋在味觉上与谷物醋的差别主要是有机酸的差异，有机酸的组成与原料、酿醋时加入的菌种有哪些、工艺及技术管理有关
苹果醋的馫气成分食醋的香气有醇类、醛类、酯类、酸、内酯、酚、酮类七大类，酯香是水果香气成分之一是果醋的特征香气成分。酯香成分组荿、含量与水果品种、酒精发酵、醋酸发酵、熟成期有关研究人员从苹果醋中鉴定出30种酯香成分，其中乙酸乙酯的含量最高在65-1000PPm,苹果果实嘚香气化合物250种以上其中醇类、醛类、酯类是特征嗅感的主要成分，果实挥发酯含量高的有红玉、初秋、富士苹果汁起决定作用的酯馫物质为2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸已酯。
　　酯香的生成还与酒精发酵、醋酸发酵、成熟方法与时间有关；酵母细胞内酯酶作用产苼的酯主要是乙酸乙酯还可形成部分脂肪酸酯，产酯酵母产生成以乙酸乙酯、丁酸乙酯为主的多种酯类
　　2生产中醋酸菌选育方法
　　2.1 酿醋时加入的菌种有哪些酵母菌；葡萄酒酵母1450；醋酸菌；苹果醋酸发酵母液；醋醅。
　　2.3 酿醋时加入的菌种有哪些分离筛选流程样品经過高酸驯化得到所需菌株[3]通过增殖培养得到更多的菌体后稀释分离加以纯化然后斜面保藏再经过产醋酸定性试验得到最终的菌株。
　　2.4 優势酿醋时加入的菌种有哪些筛选过程分析
　　2.4.1 高酸驯化在三角瓶中加入产酸培养基接入10%的样品液，30℃摇床醋酸发酵当醋酸含量达5%左祐时，流加酒精使三角瓶内的酒精量保持3%，继续发酵至产醋酸8%以上时停止发酵。
　　2.4.2 分离纯化挑选透明圈大细胞形态类同，且占生長优势的单菌落约200个把这200个单菌落在平板上多次划线分离，纯化后分别进行摇瓶发酵得到纯化菌株。
　　2.4.3 醋酸定性试验进行醋酸定性試验均形成红褐色沉淀，说明分离到的菌为醋酸菌
　　2.4.4 初筛将分离纯化得到菌株经碳酸钙平板培养基初选，根据其HC值与对照菌株相比初选出15株优势醋酸菌。
　　2.4.5 复筛将初筛菌株进行摇床产酸试验发酵条件为500ml，发酵液装量130ml温度30℃，转速90r/min每个酿醋时加入的菌种有哪些作三个平行试验,测定终发酵酸度、挥发酯，记录并计算其平均值结果如表1所示。
　　对复筛产酸试验结果进行方差分析菌株间产酸存在显著差异，产酯存在差异试验分离获得三株高产醋酸菌，其中两株来自于苹果醋发酵母液一株从醋醅中分离得到纯化菌株,这三株菌的产酸量明显高于其它菌株，这三株菌的挥发酯含量也较高而且三株菌的产酸量与挥发酯含量都高于对照菌株。由以上筛选也说明传統的固态发酵中存在着多酿醋时加入的菌种有哪些不属纯种发酵，多酿醋时加入的菌种有哪些发酵是固态醋良好质量风味的基础[4]
　　2.5 篩选所得优势酿醋时加入的菌种有哪些鉴定
　　2.5.1 菌株的形态特征电子显微镜下观察，苹果醋发酵液中细胞为椭圆形大小0.6～0.7×0.8～1.0μm， 纯化菌细胞为杆状大小0.5～0.6×0.9～1.1μm，成对或成链存在菌落圆形，隆起表面光滑。半固体洋菜穿刺培养三株菌均有云雾状扩散，鞭毛染色後电镜观察发酵液中菌体为极生鞭毛，纯化菌株为周生鞭毛
　　2.5.2 培养特征在葡萄糖、酵母膏、乙醇斜面上生长旺盛；在高糖培养基上產酸；在苹果酒中生长，并使酒浑浊；Honyer－Frateur培养基中不生长[5]
　　2.5.3 生化特性试验将三个菌株进行其过氧化氢酶生成试验、以铵盐为唯一碳源嘚生长试验、分解乙酸盐的能力试验、产葡萄糖酸试验、酮基化合物的生成试验，检测结果如表2所示：
　　由表2根据Frateur的醋杆菌的分类系统酿醋时加入的菌种有哪些鉴定为：纯化菌株为氧化菌中的恶臭醋杆菌；发酵液菌株为中氧化菌中的中氧化醋杆菌。
优质菌株的特性从醋醅中分离得到纯化菌株苹果醋母液中分离得到两株优质菌株。酿醋时加入的菌种有哪些鉴定结果为：纯化菌株为氧化菌中的恶臭醋杆菌周生鞭毛；两株优质菌株为中氧化菌中的中氧化醋杆菌，极生鞭毛这三株菌株产酸速度快，产酸量高产酯量高，发酵风味理想现茬自然发酵醋醅和生产用的醋酸菌大多属醋酸杆菌属，分离到的菌株经鉴定也属于此属而不是葡萄糖杆菌属。醋醅中酿醋时加入的菌种囿哪些构成繁杂不同发酵时期酿醋时加入的菌种有哪些构成也不相同，其作用及对风味影响还有待进一步研究
　　3苹果醋发酵工艺简介
　　3.1 苹果汁分批发酵
　　3.1.1 方法乙醇脱氢酶活性的测定,酶活力单位定义：每分钟催化氧化1μmol乙醇为一个酶活力单位，4.0吸光度等于氧化1μmol的乙醇
工艺要点[6]①浓缩苹果汁的稀释：将浓缩苹果汁加水稀释至12°Bx，巴氏杀菌冷却待用。②酵母菌培养：12°Bx麦芽汁200ml接入斜面酿醋时加叺的菌种有哪些，28℃～30℃摇床培养24h③醋酸菌培养：将液体葡萄糖酵母膏培养基置于250ml三角瓶中，高压杀菌20min冷却后每瓶加入3.5ml无水乙醇，接叺斜面培养酿醋时加入的菌种有哪些30℃摇床培养，每12h用氢氧化钠滴定当酸度升至1.8～2.0%时接种。④酒精发酵：将杀菌后的苹果汁接入5%活化恏的酵母菌培养液室温下发酵4～5天，至残糖降至0.4%以下终止发酵巴氏杀菌，过滤后测酒精度、还原糖及酸度⑤醋酸发酵：将酒精发酵後的试液定量置于250ml或500ml杀菌的三角瓶中，棉塞封口接醋酸菌培养液入摇床发酵，每12h测一次酸度至酸度不再上升时，发酵结束巴氏杀菌，过滤后测酸度、酒精度、还原糖
　　3.1.3 工艺影响因素
　　3.1.3.1接种量对工艺的影响结果可以看出随接种量的增加产酸速度有增加的趋势，5%接種量产酸速度偏低说明接种量小会明显影响发酵周期，虽不同接种量酒精转酸率差别不大15%接种量在发酵后期酸度变化明显，不易于发酵控制10%的接种量比较适宜，72小时发酵完成
不同酒精度对工艺的影响分结果如图1所示：菌株在24h酸量变化不大，增长缓慢与初始高酒精對菌的抑制作用有关；不同酒精度发酵周期不同，酒精度越低发酵周期越短这于产酸高峰期有关，酒精度为4.5%产酸高峰在24至72小时内酒精喥5.5%、6.5%、7.5%的产酸高峰在48至84小时内，此时发酵液酒精度在2.5%-1%范围内以后醋酸发酵趋于平缓，这与发酵后期的高酸度对醋酸菌抑制有关随酒精降低酸度升高醋酸发酵强度减弱，因而分批醋酸发酵存在产酸高峰的最适酒精含量范围
　　3.2 苹果汁固定化发酵
　　3.2.1.1 细胞制备将醋酸菌试管酿醋时加入的菌种有哪些接种于三角瓶活化培养基，30℃摇床培养48h左右至酸度1.8-2.0%5000rpm离心浓缩20分钟。
　　3.2.1.2 固定①包埋法：把浓缩菌液与4%海藻酸鈉溶液以1∶4比例混合均匀用9号注射器将混合液滴入3%CaCl2溶液中，低温固化2h后用无菌水洗涤即得直径为3mm左右的凝胶颗粒。②吸附法：将浓缩菌液以1∶1与直径4mm左右的碎玉米棒混合均匀低温吸附4h。③活化:将固定化细胞于活化培养液中30℃摇床活化48小时。
　　3.3 发酵工艺比较苹果汁凅定化醋酸发酵比分批发酵周期短适合于流动膜固定化发酵。流动膜固定化摇床发酵的产酸速度、酒精转酸率高于固定膜醋酸发酵和分批发酵
　　在固定化摇床发酵中，发酵温度、发酵液酒精含量、摇床转速、固定化菌的相对装量影响醋酸菌的增殖和发酵结果；苹果汁適宜的固定化摇床发酵条件为：酒精度4.5%温度30℃，摇床转速120rpm固定化菌与发酵液体积比1:2，产酸速度0.8g/L.h酒精转酸率75%，发酵周期42小时采用连續分割流加50%体积的发酵液可实现连续发酵，发酵时间24小时可维持产酸速度0.72g/L.h酒精转酸率74%。
　　苹果汁采用固定膜醋酸发酵发酵可在60小时內完成，但发酵效率明显低于流动膜发酵影响产酸速度、酒精转酸率、酸度等发酵结果的主要因素是通气状况和发酵液流动的均匀程度。采用吸附法固定膜由醋醅中分离得到的酿醋时加入的菌种有哪些比AS1.41有更好的适应性。
　　通过以上实验和结果分析比较得出结论：
　　苹果原汁采用深层醋酸发酵及固定化醋酸发酵技术可酿造出具有苹果酸味、香气及色泽特征的优质果醋试验分离得到并鉴定出三株醋酸菌，并筛选出最适于苹果醋酿造的优势醋酸菌株
　　在比较苹果汁的发酵方法时，发现使用苹果汁分批发酵接种量和酒精度对工艺嘟有影响，接种量过小影响发酵周期，接种量过大酸度变化明显，不利于控制发酵酒精度越低，发酵周期越短过了产酸高峰后，隨酒精度降低酸度升高醋酸发酵强度减弱。而采用苹果汁固定化发酵过程中发酵周期比分批发酵周期短，适合流动膜固定化发酵流動膜固定化发酵的产酸速度、酒精转化率都高于固定化膜发酵和分批发酵。所以果醋生产最好采用固定化发酵，周期短酒精转化率高，便于控制发酵
　　[5]张桂霞.酿酒制醋技术与实例[M].化学工业出版社，20061.
　　[7]陆寿鹏.酿造工艺[M].高等教育出版社，20021.

2.Φ科3.951#米曲霉，能分泌各种酶类

3.B.F.7658，能分泌淀粉酶使淀粉液化产生糊精。

4.中科2.109# 酵母菌能分泌酒化酶，将糖类转化为酒精和二氧化碳

重庆市第十一中学高中学生金生茬做实验（受访者供图）

 　 每到水果收获季节，总有大量残次水果因卖不出去而被丢弃这既让很多果农痛心不已，也污染了环境不過，重庆市第十一中学高中学生金生培育出来的两种新的发酵酿醋时加入的菌种有哪些却有望把残次柠檬果酿制成酒和醋，实现变废为寶
　　12月12日，西大附中老师李九彬证实：这两种新的发酵酿醋时加入的菌种有哪些分别是柠檬蒸馏酒发酵专用酵母菌菌株和柠檬醋酸發酵专用醋酸菌菌株。目前它们已经通过中国微生物酿醋时加入的菌种有哪些保藏管理委员会普通微生物中心检测，并得到了认可分別被命名为柠2.1709和柠1.1709。该中心还给金生颁发了保藏证书
　　金生自小就有较强的环保意识和创新意识。今年年初他偶然在四川安岳柠檬基地发现大量柠檬残次果被随意丢弃时，便产生了这一想法
　　开始时，金生选用市面上常用的意大利进口活性干酵母菌和国产优质活性醋酸酿醋时加入的菌种有哪些分别用于酿制柠檬蒸馏酒和果醋的实验。但这两种酿醋时加入的菌种有哪些作用于柠檬上酒和醋的产絀率都太低，没有达到预期效果
　　买来的酿醋时加入的菌种有哪些不行，金生就自己培育今年1月份，他一直待在十一中实验室和西喃大学三峡库区生态环境教育部重点实验室等几个实验室里从头开始做。在杨廷元、蔡亮等老师的指导下他经过大量实验和长时间观測，终于培育出了上述两种酿醋时加入的菌种有哪些
　　实验证明，与国内外同类优质发酵酿醋时加入的菌种有哪些相比这两个酿醋時加入的菌种有哪些具有发酵时间更短的优点——发酵时间仅需1个月，而同类酿醋时加入的菌种有哪些至少需3个月以上同时，用这两种菌酿出来的酒和醋纯度也更高。
　　“未来这两种新酿醋时加入的菌种有哪些如果能顺利实现成果转化，有望创造良好的经济效益与環保效益”李九彬认为，用柠2.1709能酿制出风味独特的柠檬蒸馏酒有望帮助果农找到柠檬残次果和滞销果的销路，并因此避免柠檬果被随意丢弃所造成的环境污染；在酿制水果蒸馏酒时产生的蒸馏废液会污染土壤和水体，但有了柠1.1709可用蒸馏废液作为原料，以其中的酒精為发酵底物酿制柠檬醋
　　西南大学生命科学学院、重庆大学生命科学学院专家也非常认可金生的研究成果，并于今年6月推荐金生参加苐18届“明天小小科学家”活动西南大学生命科学学院研究员谢建平博士在推荐表中评价道：金生从果农面临的实际问题出发，提出了一種运用微生物对柠檬残次果的多重再利用方法此项研究具有较好的社会效益和应用前景。
　　近年来为培养具有科学潜质的科技创新後备人才，增强自主创新能力我国越来越重视培养学生的创新意识和创新能力。许多中学都建起了实验室供学生做科学实验不少高校實验室也向高中生敞开大门，并有教授对他们进行专门指导
    “这种背景下，金生能够取得这样的研究成果除了他从小就有较强的创新意识、动手能力外，更得益于良好的教育环境和学校对科技创新的重视”李九彬说。