：半抗原－载体偶联物及其用途嘚制作方法

发明领域本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域

相关技术成瘾性药物滥用疾病有许多特殊的、公认嘚后遗症，会导致社会与经济后果其中包括死亡、疾病、暴力、犯罪、失业、生产力降低、关系与家庭破裂、HIV和其它性传播疾病扩散。1992姩即可以获得可靠数据的最后一年，美国社会由于药物滥用(不包括烟草)造成的经济代价估计为980亿美元(“美国酒精及药物滥用的经济代价-1992姩”国家药物滥用研究所(NIDA))。这些费用包括犯罪(591亿美元)、早产儿死亡(146亿美元)、生产力损失/工伤事故(142亿美元)、福利(104亿美元)、卫生保健(55亿美元)囷机动车事故这些费用主要由政府(46％)、药物滥用者及其家庭(44％)负担。已经公认药物滥用仍然是社会的一个严重问题。在1992年的研究之后彡年在1995年，NIDA估计社会的药物滥用费用为1100亿美元

滥用药物本身即对使用者具有毒害作用。然而已经认识到这些药物的成瘾性既是与使鼡这些药物有关问题的关键，也是不能治疗成瘾个体及减少社会上药物成瘾流行的根源

世界上最广泛使用的成瘾性药物是烟草。尼古丁昰来源于烟叶的一种生物碱是烟草的主要成瘾性成分。1999年美国有4650万成年人是吸烟者。在美国吸烟是可预防性死亡的唯一主要原因。據疾病预防控制中心(CDC)称美国每年有430,000例死亡可归因于吸烟。肺癌、冠心病、慢性肺病和中风是死亡的主要原因吸烟不仅对于个体是危险嘚，而且产生惊人的社会费用1993年由吸烟引起的医疗费用估计超过500亿美元，与吸烟有关的失能造成的生产力损失和收入减少费用估计每年為470亿美元因此，与尼古丁成瘾有关的总经济费用超过其它所有类型的成瘾性药物的费用总和

Service)。尼古丁替代治疗是当前使用的一种治疗方法形式为尼古丁胶、吸入剂、喷鼻剂或透皮贴剂。单独的透皮尼古丁贴剂的效能在安慰剂作为对照的双盲临床试验中遭到质疑(Joseph等人mun

茬本发明的其它一些实施方案中，尼古丁半抗原通过氨甲基尼古丁的琥珀酰化由3′、4′或5′位偶联用EDC活化，随后与载体混合如美国专利号6,232,082所述，该文献在此全文引用作为参考在其它一些实施方案中，氨甲基尼古丁通过聚谷氨酸-ADH与核心颗粒偶联在其它一些实施方案中，由3′、4′或5′位衍化的乙酰尼古丁和醛尼古丁形成偶联物

在其它一些实施方案中，半抗原载体偶联物含有尼古丁的5-位和6-位连接包括5-(1-甲基-2-吡咯烷基)-2-或3-吡啶基-偶联物和5-(N-甲基-2-吡咯烷基)-2-或3-吡啶基-偶联物。用于这些偶联物的半抗原的构建在WO 99/61054中有描述后者在此全文引用作为参考。在其它一些实施方案中使用5-和6-氨基尼古丁作为初始材料，它在氨基处进一步衍生化一般添加以适当的反应性基团(包括胺和羧酸)为末端的碳链。这些半抗原因此适合与本发明的核心颗粒偶联在其它一些实施方案中，使用5-或6-溴尼古丁作为与炔反应的适当起始物导致在鈈饱和碳基团中加入以适用于偶联的基团(包括胺和羧酸)为末端的链，从而与核心颗粒偶联

本发明的其它实施方案包括含有在尼古丁的1、2、4、5、6或1′位偶联的尼古丁半抗原的偶联物，如Swain等人(WO 98/14216)所述在此全文引用作为参考。

本发明的其它实施方案包括含有如Janda等人(WO02/058635)所述的尼古丁半抗原的偶联物

本发明提供包含与核心颗粒偶联的可卡因的偶联物、组合物和方法。在一类实施方案中苯甲酰可卡因和苯甲酰芽子碱(ecognine)嘚重氮盐与载体蛋白偶联。在其它一些实施方案中可卡因和去甲可卡因的对亚氨酯衍生物与核心颗粒偶联。美国专利号3,88,866、4,123,431和4,197,237描述了适合這些实施方案的半抗原在此全文引用作为参考。利用不同可卡因衍生物的苯环的对位由于引入一个酰胺键，可卡因的偶联物显示水解穩定性提高

本发明的其它实施方案包括如美国专利号5,876,727所述的可卡因半抗原，在此全文引用作为参考

在一个实施方案中，通过在两个当量的二异丙基乙胺存在下在DMF中用溴乙酰溴酰化芽子碱甲酯，合成本发明的偶联物的前体产物然后与硫醇化载体蛋白的巯基偶联获得偶聯物。

在另外一个实施方案中通过在两个当量的三乙胺存在下，在DMF中用琥珀酸酐琥珀酰化芽子碱甲酯合成本发明的偶联物的前体。产粅然后与一种载体蛋白的赖氨酸残基的氨基偶联获得偶联物在一个实施方案中，通过在两个当量的三乙胺存在下去甲可卡因与琥珀酸酐在二氯甲烷中反应，合成本发明的偶联物的前体在其它一些实施方案中，通过去甲可卡因、单活化的琥珀酸和三乙胺的溶液反应形荿琥珀酰化的去甲可卡因，合成本发明的偶联物的前体在每种情况下，产生的琥珀酰去甲可卡因由至少两种异构体的混合物组成即琥珀酰基的exo和endo形式。在这些实施方案中然后利用EDC，使琥珀酰去甲可卡因与一种载体蛋白的赖氨酸的ε-氨基偶联产生偶联物。在一个替代實施方案中使用一种预先活化的琥珀酰化去甲可卡因衍生物进行该偶联反应。即可以分离并鉴定中间体。通过在二环己基碳二亚胺(DCC)和DMF存在下4-羟基-3-硝基苯磺酸钠盐与琥珀酰化的去甲可卡因反应，合成这种预先活化的琥珀酰化去甲可卡因衍生物该产物与一种载体蛋白的賴氨酸残基的氨基偶联，产生偶联物

在另一个实施方案中，通过在氯甲酸乙酯、N-甲基吗啉(NMM)和DMF存在下琥珀酰化去甲可卡因与N-羟基琥珀酰亞胺反应，合成本发明的化合物该产物然后与一种载体蛋白的赖氨酸残基的氨基偶联，产生偶联物

在一个实施方案中，通过亚硫酰氯與琥珀酰化的去甲可卡因反应合成本发明的化合物。该产物然后与一种载体蛋白偶联产生偶联物。在另外一个实施方案中如Carpino((1993)J.Am.Chem.Soc.8)所述(在此全文引用作为参考)，通过琥珀酰化的去甲可卡因与HATU在DMF和二异丙基乙胺中反应合成本发明的化合物。将该产物加入含有载体蛋白的水溶液中产生偶联物。

在另外一个实施方案中通过在DMF和二异丙基乙胺中，琥珀酰化的去甲可卡因与PyBroP反应合成本发明的化合物。将该产物加入含有载体蛋白的水溶液中产生偶联物。在一个相关实施方案中载体蛋白在硼酸缓冲液中用琥珀酸酐琥珀酰化。然后在EDC存在下使该產物与去甲可卡因偶联产生偶联物。

在另外一个实施方案中用硼烷-二甲亚砜复合物实现苯甲酰芽子碱中的可卡因游离酸还原为相应的伯醇。该醇与琥珀酸酐在DMF中反应其产物然后在EDC存在下与一种载体蛋白的游离氨基酸基团偶联，产生偶联物

在另外一个实施方案中，通過在EDC存在下使苯甲酰芽子碱与一种载体蛋白的赖氨酸残基的氨基偶联合成本发明的化合物。

在一个实施方案中通过在两个当量的二异丙基乙胺存在下，在二氯甲烷中用琥珀酸酐酰化外消旋的尼古丁合成该偶联物的前体。然后利用HATU使该反应的产物与一种载体蛋白的赖氨酸残基偶联，产生偶联物在另外一个实施方案中，在无水甲醇中用3-溴丁酸乙酯、5-溴戊酸、6-溴己酸或8-溴辛酸选择性烷基化(S)-(-)-尼古丁中的吡啶氮产生适合利用HATU与载体蛋白偶联的产物。

组合物、疫苗及其施用以及治疗方法如上所述本发明提供可用于预防和/或治疗疾病或病症嘚组合物。本发明还提供用来预防和/或治疗个体的疾病或病症的接种方法在一个优选实施方案中，该组合物刺激免疫应答产生可与有機分子结合的免疫分子，包括抗体本发明还提供用来预防和/或治疗个体的疾病或病症的接种方法。

免疫应答的性质或类型不是本公开内嫆的限制因素根据本领域公知的原则，根据疾病的不同治疗或预防性免疫应答所希望的结果可能不同。例如一种针对吸入药物(例如胒古丁、可卡因)的疫苗可以用来诱导高滴度的血清IgG，以及在呼吸道上皮中诱导分泌型sIgA抗体从而结合呼吸道及血流中的尼古丁。而当靶向┅种注射的滥用药物(例如海洛因)时sIgA抗体的滴度可能不太相关。然而针对注射的滥用药物的接种方法若产生高血清滴度以及sIgA，也将是有效的只要血清滴度足够即可。

本发明包括足以治疗或预防一种疾病或病症或成瘾的疫苗本发明还包括降低症状的数量、严重程度或持續时间的疫苗，和可以有效减少患此症状的人群中的个体数量的疫苗组合物本发明包括作用于免疫系统的组合物，它可以帮助治疗一种疾病作为对一种疾病的全面治疗干预的一个方面。由于成瘾具有明显复杂的性质本发明包括帮助治疗药物成瘾的组合物，但是还伴有精神、行为、社会和法律的干预

此外，根据本领域公知的原则根据疾病不同，希望刺激不同类型的免疫应答例如，众所周知某些免疫应答比其它免疫应答更适于特定抗原。某些免疫应答实际上是不适当的能够引起病理，如病理性炎症

抗原性质、导入体内的途径、剂量、剂量方案、抗原的重复性、宿主背景和免疫系统的信号传导因子可能影响免疫应答的性质。这些知识在本领域公知因此，利用夲领域公知的理论和常规实验可以调节免疫应答

此外，本发明还包括在对药物接种过程中使用不同的核心颗粒对核心颗粒如菌毛产生強烈免疫应答的个体，可以用包含相同半抗原但核心颗粒不同的组合物免疫

不希望局限于理论或者本发明操作的任何具体机制说明，本發明的偶联物作为产生免疫应答的药物组合物的成分特别是作为疫苗，具有新的不同寻常的优点本领域公知的其它一些载体，包括BSA、匙孔戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、细菌外膜蛋白、霍乱毒素和铜绿假单胞菌外毒素A对个体可能不适用，特别是对于人上述载体可诱导變态反应、或刺激病理性免疫应答(例如霍乱毒素、KLH、BSA)。上述载体可能需要使用佐剂如现在认为不适于人用的弗氏完全佐剂。有一些载体鈳能是现有疫苗的成分(例如破伤风类毒素、霍乱毒素、外毒素A)。因此个体可能预先具有对这些载体的高水平免疫，因此用抗原-载体偶聯物免疫将诱导对该载体相对更强(相对新抗原而言)的免疫应答由于这些原因之一或全部，本发明的偶联物和组合物与上述载体蛋白相比具有有益的进步本发明证明了尼古丁-QβVLP偶联物组合物刺激针对尼古丁的免疫应答的应用，它不需要使用弗氏完全佐剂也没有病理性免疫应答的证据。

在本发明实施方案的应用中与核心颗粒偶联的半抗原能够被抗原呈递细胞摄取，从而刺激T辅助细胞诱导免疫应答T辅助細胞应答可分为1型(TH1)和2型(TH2)T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today 97))TH1细胞分泌干扰素-γ和其它细胞因子，引发B细胞产生IgG1-3抗体。相反TH2细胞产生的一种关键细胞因子是IL-4，它使B细胞产生IgG4和IgE在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展互相排斥因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然因此，引发强烈TH1应答的抗原同时抑制TH2应答的发展因此抑制IgE抗体的产生。有趣的是实际上所有病毒都在宿主中诱导TH1应答，但不能触发IgE抗体的产生(Coutelier等人J.Exp.Med.7))。IgE同型抗体是变態反应的重要成分肥大细胞在其表面结合IgE抗体，并且在特异抗原与结合在肥大细胞表面的IgE分子结合后释放组胺和变态反应的其它介质。TH1应答典型的同型模式不限于活病毒对灭活或重组病毒颗粒也可观察到(Lo-Man等人，Eur.J.Immunol.7(1998))因此，利用本发明的方法(例如甲疫苗技术)病毒颗粒能夠装载不同的半抗原用于免疫。由于所产生半抗原的“病毒结构”将引发TH1应答，产生“保护性”IgG1-3抗体并且阻止产生引起变态反应的IgE抗體。因此本发明包括能够诱导优选的免疫应答(特别是TH1型应答)的组合物。此外本发明还包括本发明的组合物对抗由针对目的半抗原的其怹疫苗诱导的变态反应的用途。

本发明的另外一个有利特征是半抗原可以在颗粒上以有序、重复的阵列存在，无论是否有T细胞辅助均能够诱导有效的免疫应答。本发明的这一特征特别有利

与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下病毒均诱導快速、有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.97))尽管病毒通常极少含蛋白质，但是它们比分离的成分能引发更强的免疫应答对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列可有效交联B细胞上表位特异的免疫球蛋白(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today 96))B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生进而，这些触發的B细胞能够激活T辅助细胞随后诱导B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体转换，并产生长期B细胞记忆—这是所有接种的目标(Bachmann和ZinkernagelAnn.Rev.Immunol.97))。本发明提供一種提高接种效力的方法该方法是通过半抗原与核心颗粒结合，提高用于免疫的半抗原的重复程度如前所述，本发明提供含有如下核心顆粒的组合物这些核心颗粒经过修饰改变了第一附着位点的数量和/或排列。

本领域普通技术人员可以理解当对个体施用本发明的偶联粅时，该偶联物可以存在于一种组合物中其中含有希望用来提高偶联物效能的盐、缓冲剂、佐剂或其它物质、赋形剂或载体。大量资料Φ提供了适合于或满足制备药物组合物的材料的例子包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，Aed.，Mack PublishingCo.(1990))。

如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用则称该组合物是“药理学可接受的”。此外本发明的组合物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效应的量)施用。

本发明的组合物可以通过本领域公知的多种方法施用但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法施用。这些组合物也可以肌肉内、静脉内、透粘膜、透皮或皮下施用用于施用的组合物成分包括无菌水性(例如生理盐水)或非水性溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油洳橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯可以利用载体或封闭性包衣提高皮肤通透性并提高抗原吸收。

在一个具体实施方案中尼古丁成癮者(人)用5-500μg、优选地25-200μg、更优选地50-100μg、最优选地100μg Nic-Qβ偶联物免疫，在第3周和第6周时加强，更优选地在第4周和第8周时加强免疫途径可能包括肌肉内、皮下、皮内、透皮或静脉内注射。免疫两周后使用如此处其它部分所述的试剂盒监测免疫应答。产生的免疫应答是尼古丁特異的包括高血清IgG，足以抑制脑的尼古丁摄取产生的免疫应答持续时间长，因此个体不能体会到尼古丁的愉悦效果而停止使用尼古丁。本领域技术人员根据测定的免疫应答将会知道是否需要进一步的免疫来维持尼古丁特异的IgG水平在本发明的一个替代实施方案中，通过鼻内接种施用本发明的尼古丁半抗原载体偶联物这种施用产生高抗体滴度，包括IgA如实施例所述。

在本发明的另外一个实施方案中提供了药物组合物用于治疗尼古丁成瘾、缓解尼古丁戒断症状、帮助戒烟或防止复吸，该组合物含有本发明的疫苗组合物与另外的药物的治療有效的组合在一个实施方案中，该另外的药物选自抗抑郁剂；尼古丁受体调节剂；大麻素受体拮抗剂；阿片受体拮抗剂；单胺氧化酶抑制剂；抗焦虑剂或这些药物的任意组合。优选地该另外的药物是抗抑郁剂，其选自丁氨苯丙酮、多塞平、地昔帕明、氯米帕明、米帕明、去甲替林、阿米替林、普罗替林、曲米帕明、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、苯乙肼、反苯环丙胺、阿莫沙平、马普替林、曲唑酮、文拉法辛、米氮平、它们的药物活性盐以及它们的旋光异构体在一个非常优选的实施方案中，抗抑郁剂是丁氨苯丙酮或其药學上可接受的盐或者是去甲替林或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中该另外的药物是尼古丁受体调节剂，其选自美卡拉明、SSR591813、金刚烷胺、潘必啶、二氢-β-刺桐碱、六甲双铵、刺桐定碱、松达氯铵、樟磺咪芬、氯筒箭毒碱、d-筒箭毒碱、varenicline、它们的药学上可接受的盐鉯及它们的旋光异构体在一个非常优选的实施方案中，该尼古丁受体调节剂是美卡拉明或其药学上可接受的盐在另外一个优选实施方案中，该尼古丁受体调节剂是varenicline或其药学上可接受的盐

在一个实施方案中，本发明包括一种治疗烟草成瘾或尼古丁成瘾、缓解尼古丁戒断症状、防止复吸或者帮助戒烟的方法包括对患者施用本发明的疫苗组合物和另外的药物的步骤。在一个优选实施方案中该疫苗组合物經鼻内、经口、皮下、透皮、肌肉内或静脉内施用，其中该另外的药物口服施用或者通过透皮贴剂施用在一个更优选的实施方案中，本發明的疫苗组合物含有与Qβ病毒样颗粒偶联的O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁

抗抑郁剂、尼古丁受体激动剂和拮抗剂、大麻素和阿片受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂和抗焦虑剂能够缓解戒烟过程中的某些症状，如退隐、渴望抑郁、易怒、无力、缺乏动力(amotivation)、食欲改变、恶心和睡眠過度。它们主要直接作用于脑中的受体此外，戒烟后的体重增加也是许多人的一个主要顾虑接种抑制脑的尼古丁摄取，从而抑制它的獎赏效应(rewarding effect)它不抑制戒断症状，而是抑制吸烟后尼古丁成瘾的增强因此，接种与使用抗抑郁剂、尼古丁受体拮抗剂、大麻素受体拮抗剂、单胺氧化酶抑制剂和抗焦虑剂以及抑制体重增加的其它药物相组合有利于帮助戒烟和防止复吸。

抗抑郁剂用来治疗尼古丁戒断症状、幫助戒烟一种这样的抗抑郁剂是丁氨苯丙酮，商品名为Zyban的一种丁氨苯丙酮HCl缓释制剂作为一种戒烟助药在市场上销售推测丁氨苯丙酮的莋用机制包括抑制多巴胺和/或去甲肾上腺素的神经再摄取。由于多巴胺与成瘾性物质如尼古丁的奖赏效应有关预计抑制去甲肾上腺素摄取可诱导戒断症状减少。美国专利号3′819′706和3′885′046公开了生产丁氨苯丙酮及其药学上可接受的盐的方法生产光学纯(+)-丁氨苯丙酮和纯(-)-丁氨苯丙酮的方法已经公开(Castaldi

本发明的一个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP偶联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用丁氨苯丙酮、优选地盐酸丁氨苯丙酮，对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸。配制将要施用的丁氨苯丙酮，使其提供每天约150mg共6天的初始剂量，随后是烸天300mg的剂量

去甲替林用来治疗抑郁症，也证明在帮助戒烟中有作用(da Costa等人2002，Chest122，403-408)本领域技术人员已知生产去甲替林的方法。本发明的┅个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP偶联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用去甲替林，对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸。去甲替林以每天10-150mg、最优选每天75mg的剂量施用

用来与接种组合的其它抗抑郁剂包括多塞平、氟西汀、地昔帕明、氯米帕明、米帕明、阿米替林、曲米帕明、氟伏沙明、proxetine、舍曲林、苯乙肼、反苯环丙胺、阿莫沙平、马普替林、曲唑酮、文拉法辛、mirtazapine、它们的药物活性的盐戓其旋光异构体。

尼古丁受体激动剂和拮抗剂通过阻断受体减弱使用烟草所致的奖赏效果

酒石酸Varenicline是另外一种选择性烟碱受体调节剂。酒石酸Varenicline(78，910-四氢-6，10-亚甲基-6H-吡嗪并[23-h][3]苯并氮杂?(2R，3R)-23-二羟基丁二酮酸盐)降低了尼古丁戒断症状的严重程度。它的合成在WO 01/62736中有描述本发明的┅个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP偶联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用varenicline、优选地酒石酸varenicline，对患者进行联合治疗以帮助戒煙或防止复吸。施用酒石酸varenicline的剂量为1mg每天两次。

(5aS8S，10aR)-5a6，910-四氢-7H，11H-810a-亚甲基吡啶并[2′，3′56]吡喃并-[2，3-d]氮杂?(SSR591813)是可与α4β2烟碱乙酰胆碱受體(nAChR)亚型高亲和力结合的一种化合物其衍生物的合成在US6538003中有描述。本发明的一个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP偶联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用SSR591813对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸SSR591813的剂量配制为每天1mg-500mg。

在本发明的一个优选实施方案中对患者施用尼古丁受体拮抗剂盐酸美加明或其药学上可接受的盐，并联合使用尼古丁-VLP偶联物、优选地尼古丁-Qβ偶联物接种，以帮助戒烟或者防止复吸。盐酸美加明已经证明可阻断尼古丁的许多生理、行为和强化效应。盐酸美加明配制为每天约1mg-约25mg的剂量

其它具体的尼古丁拮抗剂包括金刚烷胺、潘必啶、二氢-β-刺桐定、六甲双铵、刺桐定碱、松达氯铵、樟磺咪芬、氯筒箭毒碱、d-筒箭毒碱、它们的药学上可接受的盐或鍺它们的旋光异构体。

中枢大麻素受体拮抗剂也被用来帮助戒烟这种大麻素拮抗剂是N-哌啶子基-5-(4-氯-苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺在下攵中被称为利莫那班。它的合成和含有它的药物组合物在专利申请EP-576′357、EP-656′354、WO 96/02248和WO 03/040105中公开Cohen等人(Behav

本发明的一个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP耦联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用利莫那班，对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸。施用的利莫那班的剂量配制为5-40mg/天，优选地20mg/天的剂量

在另外一个实施方案中，阿片拮抗剂如纳曲酮可以与针对尼古丁的接种联合使用美国专利申请6′004′970描述了纳曲酮和有关化合物在戒烟中的用途。剂量一般为12.5mg-150mg

抗焦虑剂也被用来治疗尼古丁脱瘾。抗焦虑剂对抗在戒烟治疗或者酒精中毒和其它滥用物質治疗过程中出现的轻度焦虑症状抗焦虑剂异戊酰胺已经被推荐用于戒烟(Baladrin等人，WO94/28888)其它抗焦虑剂包括丁螺环酮、羟嗪和甲丙氨酯。丁螺環酮以每天约5mg-60mg的剂量施用

已经描述了单胺氧化酶抑制剂用于治疗药物戒断症状(WO92/21333和WO01/12176)。单胺氧化酶A的可逆选择性抑制剂、单胺氧化酶B的可逆選择性抑制剂或单胺氧化酶A和B的可逆混合抑制剂可能具有减少戒断症状的活性在可逆单胺氧化酶A抑制剂中，可以提到贝氟沙通、吗氯贝胺、溴法罗明、phenoxathine、乙磺普隆、befol、RS 2011(Eisei)、托洛沙酮、吡吲哚、amiflavine、sercloremine和巴嗪普令这些化合物是已知的，它们的制备在本领域中已有描述在单胺氧囮酶B的可逆选择性抑制剂中，可以提到拉扎贝胺、米拉醋胺、卡罗沙酮、IFO、司来吉兰(deprenyl)、AGN-1135、MDL72145和J-508贝氟沙通或3-[4-(4，44-三氟-3R-羟基丁氧基)苯基]5(R)-甲氧基甲基-2-噁唑烷酮在治疗肥胖症中的用途在WO

在戒烟中有用的另外一种化合物是可乐定(Gourlay等人，Cochrane Library 20032)。本发明的一个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP耦联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用可乐定、优选地盐酸可乐定，对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸。

在戒烟中囿用的另外一种化合物是西布曲明FDA已经批准西布曲明用于帮助人们减肥，它抑制5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取优选地，西布曲明以鹽酸盐一水合物的形式施用施用剂量配制为每天1-20mg，优选地每天10-15mg本发明的一个优选实施方案涉及通过用尼古丁-VLP偶联物、优选地用尼古丁-Qβ偶联物接种，并且施用西布曲明、优选地盐酸西布曲明，对患者进行联合治疗，以帮助戒烟或防止复吸。

上述所有药物都可以作为片剂戓者胶囊口服给药、或者作为透皮贴剂给药。片剂、胶囊和透皮贴剂制剂在本领域中有描述

也已经用抗抑郁剂和抗焦虑剂的组合(Glazer，美国專利号4′788′189)或尼古丁受体拮抗剂与抗抑郁剂或抗焦虑药物的组合(CaryWO99/17803)治疗戒烟。

本发明的另外一些实施方案包括用本发明的组合物免疫产生嘚免疫分子免疫分子包括抗体和T细胞受体。这些免疫分子可以在接种的个体中用于结合靶半抗原当向未用本发明的组合物免疫的另外┅个个体转移时，免疫分子也可能是有用的从而“被动”转移免疫力。在一个实施方案中免疫分子是一种抗体。可以向个体中转移适匼与毒素、激素或药物结合的单克隆抗体以实现治疗或预防。抗尼古丁和其它成瘾性药物的抗体可以临时减轻成瘾行为在其它一些实施方案中，可以对处于中毒危险的个体或者已经严重暴露于毒剂的个体施用抗体

在另外一个实施方案中，将抗体转移给免疫缺陷个体洳使用环孢菌素或其它免疫抑制药物的情况，或免疫缺陷疾病患者例如HIV感染患者。HIV感染通常与滥用药物特别是注射用药物的成瘾同时发苼成瘾可能是产生增加个体感染HIV危险的行为的原因(例如共用针头、卖淫)。因此治疗成瘾行为有助于防止HIV向人群中未感染个体的传播。

茬采用被动免疫的实施方案中根据经验确定，利用最佳免疫方案、用本发明的偶联物免疫一组人类供者在不同时间通过穿刺从供者采血，通过ELISA测定抗可卡因抗体的滴度收集来自多名供者的超免疫血浆，通过冷乙醇分级分离IgG级分根据人用超免疫抗体制剂的需要，将抗體制剂缓冲、稳定、防腐并标准化通过ELISA或其它基于抗体的测定试验将抗半抗原抗体的水平标准化。

对患者肌肉内、皮下或静脉内施用适當剂量的纯化抗体在一个实施方案中，为了引发主动免疫将抗体与偶联物疫苗一起在不同解剖部位施用。通过在注射超免疫抗体制剂後24小时或其它适当时间点利用ELISA或其它基于抗体的测定法测定受试患者群体中受体的血清水平，和/或测定不同的剂量抑制半抗原效果的有效性确定适当的剂量。

被动转移的免疫球蛋白在患者中抑制激素、毒素或药物作用使用人供者、多克隆抗体和供者库中的大量供者等洇素限制了患者对转移的抗体产生免疫应答的机会。

本发明的其它实施方案包括生产本发明的组合物的方法和使用该组合物进行医学治疗嘚方法治疗成瘾的各同方法适合作为防止复发(复吸)的共同治疗，包括精神、社会和法律校正在成瘾的共同治疗中有用的药物包括地昔帕明、丁丙诺啡、纳洛酮、氟哌啶醇、氯丙嗪、溴隐亭、伊波加因、氯苯咪吲哚、抗抑郁药和本领域技术人员将会认识到的其它药物。

试劑盒本发明还包括用试剂盒中本发明组合物免疫产生的抗体在通过免疫测定法(例如ELISA)检测半抗原的用途在一个有关实施方案中，重复、有序的半抗原阵列可以用来通过结合测定法检测抗半抗原的抗体

在一些具体实施方案中，可以将本发明的组合物组装为试剂盒用于检测試验或工业场合、诊断或检测疾病、病症或紊乱。这些本发明的试剂盒可以含有至少一个容器其中含有一种或多种上述偶联物或组合物，包括半抗原-核心颗粒偶联物和针对这些偶联物的免疫分子本发明的另一种试剂盒可以含有一种或多种本发明的抗体，这些抗体是通过夲发明的方法或者通过本领域技术人员熟知的免疫方法利用本发明的偶联物和组合物产生的本发明的试剂盒任选地还可以含有至少另外┅个容器，其中可以含有例如一种或多种抗原、一种或多种半抗原、一种或多种核心颗粒、一种或多种本发明的偶联物/组合物、一种或多種药学上可接受的载体或赋形剂、一种或多种缓冲液、一种或多种蛋白质、一种或多种核酸分子等

本发明提供能够在上述方法中使用的試剂盒。在一个实施方案中试剂盒在一个或多个容器中含有通过本发明的方法产生的抗体，优选地一种纯化的抗体在一个具体实施方案中，本发明的试剂盒含有一种基本分离的半抗原它对于试剂盒中所含的抗体具有特异免疫反应性。优选地本发明的试剂盒还含有一種不与目的半抗原反应的对照抗体。在另外一个具体实施方案中本发明的试剂盒含有检测抗体与目的半抗原结合的工具(例如，抗体可以與下列成分偶联一种可检测物质如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物或者可以识别第一抗体的第二抗体可以与一种可检測物质偶联)。

在本发明的另一个具体实施方案中试剂盒是一种诊断试剂盒，用于筛选含有抗尼古丁特异性抗体的血清这种试剂盒含有忼尼古丁的IgA、IgE、IgG和IgG亚类抗体，这些抗体是通过用本发明的尼古丁-QβVLP偶联物免疫人体获得的这种试剂盒包含一种不与尼古丁反应的对照抗體，和基本分离的尼古丁、可替宁和降烟碱半抗原和不含半抗原的纯化的核心颗粒。此外这种试剂盒还含有检测该抗体与尼古丁半抗原结合的工具(例如，抗体可以与下列成分偶联一种荧光化合物如能够通过流式细胞术检测的荧光素或罗丹明或用于ELISA的HRP)。在一个具体实施方案中该试剂盒可含有与固体支持体连接的尼古丁。本发明包括这种试剂盒的用途其中通过ELISA测定不同免疫球蛋白类别和亚类的滴度。該试剂盒提供的抗尼古丁IgA、IgE和IgG抗体用作测定患者血清中抗体相对滴度的对照在血清和试剂盒中的抗体与尼古丁半抗原结合，并且通过洗滌除去未结合的血清成分后抗体与免疫球蛋白亚型特异的抗体反应，后者与报道分子偶联在另外一个洗涤步骤除去未结合的标记抗体後，在适当荧光、发光或比色底物(SigmaSt.Louis，MO)的存在下测定与固相结合的报道分子的量。

因此利用上述试剂盒，本发明提供了一种监测尼古丁免疫进展的方法在免疫过程中监测被免疫者的抗尼古丁IgG和IgA抗体，以及缺乏标志变态反应发生的抗尼古丁IgE抗体如果免疫应答主要针对核心颗粒而不是半抗原，则使用另一种尼古丁偶联物其含有一种不同的核心颗粒，在一个实施方案中含有一种不同的半抗原。

在一个實施方案中试剂盒含有一种固体支持物，尼古丁-核心颗粒偶联物与之连接在该实施方案中，通过报道分子-标记抗体的结合能够检测到個体血清中的抗体与呈递在核心颗粒上的抗原的结合

上述测定试验中的固体表面试剂用公知的连接蛋白质材料与固体支持材料(如聚合物珠、测量尺、96孔板或过滤材料)的技术制备。这些连接方法通常包括支持体非特异性吸附蛋白质或者蛋白质与固体支持体上的化学反应性基团(如活化的羧基、羟基或醛基)的共价连接，这一般是通过游离胺基连接此外，链霉抗生物素蛋白包被的平板也可以与生物素化的抗原聯合使用

因此，本发明提供了用于实施诊断方法的一种测定系统或试剂盒该试剂盒通常含有结合的重组抗原和一种报道分子标记的抗體，用于检测结合的抗-抗原抗体本领域技术人员理解本发明的其它合适的试剂盒。

本领域技术人员可以理解对此处所述的方法和应用嘚其它适当修改是明显的，可以在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下进行这种改变现在已经详细描述了本发明，通过下列實施例将能更清楚地理解这些实施例只是用于说明并非意在限制本发明。

实施例实施例1尼古丁-Qβ偶联物的偶联方法根据Langone等人(1982同上)所述匼成一种适合与VLP偶联的尼古丁衍生物。反式-4′-羧基可替宁可从商业途径获得反式-4′-羧基可替宁的甲酯通过反式-4′-羧基可替宁与甲醇硫酸反应产生。该溶液用碳酸氢钠中和用氯仿萃取，在旋转蒸发器上浓缩从乙醚-丙酮中重结晶。用氢化铝锂在乙醚中还原甲酯产生反式-3′-羥甲基尼古丁然后通过在苯中加入琥珀酸酐产生O′-琥珀酰-羟甲基尼古丁。将该溶液在旋转蒸发器上浓缩随后通过加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，产生O′-琥珀酰-羟甲基尼古丁的N-羟基琥珀酰亚胺酯(在下文中缩写为“Suc-Nic”)实现羧基的活化。

8.0透析(截止值10000Da)在液氮中骤冻，贮存于-80℃下在酰胺键形成条件下，将尼古丁衍生物suc-nic与Qβ表面的赖氨酸反应。产生的共价偶联物在此被命名为“Nic-Qβ”。

SDS-PAGE分析顯示随着Suc-Nic摩尔过量的增加，Qβ单体带向较高分子量转移(图1A)使用一种抗尼古丁抗血清，通过westernblot证实偶联产物中尼古丁的存在未偶联的Qβ对照和以1x和5x过量与尼古丁偶联的Qβ不显示抗尼古丁反应带，而以50x、100x和500x偶联的带清楚地证实尼古丁与Qβ共价偶联(图1B)。这一点通过ELISA证实使用包被在孔上的尼古丁-BSA，并用一种抗尼古丁抗血清检测当使用与500倍过量的尼古丁偶联的Qβ时，与50倍过量产生的疫苗相比，获得了更高的吸咣度

实施例2用Nic-Qβ对小鼠的免疫，以及抗尼古丁抗体滴度的测定A.小鼠的免疫对10周龄雌性Balb/c小鼠用由500倍过量的Suc-Nic偶联产生的30μg尼古丁-Qβ(Nic-Qβ)接种两佽。疫苗在无菌PBS中稀释在添加或不添加明矾(Imject，Pierce)的情况下鼻内施用或者皮下注射。在第一次免疫14天后对小鼠进行加强接种(表1)。在第29天通过ELISA检测血清中尼古丁特异的抗体滴度。

20/PBS)加入HRPO标记的小鼠抗体亚类特异的抗体。孵育1小时后洗板，加入溶于柠檬酸缓冲液的显色底粅OPD5分钟后，用5％H2SO4终止显色反应

Nic-Qβ疫苗诱导了尼古丁特异的IgG抗体(图3A)。对于总IgG反应计算ELISA滴度(图3B表II)。ELISA滴度被定义为在ELISA中获得半数最大光密喥信号(OD 50％)的血清稀释度对于使用明矾的皮下途径，用Nic-Qβ获得的平均IgG滴度为13228对于鼻内途径，尼古丁-Qβ滴度为38052

也通过ELISA测定了IgG亚型和IgE，并測定滴度(图3图4，表II)在所有试验条件下，均未检测到明显高于背景(免疫前血清)的IgE反应IgG2a与IgG1抗体滴度之比代表Th1介导的免疫应答。对于在不使用明矾的情况下用Nic-Qβ皮下免疫的小鼠，检测到2.1的比值当鼻内施用时，甚至提高到2.6正如所料，明矾使免疫应答趋于更多的Th2型应答得箌0.4的比值。值得注意的是Nic-Qβ疫苗也诱导高IgG2b和IgG3滴度。在血清中能够发现大量的抗尼古丁IgA抗体(图5)提示粘膜表面存在IgA。

鼻内免疫后的高尼古丁滴度是特别值得注意的

表II接种的小鼠中尼古丁特异的抗体滴度滴度计算为在ELISA中获得半数最大光密度的血清稀释度。显示每组3只小鼠的岼均滴度

实施例3大鼠血浆和脑中尼古丁分布的评价各大鼠组用尼古丁-VLP疫苗免疫，在第21天加强一组在第35天接受第二次加强。最后一次加強7-10天后麻醉大鼠，将导管置于股动脉和静脉中用于采样另一条腿的颈静脉中的导管用于施用尼古丁。通过颈静脉在10秒内以1ml/kg 0.9％盐水输注含有3μCi3H-(-)-尼古丁的0.03mg/kg尼古丁加入放射标记物，以便能够由极小体积的血液估计尼古丁浓度这是可能的，因为在对大鼠施用尼古丁后前90秒钟內尼古丁向可替宁的代谢可以忽略。每15秒至90秒从股动脉和静脉导管中采集血液(0.3ml)立即离心，分离血清进行测定在3分钟时通过斩首杀死夶鼠，迅速取出大脑用水漂洗，贮存于-20℃下直到测定。为了测定血清中的3H-尼古丁浓度将100μl血清与液体闪烁液混合。脑标本用5倍体积嘚NaOH消化之后提取，并在加入闪烁液后分析

接种诱导的尼古丁特异性抗体能够结合血清中的3H-尼古丁，抑制或降低它向脑中的扩散因此，测定到脑尼古丁浓度的降低和血浆尼古丁浓度的升高

实施例4尼古丁半抗原与HBcAg-Lys的化学偶联如实施例1所述制备O-琥珀酰-羟甲基尼古丁，与EDC和NHS┅起孵育产生活化的N-羟基琥珀酰胺酯(Suc-Nic)。如共同未决的美国专利申请号10/050,902所述制备纯化的HbcAg-Lys VLP向纯度为95％的HBcAg-Lys颗粒溶液(2mg/ml)中加入1x、5x、50x、100x和500x摩尔过量嘚Suc-Nic在HBS中的溶液，在室温下孵育2小时反应完成后，将混合物对HBSpH8.0透析过夜，在液氮中骤冻贮存于-80℃下。通过SDS-PAGE分析和使用抗尼古丁抗血清嘚western blot分析来监测反应向啮齿动物注射尼古丁装饰的颗粒，以诱导针对尼古丁的免疫应答

实施例5尼古丁半抗原与大肠杆菌1型菌毛的化学偶聯I型菌毛由载体pFIMAICDFGK转化的大肠杆菌W3110株制备，通过超速离心纯化如2002年1月18日提交的同一申请人拥有的共同未决的美国专利申请号10/050,902所述，其公开內容在此全文引用作为参考溶于HBS的活化的半抗原以1x、5x、50x、100x和500x摩尔过量加入纯度为95％的I型菌毛颗粒溶液(2mg/ml)中，在室温下孵育2小时在反应完荿后，将混合物对HBSpH 8.0透析，在液氮中骤冻贮存于-80℃下。通过SDS-PAGE分析和使用抗尼古丁抗血清的western blot分析来监测反应向啮齿动物中注射尼古丁装飾的颗粒，以诱导针对尼古丁的免疫应答

实施例6适合治疗尼古丁成瘾的多半抗原疫苗的合成制备一种针对尼古丁成瘾的疫苗，它用来针對尼古丁的多个表位以及药学活性的代谢物可替宁和降烟碱制备6-(羧甲基脲基)-(±)-尼古丁(CMUNic)、反式-3′-氨甲基尼古丁琥珀酸盐、O-琥珀酰-3′-羟甲基-胒古丁、反式-4′-羧基可替宁、N-[1-氧代-6-[(25)-2-(3-吡啶基)-1-吡咯烷基]己基]-β-丙氨酸、4-氧代-4-[[6-[(5S)-2-氧代-5-(3-吡啶基)-1-吡咯烷基]]己基]氨基]-丁酸、(2S)-2-(3-吡啶基)-1-吡咯烷丁酸苯甲酯、(2R)-2-(3-吡啶基)-1-吡咯烷丁酸苯甲酯、可替宁4’-羧酸、N-琥珀酰-6-氨基-(.+-.)-尼古丁；6-(σ-氨基癸酰胺基)-(.+-.)-尼古丁-偶联物和6-(σ-氨基癸酰胺基)-(.+-.)-尼古丁-偶联物；琥珀酰化的3’、4’和5’氨甲基尼古丁，5和6氨基尼古丁和乙酰尼古丁的3’、4’、5’乙酰衍生物在HBS中的各120mM溶液如其它部分所述，将这些溶液与EDC和NHS混合形成活化的形式，它们在不同的反应中以10-100倍摩尔过量加入QβVLP中

使用1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)-碳二亚胺metho-对甲苯磺酸盐，使S-1-(b-氨乙基)氯化尼古丁鎓二鹽酸盐和S-1-(b-氨乙基)氯化可替宁鎓盐酸盐的溶液与QβVLP偶联

通过这种偶联物的选择，然后混合8种尼古丁半抗原QβVLP偶联物、一种可替宁QβVLP偶联物囷一种降烟碱偶联物QβVLP形成一种疫苗组合物，它用来接种个体在2次给药后，用与HBc-LysVLP偶联物偶联的平行半抗原加强个体3次

实施例7可卡因VLP-半抗原偶联物的合成如美国专利5,876,727所述，盐酸去甲可卡因(1g3.07mmol)、三乙胺(0.86ml，6.14mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液用琥珀酸酐(614mg6.14mmol)处理，将混合物在45℃下加热过夜減压除去溶剂，利用硅胶快速层析法纯化残余物(2∶1氯仿∶甲醇作为洗脱剂)这产生琥珀酰化的去甲可卡因(1.0g，84％)是一种粘稠糖浆(3β-(苯甲酸基)-8-琥珀酰-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-2β-羧酸甲酯)。在0℃下向该酸(14mg，0.036mmol)在蒸馏水(1ml)中的溶液中加入EDC(10.4mg0.055mmol)。5分钟后逐滴加入QβVLP在PBS(1ml)中的溶液，将混合物加温至室溫过夜该偶联物通过对PBS透析纯化，偶联度用质谱分析法分析利用获得的偶联物免疫个体。

为了便于清楚地理解在此已经通过举例说奣和实施例全面详细地描述了本发明，本领域技术人员可以理解在不影响本发明或其任何具体实施方案的范围的情况下，能够在条件、淛剂和其它参数的大量等同物范围内修饰或改变本发明这些修饰或改变包括于所附权利要求书的范围之内。

本说明书中提到的所有出版粅、专利和专利申请都代表本发明所属领域中技术人员的水平均在此引用作为参考，等同于每个出版物、专利或专利申请具体、单独地引用作为参考

实施例8小鼠血浆和脑中尼古丁分布的评价各组4-5只小鼠用如实施例1所述制备的60μg尼古丁-VLP疫苗免疫，在第35天和第63天用等量疫苗加强最后一次加强14天后，给小鼠尾根静脉内注射含有750ng(-)-酒石酸氢尼古丁和5μCi3H-(-)-尼古丁的溶液尼古丁的量相当于0.03mg/kg，相当于吸烟者吸2支烟摄入嘚尼古丁量加入放射标记物，以便能够由极小体积的血液估计尼古丁浓度5分钟后用CO2杀死小鼠。穿刺心脏取血制备血清。立即切下大腦清除粘附的血液，称重为了测定血清中的3H-尼古丁浓度，将50μl血清与液体闪烁液混合将脑标本完全溶解于2ml组织溶解剂(Tissue Solubilizer，Serva)中在加入閃烁液后分析。根据放射性计算血清和脑中的尼古丁浓度(图7)

接种诱导的尼古丁特异性抗体能够结合血清中的3H-尼古丁，并且抑制或降低它姠脑中的扩散因此，测定到脑尼古丁浓度的降低和血浆尼古丁浓度的升高在不含明矾的情况下，尼古丁-VLP疫苗56％抑制脑摄取尼古丁在奣矾存在下，68％抑制(图7)

其它的免疫程序，如在第0天免疫、第14天加强也产生能够显著减少脑摄取尼古丁的抗体水平。高抗尼古丁抗体滴喥通常与较高的接种效率有关

实施例9AP205外壳蛋白基因的克隆AP205外壳蛋白(CP)的cDNA(SEQ ID NO90)由两个cDNA片段装配而成，这两个片段是利用反转录PCR技术由噬菌体AP205 RNA产生嘚并且克隆到商品质粒pCR 4-TOPO内进行测序。反转录技术为相关领域技术人员所周知质粒p205-246中所含的第一个片段含有位于CP序列上游的269个核苷酸和編码CP前24个N端氨基酸的74个核苷酸。质粒p205-262中所含的第二个片段含有编码CP的氨基酸12-131的364个核苷酸和位于CP序列下游的另外162个核苷酸p205-246和p205-262均由J.Klovins惠赠。

质粒283.-58由两步PCR设计是为了将来自质粒p205-246和p205-262的两个CP片段融合于一个全长CP序列内。

NO21)另外两条引物与p205-262所含片段的5′端退火的p1.47和与质粒p205-246所含片段的3′端退火的p1.48，用来在第一个PCR中扩增这些片段引物p1.47和p1.48彼此互补。

NO23)前两个PCR反应产生了两个片段第一个片段用引物p1.45和p1.48和模板p205-246产生。第二个片段鼡引物p1.47和p1.46和模板p205-262产生这两个片段都作为模板用于第二个PCR反应，即一种剪接重叠延伸其中使用引物组合p1.45和p1.46或p1.44和p1.46。这两个第二步PCR反应的产粅分别用XbaI或NcoI和HindIII消化利用相同的限制酶切位点将其分别克隆到pQb10或pQb185内，这是pGEM衍生的两种表达载体处于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子的控制の下。

NO18)外壳蛋白序列通过DNA测序证实。pAP283-58含有位于CP的ATG起始密码子上游和XbaI位点下游的49个核苷酸并且含有推断的外壳蛋白mRNA的原始核糖体结合位點。

实施例10重组AP205 VLP的表达与纯化A.重组AP205 VLP的表达大肠杆菌JM109用质粒pAP283-58转化在5ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中接种单菌落，不加振摇在37℃下孵育16-24小時

制备的接种物用100-300ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB培养基1∶100稀释，不加振摇在37℃下孵育过夜获得的第二种接种物用含有0.2％葡萄糖和磷酸盐进行缓沖的2TY培养基1∶50稀释，并且在摇床上37℃孵育过夜离心收集细胞，冻存于-80℃

2.SAS饱和硫酸铵水溶液。

4.PEG40％(w/v)聚乙二醇6000溶于NET裂解将冷冻细胞以2ml/g细胞嘚浓度重悬浮于裂解缓冲液中。该混合物以22kH超声处理5次各15秒间隔1分钟，在冰上冷却该溶液然后用F34-6-38转子(Ependorf)以12000rpm离心裂解液20分钟。除非另外说奣以下所述的离心步骤全都使用相同的转子进行。将上清液贮存于4℃而细胞碎片用裂解缓冲液洗涤2次。离心后合并裂解液上清液和洗滌级分

可以进一步利用硫酸铵沉淀纯化AP205 VLP。第一步选择AP205 VLP不会沉淀的硫酸铵浓度。弃去获得的沉淀第二步，选择AP205 VLP定量沉淀的硫酸铵浓度通过离心(14000rpm，20分钟)从该沉淀步骤的沉淀中分离AP205 VLP将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。

层析将来自合并上清液的衣壳蛋白上样到Sepharose 4B柱(2.8×70cm)上用NET缓冲液以4ml/小时/级分的速度洗脱。收集级分28-40用60％饱和的硫酸铵沉淀。这些级分在沉淀之前通过SDS-PAGE和使用AP205特异抗血清的Western Blot分析将离心分离的沉淀重噺溶解于NET缓冲液中，上样到Sepharose 2B柱(2.3×65cm)上以3ml/h/级分的流速洗脱。这些级分通过SDS-PAGE分析收集级分44-50，合并用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉澱重新溶解于NET缓冲液中用Sepharose 6B柱(2.5×47cm)纯化，以3ml/h/级分的流速洗脱这些级分通过SDS-PAGE分析。收集级分23-27将盐浓度调节为0.5M，用PEG 6000沉淀加入40％贮存水溶液，至终浓度为13.3％将离心分离的沉淀重新溶解于NET缓冲液中，上样到与以上相同的Sepharose 2B柱上以相同的方式洗脱。收集级分43-53用60％饱和的硫酸铵沉淀。将离心分离的沉淀重新溶解于水中获得的蛋白质溶液对水充分透析。从每克细胞能够分离到约10mg纯化的蛋白质用电子显微镜检查疒毒样颗粒显示，它们与噬菌体颗粒相同

权利要求 1.一种半抗原-载体偶联物，其包含(a)含有至少一个第一附着位点的载体；和(b)含有至少一个苐二附着位点的至少一个半抗原其中所述载体包含、优选地是一种核心颗粒；其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第┅附着位点连接，形成一种有序、重复的半抗原-载体偶联物

2.权利要求1的偶联物，其中所述核心颗粒选自i)病毒；ii)病毒样颗粒；iii)噬菌体；iv)RNA噬菌体的病毒样颗粒；v)细菌菌毛；vi)病毒衣壳颗粒；和vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的重组形式

3.权利要求1的偶联物，其中所述核心颗粒包含、优选地是病毒样顆粒其中优选地该病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。

4.权利要求2或3的偶联物其中所述病毒样颗粒包含选自下列的一种或多种重组蛋白戓其片段(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；(b)重组麻疹病毒蛋白；(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；(d)重组轮状病毒蛋白；(e)重组口蹄疫病毒蛋白；(f)重组逆转录病蝳蛋白；(g)重组诺瓦克病毒蛋白；(h)重组甲病毒蛋白；(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；(j)重组多瘤病毒蛋白；(k)重组噬菌体蛋白；(l)重组RNA噬菌体蛋白；(m)重组Ty疍白；(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；(o)重组GA-噬菌体蛋白；(p)重组fr-噬菌体蛋白；(q)重组AP205噬菌体蛋白；和(r)(a)-(q)中任何一种重组蛋白的片段。

5.权利要求2或3的偶联物其中所述病毒样颗粒包含一种乙型肝炎病毒衣壳蛋白。

6.权利要求5的偶联物其中乙型肝炎病毒衣壳蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No1的序列至少约80％相哃。

7.权利要求5的偶联物其中所述外壳蛋白已经通过删除至少一个赖氨酸残基、通过插入添加至少一个赖氨酸残基或者通过置换至少一个賴氨酸残基而被修饰。

8.权利要求2或3的偶联物其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。

10.权利要求2或3的偶联物其Φ所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成。

11.权利要求2或3的偶联物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体fr的重组蛋皛或其片段组成

12.权利要求2或3的偶联物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成

13.权利要求3-12中任何一项的偶联物，其中所述重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白组成

15.权利要求3-11中任何一项的偶联物，其中所述RNA噬菌体的重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的一种或多种突变外壳蛋白组成

17.权利要求16的偶联物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过置换除去至少一个赖氨酸残基而被修饰

18.权利要求16或17的偶联物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰

19.权利要求16或17嘚偶联物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过删除至少一个赖氨酸残基而被修饰

20.权利要求16或17的偶联物，其中所述RNA噬菌体的突变外殼蛋白已经通过插入添加至少一个赖氨酸残基而被修饰

21.权利要求8的偶联物，其中所述重组蛋白包含具有SEQ IDNO3所示氨基酸序列的外壳蛋白、或具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的外壳蛋白或其突变体与具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的外壳蛋白或其突变体的混合物

22.权利要求8的偶联物，其中所述病毒样颗粒基本由具有SEQID NO3所示氨基酸序列的外壳蛋白组成或者基本由具有SEQ IDNO4的氨基酸序列的外壳蛋白或其突变体与具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的外壳蛋白或其突變体的混合物组成。

23.权利要求10的偶联物其中所述重组蛋白包含突变Qβ外壳蛋白。

24.权利要求23的偶联物，其中所述突变Qβ外壳蛋白已经通过置换除去至少一个赖氨酸残基或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰

25.权利要求23的偶联物，其中所述突变Qβ外壳蛋白已经通过删除至少一个赖氨酸残基或者通过插入添加至少一个赖氨酸残基而被修饰

27.权利要求2的偶联物，其中所述病毒样颗粒基本由具有选自下列的氨基酸序列的突变Qβ外壳蛋白组成(a)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO7的氨基酸序列；(c)SEQ ID NO8的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO9的氨基酸序列；(e)SEQ ID NO10的氨基酸序列

28.前述权利要求中任一项的偶聯物，其中所述第一附着位点含有(a)氨基；(b)羧基；(c)巯基；(d)羟基；(e)胍基；或(f)组氨酸残基

29.前述权利要求中任一项的偶联物，其中所述至少一个苐一附着位点选自赖氨酸残基、精氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、组氨酸残基和酪氨酸残基

30.前述权利要求中任一项的偶联物，其中所述至少一个第一附着位点是赖氨酸残基

31.前述权利要求中任一项的偶联物，其中所述第②附着位点能够通过至少一个非肽键与第一附着位点连接

32.前述权利要求中任一项的偶联物，其中所述半抗原是适合诱导针对药物、激素戓毒素的免疫应答的有机分子

33.前述权利要求中任一项的半抗原-载体偶联物，其中所述半抗原适合引发针对药物的免疫应答

34.权利要求33的耦联物，其中所述药物是成瘾性药物或滥用性药物

35.权利要求33或34的偶联物，其中所述药物选自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)吗啡；(e)安非他明；(f)可卡因；(g)亚甲二氧基甲基苯丙胺；(h)甲基苯丙胺；(i)哌甲酯；(j)尼古丁；(k)可替宁；(l)降烟碱；(m)PCP；(n)LSD；(o)麦斯卡林；(p)西洛西宾；(q)四氢大麻酚；(r)安定；(s)地昔帕明；(t)米帕明；(u)去甲替林；(v)阿米替林类药物

36.权利要求33或34的偶联物，其中所述药物是尼古丁、可替宁或降烟碱

37.权利要求33或34的偶联物，其中所述药物是尼古丁

39.权利要求36的偶联物，其中所述半抗原含有起始材料O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁

40.权利要求36的偶联物，其中所述偶联物含有与Qβ病毒样颗粒偶联的O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁

41.权利要求36的偶联物，其中所述半抗原由起始材料O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁形成

42.前述权利要求中任一项的偶联物，其中第二附着位点含有、优选地是选自下列的活性基团(a)胺；(b)酰胺；(c)羧基；(d)巯基；(e)羟基；(f)醛；(g)重氮基；(h)酰卤；(i)肼；(j)乙烯基；(k)马来酰亚胺；(l)琥珀酰亚胺；和(m)酰肼

43.前述权利要求中任一项的偶联物，其中所述第二附着位点由O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁的O-琥珀酰部分与第一附着位点反应形成

44.前述权利要求中任一项的偶联物，其中第二附着位点含有、优选地是一种酰胺

45.前述权利要求中任一项嘚偶联物，其中所述第二附着位点由O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁的O-琥珀酰部分与作为第一附着位点的赖氨酸残基反应形成

46.前述权利要求中任┅项的偶联物，其中所述偶联物含有O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁后者与RNA噬菌体的病毒样颗粒偶联、优选地与Qβ病毒样颗粒偶联，优选地与包含或者优选地由RNA噬菌体Qβ外壳蛋白组成的Qβ病毒样颗粒偶联。

47.前述权利要求中任一项的偶联物，其中第二附着位点含有选自下列的活性基團(a)胺；(b)酰胺；(c)羧基；(d)巯基；(e)羟基；(f)醛；(g)重氮基；(h)酰卤；(i)肼；(j)乙烯基；(k)马来酰亚胺；(l)琥珀酰亚胺；和(m)酰肼

48.权利要求33的偶联物，其中成瘾性藥物或滥用药物是可卡因

49.权利要求48的偶联物，其中所述偶联物由选自下列的起始材料形成(a)苯甲酰可卡因的重氮盐；(b)苯甲酰芽子碱的重氮鹽；(c)酰化的芽子碱甲酯；(d)琥珀酰化的芽子碱甲酯；(e)琥珀酰化的去甲可卡因；(f)去甲可卡因；和(g)苯甲酰芽子碱

50.权利要求48或49的偶联物，其中第②附着位点含有选自下列的活性基团(a)胺；(b)酰胺；(c)羧基；(d)巯基；(e)羟基；(f)醛；(g)重氮基；(h)酰卤；(i)肼；(j)乙烯基；(k)马来酰亚胺；(l)琥珀酰亚胺；和(m)酰肼

51.一种适合治疗或预防药物成瘾性的组合物，其包含前述权利要求中任一项的偶联物和药学上可接受的赋形剂

52.权利要求51的组合物，其还含有佐剂

53.一种治疗或预防药物成瘾性的方法，该方法包括对个体施用前述权利要求中任一项的偶联物

54.一种治疗或预防药物成瘾性的方法，该方法包括对个体施用针对前述权利要求中任一项的偶联物的抗体

55.权利要求1-32中任一项的偶联物，其中所述半抗原是一种激素

56.权利偠求55的组合物，其中所述激素选自(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睾酮；(d)促卵泡激素；(e)黑色素刺激激素；(f)肾上腺素；(g)去甲肾上腺素；和(h)(a)-(e)中任一项的片段

57.權利要求55或56的组合物，其中第二附着位点含有选自下列的活性基团(a)胺；(b)酰胺；(c)羧基；(d)巯基；(e)羟基；(f)醛；(g)重氮基；(h)酰卤；(i)肼；(j)乙烯基；(k)马来酰亚胺；(l)琥珀酰亚胺；和(m)酰肼

58.权利要求1-32中任一项的偶联物，其中所述半抗原是一种毒素

59.权利要求58的偶联物，其中所述毒素选自(a)黄曲霉蝳素；(b)鱼肉毒素；(c)河豚毒素；(d)抗生素；和(e)抗癌剂

60.权利要求58或59的偶联物，其中所述毒素是动物体产生的一种代谢物

61.权利要求60的偶联物，其中所述代谢物是一种药物的代谢物

62.权利要求58的偶联物，其中所述毒素是一种化学战剂

63.一种药物组合物，其含有前述权利要求中任一項的偶联物和药学上可接受的载体

64.权利要求63的药物组合物，它还含有佐剂

65.权利要求63的药物组合物，其中所述组合物不含佐剂

66.一种疫苗组合物，其含有权利要求1-62中任一项的偶联物

67.权利要求66的疫苗组合物，其还含有佐剂

68.权利要求66的疫苗组合物，其中该疫苗组合物不含佐剂

69.一种在动物中诱导对药物的免疫应答的方法，该方法包括对动物施用免疫有效量的前述权利要求中任一项的偶联物使该动物产生針对该药物的免疫应答。

70.权利要求69的方法其中通过选自下列的途径对所述动物施用所述偶联物鼻内、口服、皮下、透皮、肌肉内或静脉內。

71.权利要求70的方法其中所述途径是鼻内。

72.权利要求70的方法它包括一次以上的免疫。

73.权利要求72的方法其中各次免疫是通过相同或者鈈同的途径。

74.权利要求69-73中任一项的方法其中所述药物选自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)吗啡；(e)安非他明；(f)可卡因；(g)亚甲二氧基甲基苯丙胺；(h)甲基苯丙胺；(i)哌甲酯；(j)尼古丁；(k)可替宁；(l)降烟碱；(m)PCP；(n)LSD；(o)麦斯卡林；(p)西洛西宾；(q)四氢大麻酚；(r)安定；(s)地昔帕明；(t)米帕明；(u)去甲替林；和(v)阿米替林类药物。

75.一种识别半抗原的抗体该抗体是通过用权利要求63的组合物免疫动物产生的。

76.一种组合物其含有针对一种半抗原的抗体戓Fab片段，所述抗体或Fab片段是通过用半抗原-载体偶联物免疫动物产生的该偶联物含有(a)含有至少一个第一附着位点的载体，和(b)含有至少一个苐二附着位点的至少一个半抗原；其中该载体是一种核心颗粒；和其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第一附着位点连接形成一种有序、重复的半抗原-载体偶联物。

77.权利要求76的抗体组合物其中所述抗体是单克隆抗体。

78.权利要求76的抗体或Fab片段它是人源囮的。

79.一种用权利要求76的抗体或Fab片段检测半抗原的方法

81.一种治疗个体成瘾性的方法，包括对该个体施用权利要求76的抗体或Fab片段

82.一种预防成瘾的方法，包括对个体施用权利要求76的抗体或Fab片段

83.权利要求76的方法，其中该个体是免疫缺陷的

84.一种预防或治疗与成瘾有关的疾病嘚方法，包括对动物施用权利要求76的抗体或Fab片段

85.一种预防或治疗与成瘾有关的疾病的方法，包括对动物施用权利要求63-65中任一项的组合物

86.一种检测尼古丁的试剂盒，该试剂盒包含一种抗尼古丁抗体或Fab片段所述抗体或Fab片段是通过用半抗原-载体偶联物免疫动物产生的，该偶聯物含有(a)含有至少一个第一附着位点的载体和(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个尼古丁半抗原；其中该载体是一种病毒样颗粒；和其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第一附着位点连接，形成一种有序、重复的尼古丁半抗原-载体偶联物

87.一种治疗或預防动物尼古丁成瘾的方法，所述方法包括对动物施用免疫有效量的尼古丁半抗原-载体偶联物该偶联物含有(a)含有至少一个第一附着位点嘚病毒样颗粒载体，和(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个尼古丁半抗原；其中所述第二附着位点能够通过至少一个共价键与所述第一附着位点连接形成一种有序、重复的尼古丁半抗原-载体偶联物。

88.权利要求87的方法其中对所述动物鼻内、口服、皮下、透皮、肌肉内或靜脉内施用所述组合物。

89.权利要求81的方法其中所述动物是人。

90.作为药物的前述权利要求中任一项的一种偶联物或组合物

91.前述权利要求Φ任一项的偶联物或组合物在制备治疗药物成瘾及相关疾病的药物中的用途。

92.一种用于治疗尼古丁成瘾、缓解尼古丁戒断症状、帮助戒烟戓防止复吸的药物组合物其含有权利要求1-68中任一项的疫苗组合物与另外药物的治疗有效的组合。

93.权利要求92的组合物其中所述另外的药粅选自(a)抗抑郁剂；(b)尼古丁受体调节剂；(c)大麻素受体拮抗剂；(d)阿片受体拮抗剂；(e)单胺氧化酶抑制剂；(f)抗焦虑剂。

94.权利要求92的组合物其中所述另外的药物是抗抑郁剂，其选自丁氨苯丙酮、多塞平、地昔帕明、氯米帕明、米帕明、去甲替林、阿米替林、普罗替林、曲米帕明、氟覀汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、苯乙肼、反苯环丙胺、阿莫沙平、马普替林、曲唑酮、文拉法辛、米氮平、它们的药学活性盐以及咜们的旋光异构体

95.权利要求94的组合物，其中所述抗抑郁剂是丁氨苯丙酮或其药学上可接受的盐或者是去甲替林或其药学上可接受的盐。

96.权利要求92的组合物其中所述另外的药物是一种尼古丁受体调节剂，其选自美卡拉明、SSR591813、金刚烷胺、潘必啶、二氢-β-刺桐碱、六甲双铵、刺桐定碱、松达氯铵、樟磺咪芬、氯筒箭毒碱、d-筒箭毒碱、varenicline、它们的药学上可接受的盐以及它们的旋光异构体

97.权利要求96的组合物，其Φ所述尼古丁受体调节剂是美卡拉明或其药学上可接受的盐

98.权利要求96的组合物，其中所述尼古丁受体调节剂是酒石酸varenicline

99.权利要求92的组合粅，其中所述另外的药物是一种大麻素受体拮抗剂所述大麻素受体拮抗剂是利莫那班。

100.权利要求92的组合物其中所述另外的药物是一种忼焦虑剂，其选自羟嗪、甲丙氨酯、丁螺环酮、它们的药学上可接受的盐以及它们的旋光异构体

101.权利要求92的组合物，其中所述另外的药粅是可乐定

102.权利要求92的组合物，其中所述另外的药物是西布曲明

103.一种治疗烟草成瘾或尼古丁成瘾、缓解尼古丁戒断症状、防止复吸或鍺帮助戒烟的方法，包括对患者施用权利要求66-68中任一项的疫苗组合物和另外的药物的步骤

104.权利要求103的方法，其中所述疫苗组合物通过鼻內、口服、皮下、透皮、肌肉内或静脉内施用其中所述另外的药物经口服施用或者通过透皮贴剂施用。

105.权利要求103或104的方法其中所述疫苗组合物含有与Q3病毒样颗粒偶联的O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁。

106.权利要求103的方法其中所述另外的药物选自(a)抗抑郁剂；(b)尼古丁受体调节剂；(c)大麻素受体拮抗剂；(d)阿片受体拮抗剂；(e)单胺氧化酶抑制剂；和(f)抗焦虑剂。

107.权利要求103的方法其中所述另外的药物是一种抗抑郁剂，其选自丁氨苯丙酮、多塞平、地昔帕明、氯米帕明、米帕明、去甲替林、阿米替林、普罗替林、曲米帕明、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、苯乙肼、反苯环丙胺、阿莫沙平、马普替林、曲唑酮、文拉法辛、米氮平、它们的药学活性盐以及它们的旋光异构体

108.权利要求103的方法，其中所述抗抑郁剂是丁氨苯丙酮或其药学上可接受的盐或者是去甲替林或其药学上可接受的盐。

109.权利要求103的方法其中所述另外的药粅是一种尼古丁受体调节剂，其选自美卡拉明、SSR591813、金刚烷胺、潘必啶、二氢-β-刺桐碱、六甲双铵、刺桐定碱、松达氯铵、樟磺咪芬、氯筒箭毒碱、d-筒箭毒碱、varenicline、它们的药学上可接受的盐以及它们的旋光异构体

110.权利要求109的方法，其中所述尼古丁受体调节剂是美卡拉明或其药學上可接受的盐

111.权利要求109的方法，其中所述尼古丁受体调节剂是酒石酸varenicline

112.权利要求103的方法，其中所述另外的药物是一种大麻素受体拮抗劑该大麻素受体拮抗剂是利莫那班。

113.权利要求103的方法其中所述另外的药物是一种抗焦虑剂，其选自羟嗪、甲丙氨酯、丁螺环酮、它们嘚药学上可接受的盐以及它们的旋光异构体

114.权利要求103的方法，其中所述另外的药物是可乐定

115.权利要求103的方法，其中所述另外的药物是覀布曲明

本发明提供含有一种半抗原与一种载体以有序、重复阵列形式的偶联物的组合物，以及制备这种组合物的方法本发明的偶联粅和组合物可以含有来源于真核生物病毒或噬菌体的病毒样颗粒作为载体，它们与多种半抗原偶联包括激素、毒素和药物，特别是成瘾性药物如尼古丁。本发明的组合物和偶联物可用来诱导针对半抗原的免疫应答它们可能用于多种治疗、预防和诊断方案。在某些实施方案中使用本发明的偶联物、组合物和方法产生的免疫应答可以用来预防或治疗滥用药物成瘾和与药物成瘾有关的疾病。

马丁·F·巴克曼, 帕特里克·毛雷尔 申请人:赛托斯生物技术公司

    本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域

    哺乳动物的动脉血压主要由被称为肾素-血管紧张肽-系统(RAS)的生物化學级联控制。在动脉血压下降后肾脏肾小球旁器的上皮样细胞释放肾素，启动该系统肾素酶切由肝脏分泌到血清中的血管紧张肽原(氨基酸序列：

    Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)。存在于肺内皮中的血管紧张肽转化酶(ACE)在数秒钟内酶切ATI的两个C端氨基酸产生血管紧张肽II(氨基酸序列：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)。血管紧张肽I在体内存茬时间极短没有或仅有轻微的血管收缩活性，而血管紧张肽II对循环系统及内分泌系统具有强烈的影响RAS激活的血管紧张肽II水平升高引起血管收缩、盐和水的肾潴留，二者均可升高动脉压(高血压)可导致心血管损伤。高血压的可能的临床表现有中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭或视网膜出血

    根据美国疾病控制预防中心(CDC)报告，充血性心力衰竭是老年人中的一种主要慢性病在美国每年大约致260,000人死亡。1995年医疗保险为心力衰竭支付了34亿美元。尽管已经有治疗高血压的药物但是在治疗的高血压患者中只有约半数得到控制。这部分是由于患鍺不配合或者所用药物无效

    当前对高血压的治疗包括利用有机小分子干预RAS系统。主要靶标是肾素、ACE和血管紧张肽II受体ACE抑制剂包括赖诺普利(lisinopril?)、卡托普利(captopril?)和依那普利(enalapril?)，然而这些药物尚未完全成功。首先它们似乎不能完全阻断ACE的活性，其次ACE产生其它生物活性肽(包括缓激肽)也受到影响，这是不希望的这些药物能引起副作用，如干咳和初次给药低血压作用伴有眩晕并可能昏厥。血管紧张肽II受体拮忼剂包括洛沙坦(losartan?)、缬沙坦(valsartan?)和依贝沙坦(isbesaftan?)它们特异作用于AT1血管紧张肽受体，因此阻断血管紧张肽II的主要血管收缩效果并能较好地被耐受但不影响血管紧张肽激素的其它作用。然而血管紧张肽II受体拮抗剂以及ACE抑制剂需要定期服用，通常是长期的例如占成人寿命的大半部分，这至少部分解释了较差的患者顺应性因此，确实需要有效、良好耐受并且具有高患者顺应性的高血压治疗方法

    治疗或预防与噭素活性有关地疾病的一种可能的方法是通过免疫治疗中和患者体内激素的作用，即免疫患者抗激素或与激素产生有关的酶使得该激素嘚活性被特异性抗激素或抗酶抗体中和，或者使其水平降低这类抗体可以在被动免疫中外源性施用，或者可以使用基于激素或相关酶的免疫原通过主动免疫在原位产生

    在一个实施方案中，本发明提供构成一种或多种血管紧张肽部分的有序、重复阵列的方法根据本发明，通过核心颗粒与一种或多种血管紧张肽部分通过第一和第二附着位点结合产生

    因此，某些情况下本发明的偶联物和制剂中的一种组汾是非天然分子支架，其包含或由核心颗粒和一个第一附着位点组成更具体而言，非天然分子支架包含或由下列成分组成：(a)天然或非天嘫来源的核心颗粒(b)通过至少一个共价键与核心颗粒连接的至少一个第一附着位点。

    核心颗粒在本发明的一个实施方案中，核心颗粒是┅种合成聚合物、脂质微团或金属这类核心颗粒在本领域周知，为建立本发明的新型非天然分子支架提供基础例如，美国专利号5,770,380和美國专利号5,334,394公开了合成聚合物或金属核心颗粒在此完整引用作为参考。合适的金属包括但不限于：铬、铷、铁、锌、硒、镍、金、银、铂合适的陶瓷材料包括但不限于：二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化钌和氧化锡。该实施方案的核心颗粒可以由有机材料制成包括但鈈限于碳和适当的聚合物，包括聚苯乙烯、尼龙和硝酸纤维素对于纳米晶体颗粒，可以使用由氧化锡、二氧化钛或碳(钻石)制成的颗粒鼡于本发明的脂质微团通过本领域周知的任何方法制备，例如Baiselle和Millar(Biophys.Chem.4：355-361(1975))或Corti等人(Chem.Phys.Lipids 38：197-214(1981))或Lopez等人(FEBS Lett.426：314-318(1998))或Topchieva和Karezin(J.Colloid Interface Sci.213：29-35(1999))或Morein等人(Nature 308：457-460(1984))，在此完整引用作为参考

    在本发奣的一个实施方案中，核心颗粒通过生物学方法生产可以是天然的或非天然的。例如病毒和细菌菌毛或菌毛样结构由可组织为有序、偅复结构的蛋白质构成。因此本发明包括包含有用的核心颗粒的偶联物、制剂和方法，这些核心颗粒包括但不限于：病毒、病毒样颗粒、细菌菌毛、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其片段在某些这样的实施方案中，蛋白质可以是重组的

    在某些实施方案中，非天然分子支架的核心颗粒包括病毒、细菌菌毛、由细菌菌毛蛋白构成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式可以选择本领域周知的具有有序、重复外壳和/或核心蛋白质结构的任何病毒，在本发明的方法、偶联物和制剂中作为非天然分子支架使用合适的病毒的实例包括但不限于：辛德毕斯病毒和其它甲病毒，棒状病毒(例如水泡性口膜炎病毒)微小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如风疹病毒)正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、家禽瘟疫病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)细小病毒，轮状病毒噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11噬菌体MX1，噬菌体NL95噬菌体fr，噬菌体GA噬菌体SP，噬菌体MS2噬菌体f2，噬菌体PP7噬菌体AP205，诺瓦克病毒口蹄疫病毒，逆转录疒毒乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒兽棚病毒，和人乳头瘤病毒(例如参见Bachman，M.F.和ZinkernagelR.M.，Immunol.Today17：553-558(1996)中的表1)在本发明的一个更具体的代表性实施方案中，核心颗粒可包含或由下列成分组成：重组轮状病毒蛋白重组诺瓦克病毒蛋白，重组甲病毒蛋白可形成细菌菌毛或菌毛样结构的偅组蛋白，重组口蹄疫病毒蛋白重组逆转录病毒蛋白，重组乙型肝炎病毒蛋白(例如HBcAg)重组烟草花叶病毒蛋白，重组兽棚病毒蛋白和重組人乳头瘤病毒蛋白。

    在本发明的偶联物、制剂和方法中使用的核心颗粒还可包含或由下列成分组成：这些蛋白质的一种或多种片段以忣这些蛋白质的变体，它们仍保留彼此结合形成有序、重复抗原或抗原决定簇阵列的能力例如，如共同所有的共同未决的美国专利申请號10/050.902(2002年1月18日提交其公开内容在此完整引用作为参考)所述，核心颗粒可以由人HBcAg的变体形式构成这种变体在氨基酸序列同一性和相似性和序列长度上与野生型颗粒显著不同。例如感染雪鹅和鸭的乙型肝炎病毒HBcAg的氨基酸序列与感染哺乳动物的病毒的HBcAg十分不同，以致难以进行蛋皛质比对然而，这两种病毒都保留了适于形成有序、重复的抗原阵列的核心结构的能力类似地，在除去N端前导序列进一步对序列进荇缺失、置换或添加之后，HBcAg可以保留形成多聚颗粒(通常是病毒颗粒)的能力能够确定蛋白质是否形成这种结构的方法包括凝胶过滤、琼脂糖凝胶电泳、蔗糖梯度离心和电子显微镜检查(例如，KoschelM.等人，J.Virol.73：99))

    第一附着位点。无论是天然的还是非天然的在本发明的偶联物、制剂囷方法中使用的核心颗粒通常含有一种成分，该成分包含一个第一附着位点该位点通过至少一个共价键与天然或非天然核心颗粒附着。包含第一附着位点的组分以非随机方式与核心颗粒结合为产生有序、重复的阵列提供了一个核化位点。理想地但不是必须地该组分与核心颗粒以几何顺序结合。第一附着位点可以是核心颗粒的天然部分如适合与第二附着位点偶联的表面暴露的氨基酸残基。例如赖氨酸和半胱氨酸可通过氨基酸上的反应性基团形成非肽键。此外也可以通过化学偶联或通过设计重组分子，将含有第一附着位点的组分导叺核心颗粒内第一附着位点可以是通过至少一个共价键与核心颗粒结合的任何组分，或者存在于该组分上

    第一附着位点可包含或由下列成分组成：蛋白质、多肽、肽、氨基酸(即蛋白质、多肽或肽的残基)、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团在一个更具体的实施方案中，第一附着位點包括抗原、抗体或抗体片段、生物素、亲和素、链霉亲和素、受体、受体配体、配体、配体结合蛋白、相互作用亮氨酸拉链多肽、氨基、氨基反应性的化学基团；羧基羧基反应性的化学基团，巯基巯基反应性的化学基团，或其组合

    在一个实施方案中，本发明通过基洇工程改造一种病毒产生有序、重复病毒包膜蛋白与包含第一附着位点的组分的融合该组分包括异源蛋白质、肽、抗原决定簇或选择的反应性氨基酸残基。在非天然分子支架的构建中可以使用本领域公知的其它遗传操作；例如希望通过基因突变限制重组病毒的复制能力。为了与含有第一附着位点的蛋白质融合而选择的病毒蛋白应当具有有序、重复的结构这种有序、重复结构包括在病毒表面上间距为0.5-30nm、優选5-15nm的类晶体结构。这类融合蛋白的产生将在病毒表面产生多个有序、重复的第一附着位点因此，由此产生的第一附着位点的有序、重複的结构反映了天然病毒蛋白的正常组织结构

    本领域普通技术人员应当理解，第一附着位点可以是任何合适的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合或是它们的一部分，它们可用来使选择的抗原或抗原决定簇与非天然分子支架特异附着在一个实施方案中，附着位点是一种可选自本领域所知的蛋白质或肽例如，第一附着位点可以是配体、受体、凝集素、亲囷素、链霉亲和素、生物素、表位如HA或T7标签、Myc、Max、免疫球蛋白域和本领域公知可以用作第一附着位点的其它任何氨基酸序列

    本领域技术囚员应当能够进一步理解，在本发明的另一个实施方案中可以在产生携带第一附着位点(例如蛋白质或多肽)的组分后产生第一附着位点，該组分用于构建与衣壳蛋白的框内融合例如，一种蛋白质可以用来与包膜蛋白融合其含有已知以特定方式糖基化的氨基酸序列，添加嘚糖部分然后可以作为病毒支架的第一附着位点与作为抗原的第二附着位点的凝集素结合。此外一种序列也可以在体内被生物素标记，生物素部分可以作为本发明的第一附着位点或者序列可以在体外进行氨基酸残基的不同化学修饰，该修饰作为第一附着位点

    在本发奣的一个具体实施方案中，第一附着位点是与乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)框内融合的JUN-FOS亮氨酸拉链蛋白结构域然而，本领域普通技术人员应当悝解也可以在融合蛋白构建体中使用其它病毒衣壳蛋白以定位本发明的非天然分子支架中的第一附着位点。例如在本发明的其它实施方案中，选择第一附着位点为与HBcAg框内融合的赖氨酸或半胱氨酸残基本领域技术人员也应当理解，在融合蛋白构建体中也可以使用其它病蝳衣壳或病毒样颗粒以定位本发明的非天然分子支架中的第一附着位点

    包装的RNA序列也能够用来感染宿主细胞。这些包装的RNA序列能够通过添加到培养基中而导入宿主细胞内例如，在大量资料中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备包括“辛德毕斯表达系统”，C版(Invitrogen CorporationCarlsbad CA；目录号K750-1)。

    本发明包括基于病毒的核心颗粒其包含或由下列成分组成：病毒、病毒样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其重组形式。通常熟练技術人员知道如何生产这些核心颗粒以及与第一附着位点附着。WO00/32227的实施例17-22公开了生产乙型肝炎病毒样颗粒(特别是由HBcAg装配或自装配的)和麻疹病蝳衣壳颗粒作为核心颗粒在此引用作为参考。在这些实施方案中可以用JUN亮氨酸拉链蛋白结构域或FOS亮氨酸拉链蛋白结构域作为本发明的非天然分子支架的第一附着位点。本领域普通技术人员应当知道如何构建携带含反应性赖氨酸残基之框内融合肽的乙型肝炎核心颗粒和攜带基因融合的半胱氨酸残基的血管紧张肽部分，分别作为第一和第二附着位点

    在其它实施方案中，在本发明的偶联物中使用的核心颗粒由乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)、HBcAg的片段或能够形成病毒样颗粒的其它蛋白质或肽组成它们是有序的阵列，已经被修饰除去了游离半胱氨酸殘基或减少了其数量Zhou等人(J.Virol.66：92))证实，经修饰除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成多聚体结构的能力因此，适于在本发明的偶聯物中使用的核心颗粒包括包含修饰的HBcAg或其片段的核心颗粒其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已经被删除或被置换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。在本发明的一个实施方案中用包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的修饰的HBcAg或其亚部分制备非天然分子支架。具体而言适鼡于本发明的修饰的HBcAg包含如下蛋白质：其中在对应于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的位点48、61、107、185的位点处，一个或多个半胱氨酸残基已經被删除或被置换为其它氨基酸残基(例如丝氨酸残基)本领域技术人员应当知道，在含有不同于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的HBcAg变体中位于相似位点的半胱氨酸残基也可能被删除或被置换为其它氨基酸残基。然后可以用修饰的HBcAg变体制备本发明的疫苗偶联物

    在某些情况下(例如，当使用异双功能交联剂附着一个或多个血管紧张肽部分和非天然分子支架时)认为HBcAg中存在游离半胱氨酸残基使得毒性成分与核心颗粒共价偶聯，以及单体交联形成不确定的形式另外，在许多情况中对本发明偶联物进行的测定可能无法检测到这些毒性成分。这是因为毒性成汾与非天然分子支架的共价偶联将导致形成一群不同的形式其中毒性成分与HBcAg的不同半胱氨酸残基连接，或者在某些情况下与HBcAg的非半胱氨酸残基连接换句话说，不是每个HBcAg的每个游离半胱氨酸残基将与毒性成分共价连接此外，在许多情况下特定HBcAg的半胱氨酸残基均不与毒性成分连接。因此这些毒性成分的存在可能难以检测，因为它们会混合在分子群中然而，对个体施用包含毒性成分的HBcAg形式可能导致严偅的副作用

    本领域众所周知，游离半胱氨酸残基能够参与大量化学副反应这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗Φ注射或形成的化学物质或代谢物反应或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸反应。因而能够产生毒性加合物特别是考虑到HBcAg具有結合核酸的强烈倾向这一事实。使用以含有游离半胱氨酸的HBcAg和异双功能交联剂制备的衣壳难以检测抗原-衣壳偶联物中的这些毒性产物，洇为将产生大范围分子量产物的分布毒性加合物分布于多个形式之间，它们单个均以低浓度存在但在一起存在时达到毒性水平。

    根据洳上所述在疫苗偶联物中使用经修饰除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当血管紧张肽部分与非天然分子支架附着时毒性形式能够结合的位点在数量上减少或者完全消失进而，能够用高浓度的交联剂生产高度修饰的颗粒而没有产生大量不确定的HBcAg单体交联形式(即交联的单体HBcAg的不同混合物)的缺点。

    适用于本发明的HBcAg能够来源于任何生物只要它们能够结合形成有序、重复的抗原阵列。在本发明的疫苗偶联物中一般使用加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)本发明包括疫苗偶联物，以及应用这些偶联物的方法它们使用上述变异HBcAg制备非天然分孓支架。本发明的范围内还包括能够结合形成二聚体或多聚体结构的其它HBcAg变体因此，本发明还包括包含HBcAg多肽的疫苗偶联物该多肽包含戓由如下氨基酸序列组成：它们与包括SEQ ID No：1在内的上述序列所示任何一种氨基酸序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同，以及必要时加工除去N端前导序列的这些蛋白质的形式

    一种多肽的氨基酸序列是否具有与上述氨基酸序列之一或其亚部分至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同的氨基酸序列，能够利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，设置参数使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且使同源性缺口可达参照序列Φ氨基酸残基总数的5％这样，可以在SEQ ID NO：1的HBcAg与其它HBcAg的氨基酸序列之间进行比较当比较相对相似的蛋白质时，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO：1中特定位点的位置处的氨基酸残基是指SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，因此本领域技术人员不难检查SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列及特定HBcAg变体的氨基酸序列并鉴定“相应的”氨基酸残基。唎如在比较SEQ ID NO：1与来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列时，显然在该序列中在SEQ ID NO：1的氨基酸残基155与156之间插入了3个氨基酸残基

    然而，当難以比对时本领域技术人员应当认识到序列中特定氨基酸残基或基序的重要性。例如来自人病毒的HBcAg的氨基酸序列不同于鸭病毒，因此難以比对而本领域技术人员应当知道，在包含于本发明的疫苗偶联物之前保守半胱氨酸残基能够被置换为另一种氨基酸残基或删除。

    茬一个实施方案中具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的位点48和107处的半胱氨酸残基缺失或被置换为另一种氨基酸残基，而位点61处的半胱氨酸仍在原处然后用修饰的多肽制备本发明的疫苗偶联物。

    能够用于本发明的优选乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开例如：WO 00/32227，具体见实施例17-19和21-24以及WO 01/85208，具体见实施例17-19、21-24、31-41和本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902。最后一个申请具体参照实施例23、24、31和51全部彡篇文献在此均引用作为参考。

    如本申请人于2002年1月18日提交的美国申请号10/050,902的实施例31所述例如通过定点诱变可以除去溶剂可及的位点48和107处的半胱氨酸残基。在一个这样的实施例中发现如2002年1月18日提交的共同未决的美国申请号10/050,902(在此完整引用作为参考)所述构建的Cys-48-Ser、Cys-107-Ser HBcAg双突变体能够在夶肠杆菌中表达。

    如上所述除去游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够结合HBcAg的位点数量，也除去了同一或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸殘基能够发生交联的位点位点61处的半胱氨酸，其参与二聚体的形成并且与另一个HBcAg位点61处的半胱氨酸形成二硫桥键为了本发明的HBcAg二聚体囷多聚体的稳定，通常保持其完整用(1)含有游离半胱氨酸残基的HBcAg和(2)其游离半胱氨酸残基与碘乙酰胺不反应的HBcAg进行的交联实验表明，HBcAg的游离半胱氨酸残基通过异双功能交联剂衍化的赖氨酸侧链与游离半胱氨酸残基之间的反应引起HBcAg之间的交联。也发现HBcAg亚单位的交联导致大小鈈确定的高分子量形式的形成，它们不能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

    当血管紧张肽部分与非天然分子支架通过一个赖氨酸残基连接时，置换或删除位于相对于SEQ ID NO：1位点7和96的位点处的自然存在的赖氨酸残基之一或全部以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基是有利的除去这些赖氨酸残基导致除去了可能破坏有序阵列的血管紧张肽部分的结合位点，应能提高终疫苗偶联物的质量和均一性

    在许多情况下，当对应于SEQ ID NO：1位点7和96的位点处自然存在的两个赖氨酸残基均被去除时向HBcAg中引入另一个赖氨酸作为血管紧张肽部分的附着位点。插入这种赖氨酸残基的方法在例如2002年1月18日提交的共同未决的美国申请号10/050,902中描述具体参照美国申请号10/050,902的实施例23(在此完整引用作为参考)。例如当对应于SEQ ID NO：1位点7和96嘚位点处自然存在的两个赖氨酸残基均被改变，并且试图利用异双功能交联剂将血管紧张肽部分与非天然分子支架附着时向HBcAg内引入一个賴氨酸残基通常是有利的。

    在一些实施方案中本发明的疫苗偶联物含有具有核酸结合活性的HBcAg(例如含有自然存在的HBcAg核酸结合域)。含有一个戓多个核酸结合域的HBcAg可用于制备显示出增强的T细胞刺激活性的疫苗偶联物因此，本发明的疫苗偶联物包括含有具有核酸结合活性的HBcAg的偶聯物另外还包括疫苗偶联物，以及这些偶联物在接种方案中的用途其中HBcAg与核酸结合。这些HBcAg在对个体施用之前可以与核酸结合或者可鉯在施用后与核酸结合。

    适用于本发明的其它HBcAg包括N端和C端截短突变体以及突变型蛋白，其氨基酸序列包含或由这样的氨基酸序列组成：咜们与上述截短突变体至少约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％相同

    如上所述，在本发明的某些实施方案中向构成非天然分子支架嘚一种多肽内引入一个赖氨酸残基作为第一附着位点。在优选实施方案中使用一种HBcAg制备本发明的疫苗偶联物，该HBcAg包含或由下列氨基酸组荿：SEQ ID NO：1的氨基酸1-144或氨基酸1-149或氨基酸1-185其经过修饰，使得对应于位点79和80的氨基酸被替换为具有氨基酸序列Gly-Gly-Lys-Gly-Gly的肽位点48和107处的半胱氨酸残基缺夨或被置换为另一种氨基酸残基，而位点61处的半胱氨酸仍在原处

    本发明还包括包含HBcAg片段的疫苗偶联物，该片段包含或由不同于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成该序列中不在SEQ IDNO：1相应位点处存在的半胱氨酸残基已经被删除。

    本发明的疫苗偶联物可包含不同HBcAg的混合物因此，这些疫苗偶联物可由氨基酸序列不同的HBcAg组成例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和修饰的HBcAg的疫苗偶联物在修饰的HBcAg中一个或多个氨基酸残基已经被妀变(例如缺失、插入或置换)。

    本发明还包括使用与另一种蛋白质融合的HBcAg制备非天然分子支架的疫苗偶联物如上所述，这种融合蛋白的一個例子是HBcAg/FOS融合蛋白适于在本发明的疫苗偶联物中使用的HBcAg融合蛋白的其它实例包括已经添加了一种有助于形成和/或稳定HBcAg二聚体和多聚体的氨基酸序列的融合蛋白。这种添加的氨基酸序列可与HBcAg的C端融合这种融合蛋白的一个实例是HBcAg与酿酒酵母GCN4螺旋区的融合蛋白，它通过非共价楿互作用形成同型二聚体可以用来制备并稳定HBcAg二聚体和多聚体。

    HBcAg/src同源3(SH3)域融合蛋白也可以用来制备本发明的疫苗偶联物SH3域是在大量蛋白質中发现的相对较小的域，它提供与蛋白质结合性配偶体中特定富含脯氨酸序列相互作用的能力(参见McPhersonCell Signal 11：229-238(1999))。HBcAg/SH3融合蛋白可以以几种方式使用首先，SH3域能够构成第一附着位点该位点可与血管紧张肽部分的第二附着位点相互作用。同样可以向HBcAg中添加富含脯氨酸的氨基酸序列，并作为对于血管紧张肽部分的SH3域第二附着位点的第一附着位点其次，SH3域能够与引入HBcAg内的富含脯氨酸区结合因此，SH3域和富含脯氨酸的SH3楿互作用位点可以被插入相同或不同的HBcAg内用来构成并稳定本发明的二聚体和多聚体。

    上述实例证实本领域技术人员应当知道如何由HBcAg和HBcAg衍生的突变型蛋白构成包含核心颗粒和第一附着位点的分子支架。应用本领域周知的技术和常规实验本领域普通技术人员应当理解如何類似地使用其它病毒构建分子支架。

    如本说明书其它部分所述病毒衣壳可用于(1)一种或多种血管紧张肽部分的呈递，和(2)本发明的疫苗偶联粅的制备特别是，在本发明的实施中有用的是病毒衣壳蛋白在此也称为“外壳蛋白”，它在表达后形成衣壳或衣壳样结构因此，这些衣壳蛋白能够形成核心颗粒和非天然分子支架这些衣壳或衣壳样结构通常形成有序、重复的阵列，后者可用于抗原决定簇的呈递和本發明的疫苗偶联物的制备

    一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)血管紧张肽部分可以通过任何方法与一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)形成病毒衣壳戓衣壳样结构(例如噬菌体外壳蛋白)的蛋白质以及其它蛋白质附着。例如血管紧张肽部分可以利用第一和第二附着位点附着于核心颗粒。此外也可以用一种或多种(例如1、2、3、4、5种等)异双功能交联剂使一种或多种血管紧张肽部分附着于一种或多种形成病毒衣壳或衣壳样结构嘚蛋白质。

    例如可以使用病毒衣壳蛋白或其片段制备核心颗粒和本发明的疫苗偶联物。例如噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳，它们是病毒样颗粒。另外，这些颗粒形成有序、重复的抗原阵列，能够在血管紧张肽部分嘚呈递和疫苗偶联物的制备中使用。

    在一个优选实施方案中病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地RNA-噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7；m)噬菌体AP205。

    在本发明的叧一个优选实施方案中病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr或RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。

    我们通过N端Edman测序发现在大腸杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端蛋氨酸通常被除去该方法如Stoll，E.等人J.Biol.Chem.252：990-993(1977)中所述。本发明的范围内也包括由其中N端蛋氨酸尚未去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP或者含有其中N端蛋氨酸被切除和仍然存在的Qβ外壳蛋白混合物的VLP。

    1.在本发明的一个更优选的实施方案中病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。

    3.在本发明的一个更优选的实施方案中病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳疍白或其片段组成。

    4.本发明的这一优选实施方案包含可形成衣壳的AP205外壳蛋白这些蛋白质重组表达或从天然来源制备。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中观察时AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：12)形成的衣壳与AP205RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法辨别。AP205VLP具有高度免疫原性能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生展示以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体产生針对这样展示的抗原的高滴度，这表明结合的抗原和/或抗原决定簇容易与抗体分子相互作用并且具有免疫原性。

    5.在本发明的一个更优选嘚实施方案中病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。

    6.AP205 VLP的可装配突变形式包括氨基酸5处的脯氨酸被置換为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO：13)，也可以在本发明中使用形成本发明的一个更优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原結合产生根据本发明的有序、重复的抗原阵列。

    8.分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法在2002年7月17日本申请人提交的题目为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请号60/396,126中描述，在此完整引用作为参考合适的大肠杆菌株包括但不限于：大肠杆菌K802、JM 109、RR1。合适的载体和菌株及其组合能够通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达而鉴定衣壳的形成和装配如下鉴定：首先任选通过凝膠过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(KozlovskaT.M.等人，Gene 137：133-37(1993))检测

    9.由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，鈳能缺乏最初的蛋氨酸AP205 VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。

    10.在本发明的一个更优选的实施方案中疒毒样颗粒包含、或基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。

    11.在本发明的一个更優选的实施方案中病毒样颗粒包含、或基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变型外壳蛋白的片段组成。

    12.在本发明中也可使用能够汾别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段可以通过内部删除或分别在外壳蛋白和突变型外壳蛋白的末端删除产生这些片段。只要与VLP装配相嫆向外壳蛋白和突变型外壳蛋白序列中插入，或抗原序列与外壳蛋白和突变型外壳蛋白序列融合是本发明的进一步的实施方案分别产苼嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果以及是否与VLP装配相容，能够通过电子显微镜检查确定

    13.由上述AP205外壳疍白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够被分离为纯化形式，分离方法是组合使用通过沉淀的分级分离步骤和通过凝胶过滤的純化步骤例如使用Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合，如2002年7月16日本申请人提交的题目为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请中所述在此完整引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法在本领域公知可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如美国专利号4,918,166描述了利用超速离心汾离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此完整引用作为参考

    根据本发明，一种或多种血管紧张肽部分可附着于RNA噬菌体外壳蛋白衣壳的一个亚单位仩RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳、特别是Qβ衣壳的每个亚单位偶联几个血管紧张肽部分的能力使得能够产生密集的血管紧张肽部分阵列。其它病毒衣壳通过化学交联可与血管紧张肽部分共价附着，例如在主要免疫显性区中含有一个赖氨酸残基的修饰的HBcAg(MIR；WO 00/32227)HBcAg刺突之间的距离(对应于MIR)是50埃(Wynne，SA.等人Mol.Cell 3：771-780(1999))，因此不能产生间距小于50A的血管紧张肽部分阵列

    Qβ外壳蛋白的衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的布局，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用其它4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特征有利于血管紧张肽部分附着于颗粒外部而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳在其表面也有数量确定的赖氨酸残基这些赖氨酸残基有确萣的布局。来源于RNA噬菌体的衣壳的另一个优点是它们在细菌中的高表达量这允许以可负担的成本大量生产材料。

    Qβ外壳蛋白的衣壳的另一个特征是其稳定性。Qβ亚单位通过二硫桥键彼此结合，共价连接亚单位。Qβ衣壳蛋白也显示对有机溶剂和变性剂不同寻常的抗性。我们惊奇地发现，能够使用高至约30％的DMSO和乙腈浓度和高至约1M的胍盐浓度而不影响衣壳的稳定性或形成血管紧张肽部分阵列的能力。因此可鉯使用这些有机溶剂偶联疏水分子，如某些血管紧张肽部分特别是对于在哺乳动物和人的免疫和接种中的用途而言，Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是一个重要特征衣壳对有机溶剂的抗性使得在水性缓冲液中不可溶的血管紧张肽部分或其衍生物能够偶联。

    美国专利号5,698,424描述了姠RNA噬菌体MS-2的外壳蛋白的N端β发夹中插入一个半胱氨酸残基，该专利在此完整引用作为参考。然而我们注意到，衣壳中存在暴露的游离半胱氨酸残基可通过形成二硫桥键导致衣壳寡聚化。上述美国专利中所述的其它附着涉及血管紧张肽部分与Qβ颗粒之间二硫桥键的形成。这些附着對含有巯基部分的分子不稳定

    最初Qβ上的半胱氨酸残基形成的二硫桥键与含有游离巯基残基的抗原之间的反应释放含巯基的形式，而不是血管紧张肽部分。这些新形成的含巯基形式能够与颗粒上存在的其它二硫桥键再次反应从而建立平衡。一旦与颗粒上形成的二硫桥键反應血管紧张肽部分即可与来自颗粒的半胱氨酸残基，或者与在颗粒上形成最初二硫桥键的离去基团分子的半胱氨酸残基形成二硫桥键洏且，使用一侧与Qβ颗粒上的半胱氨酸反应、另一侧与血管紧张肽部分上的赖氨酸残基反应的异双功能交联剂所述的其它附着方法可导致血管紧张肽部分在颗粒上的随机定向。

    我们进一步注意到与Qβ和Fr外壳蛋白的衣壳不同，美国专利号5,698,424所述的重组MS-2基本不含核酸而在上述兩种衣壳内包装有RNA。

    我们在此描述了本发明的允许形成坚固的血管紧张肽部分阵列的新的偶联物这些偶联物中含有不同密度的血管紧张肽表位。我们证实通过将血管紧张肽部分附着于VLP能够获得极高的表位密度。此外通过改变含有适当第一附着位点的残基的数量和类型吔能够修饰血管紧张肽部分的密度和间距。例如2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902公开了一种含有额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它比野生型Qβ外壳蛋白更适于获得高密度的阵列。此外，上述申请也公开了适于以适当间距同时展示几种抗原的偶联物，和以适当和唏望的方式添加辅助分子提高溶解度或修饰衣壳的偶联物其它Qβ外壳蛋白突变体、形成的衣壳(是病毒样颗粒)，在共同未决的美国专利申請号10/050,902中公开适于生产本发明的组合物。特别是当血管紧张肽部分和Qβ-血管紧张肽抗原阵列的可溶性限制了能够与Qβ病毒样颗粒附着的血管紧张肽部分的数量时，可以使用赖氨酸残基已经被置换为精氨酸(它没有与赖氨酸残基相同的反应性)的突变体。在制备这些组合物时鈳以用高浓度的血管紧张肽部分或经修饰含有第二附着位点的血管紧张肽部分阵列在突变型Qβ病毒样颗粒上的赖氨酸残基处获得完全反应，而不会象使用野生型Qβ病毒样颗粒时那样，产生可能不溶的含有较多附着的血管紧张肽部分的颗粒。

    几种RNA噬菌体的晶体结构已经被测定(GolmohammadiR.等人，Structure 4：543-554(1996))利用这些信息，本领域技术人员能够容易地鉴定表面暴露的残基并修饰噬菌体外壳蛋白以便能够插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此本领域技术人员能够容易地生产和鉴定可用于本发明中的噬菌体外壳蛋白的修饰形式。因此也可以用形成衣壳或衣壳样結构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的疫苗偶联物。

    尽管上述变异蛋白质嘚序列不同于其野生型但是这些变异蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此本发明还包括：包含可形成衣壳或衣壳样结構的蛋白质变体的疫苗偶联物，以及制备这些疫苗偶联物的方法用来制备这些疫苗偶联物的各种蛋白质亚单位。因此本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成有序、重复的阵列(例如可形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体)并保留结合并形成衣壳或衣壳樣结构的能力。C端和N端截短变体通常保留形成病毒样颗粒的能力因此，包括缺失、添加或置换在内的变体形式、嵌合形式和自然存在的變体是本发明的适当的成分

    细菌菌毛蛋白在输入细菌周质之前，通常被加工除去N端前导序列此外，本领域技术人员应当认识到用来淛备本发明的疫苗偶联物的细菌菌毛蛋白通常不含自然存在的前导序列。

    适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体实例是大肠杆菌的P-菌毛蛋白(GenBank報告AF237482)适用于本发明的大肠杆菌1型菌毛蛋白的一个实例是含有GenBank报告P04128所述氨基酸序列(SEQID NO：2)的菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603所示核苷酸序列的核酸编碼这些GenBank报告的完整公开内容在此引用作为参考。另外也常用上述蛋白质的成熟形式制备本发明的疫苗偶联物

    适用于本发明的细菌菌毛疍白或菌毛蛋白亚部分通常能够结合形成非天然分子支架。在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法为本领域周知例如，Bullitt等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：(1996)描述了大腸杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。此外Eshdat等人(J.Bacteriol.148：308-314(1981))描述了适于分离大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。简言之这些方法如下：通过在饱和盐酸胍中37℃下孵育裂解菌毛。然后通过层析纯化菌毛蛋白之后用5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体Eshdat等人也发现，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.0)透析后菌毛蛋白二聚体重装配形成菌毛蛋白。

    另外例如使用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛疍白使之含有第一附着位点，血管紧张肽部分通过第二附着位点与之连接此外，血管紧张肽部分也可以通过第二附着位点与这些蛋白質中自然存在的氨基酸残基直接连接这些修饰的菌毛蛋白然后可用于本发明的免疫性偶联物。

    用来制备本发明偶联物的细菌菌毛蛋白可鉯用类似于此处所述对HBcAg修饰的方式进行修饰例如，可以将半胱氨酸和赖氨酸残基删除或置换为其它氨基酸残基并且可以向这些蛋白质Φ添加第一附着位点。此外菌毛蛋白也可以以修饰形式表达，或者可以在表达后进行化学修饰类似地，也可以从细菌中收获完整的菌毛然后进行化学修饰。

    在另一个实施方案中从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛样结构，用来形成本发明的疫苗偶联物适于制备疫苗偶联物的一个实例是大肠杆菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体构成

    本领域周知多种收获细菌菌毛的方法。例如Bullitt和Makowski(Biophys.J.74：623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法从含有P-菌毛质粒的多菌毛大肠杆菌上剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀嘚多个循环纯化2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902公开了从自然产生菌毛或者已经导入编码负责菌毛产生的fim操纵子的载体的细菌Φ收获和纯化I型菌毛。

    一旦收获后即可用多种方式修饰菌毛或菌毛样结构。例如可以向菌毛中添加第一附着位点，一种或多种血管紧張肽部分可通过第二附着位点与之连接换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构形成非天然分子支架。

    也可以在没有非天然苐一附着位点的情况下通过血管紧张肽部分的附着修饰菌毛或菌毛样结构例如，抗原或抗原决定簇可以被连接到自然存在的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上在这些情况下，自然存在的氨基酸残基的高度有序和重复性将引导血管紧张肽部分与菌毛或菌毛样结构偶联例如，使用异双功能交联剂菌毛或菌毛样结构可以与血管紧张肽部分的第二附着位点连接。

    当使用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的疫苗偶联物时遗传改造这些生物使它们产生具有所希望的特征的结构通常是有利的。例如当使用大肠杆菌1型菌毛时，可以修饰收获菌毛的大肠杆菌使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的实例包括一个或多个赖氨酸残基的插入、一个或多个自然存在的赖氨酸残基的缺失或置换、一个或多个自然存在的半胱氨酸残基的缺失或置换(例如SEQ ID NO：2位点44和84处的半胱氨酸残基)

    另外也可以对菌毛蛋白基因進行其它修饰，产生含有并非赖氨酸残基的第一附着位点(例如FOS或JUN域)的表达产物当然，合适的第一附着位点通常仅限于不妨碍菌毛蛋白形荿适于在本发明的疫苗偶联物中使用的菌毛或菌毛样结构的位点重组菌毛蛋白形成菌毛的能力可以用包括电子显微镜检查在内的多种方法测定。

    细菌细胞中自然存在的菌毛蛋白基因可以在体内修饰(例如通过同源重组)或者可以将具有特定特征的菌毛蛋白基因插入这些细胞內。例如可以将菌毛蛋白基因导入细菌细胞中，作为复制型克隆载体或插入细菌染色体内的载体的一种成分插入的菌毛蛋白基因也可鉯与表达调节控制序列(例如lac操纵子)连接。

    在大多数情况下在本发明的疫苗偶联物中使用的菌毛或菌毛样结构由一种类型的菌毛亚单位构荿。然而本发明的偶联物也包括包含由异源菌毛蛋白亚单位构成的菌毛或菌毛样结构的疫苗。通常使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛樣结构因为预期它们能够形成表现为高度有序、重复抗原阵列的结构。

    第二附着位点本发明提供了有序、重复阵列的分子支架的制备，包括高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白衣壳的偶联物如本领域普通技术人员应当理解的，血管紧张肽部分的性质和该部分上第二附着位点嘚性质和位置是可能影响构建本发明的偶联物的方法和这些偶联物诱发免疫应答的效果的重要因素。

    设计第二附着位点的一个前提条件昰融合、插入或基因改造或附着位点的选择熟练技术人员应当知道如何找到选择第二附着位点的位置的指示，可以考虑与这种决定有关嘚多种因素血管紧张肽部分的化学和/或晶体结构可以提供关于适于偶联的分子结构域的可用性的信息。一种反应性结构域的溶剂可及性鈳能是与第一附着位点化学偶联的动力学的限制因素适于偶联的基团必须是可以利用的，如巯基残基如果用血管紧张肽部分免疫旨在抑制血管紧张肽部分(也可能是一种自身抗原)与其天然配体(如底物或受体)的相互作用，通常添加第二附着位点以便产生针对与天然配体相互作用的位点的抗体。因此选择第二附着位点的位置避免第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方案中希朢有针对一种位点的抗体应答，该位点不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点在这些实施方案中，选择第二附着位点防止产生針对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。考虑的其它因素包括血管紧张肽部分的性质、其生物化学性质如pI、电荷分布、进一步嘚修饰通常优选柔性接头。

    选择第二附着位点位置的其它标准包括：血管紧张肽部分的寡聚状态、寡聚位点、辅因子的存在以及现有的揭示该部分结构和序列中存在如下位点的实验证据：该位点的修饰与功能部分相容或者适于产生可识别该部分、优选地可阻断该血管紧張肽部分的功能的抗体。在某些实施方案中向血管紧张肽部分序列的C端或N端添加一个或多个其它氨基酸(产生非自然存在的第二附着位点)，以确保特别是血管紧张肽部分与根据本发明的病毒样颗粒定向、有序地结合

    多肽抗原与VLP、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳附着的一个特别优选的方法是RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳表面的赖氨酸残基与抗原上的巯基残基(如半胱氨酸残基中所见)连接。类似地血管紧张肽部分上嘚游离巯基也可能是有效的附着位点。为了作为第二附着位点氧化的巯基必须是还原状态，可以用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇进行还原

    根据夲发明，通过选择交联剂和其它反应条件能够调节RNA噬菌体外壳蛋白衣壳上的表位密度例如，用交联剂Sulfo-GMBS和SMPH能够获得高表位密度高浓度反應物正向影响衍化，可以用操作反应条件来控制与RNA噬菌体衣壳蛋白偶联的、特别是与Qβ衣壳蛋白偶联的抗原数量。另外，核心颗粒上第一附著位点的数量是影响血管紧张肽部分阵列的密度的另一个因素在本发明的一个实施方案中，我们提供了一种含有额外赖氨酸残基的Qβ突变型外壳蛋白，它适于获得更高密度的阵列。

    在最优选的实施方案中血管紧张肽部分包含单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，它们分别能够与核心颗粒和VLP或VLP亚单位上的第一附着位点结合这确保了至少1个、一般1个以上、优选地超过10、20、40、80、120个抗原分别与核心颗粒和VLP固定、均匀地结合、连接。因此抗原上单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点确保了一种单一、均匀类型的结合和连接，分別产生极其高度有序、重复的阵列例如，如果通过赖氨酸(作为第一附着位点)和半胱氨酸(作为第二附着位点)的相互作用分别实现结合和连接根据本发明该优选实施方案，确保每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接而无论该半胱氨酸残基在抗原上是自然存在还是非自然存在。

    在本发明的一个更优选的实施方案中共价键是一种非肽键。

    在一些实施方案中在抗原仩构建第二附着位点需要融合氨基酸接头，根据本发明的公开内容该接头含有适于作为第二附着位点的氨基酸。因此在本发明的一个優选实施方案中，一个氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成在┅个更优选的实施方案中，氨基酸接头包含一个巯基或半胱氨酸残基在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸氨基酸接头嘚一些选择标准以及根据本发明的氨基酸接头的优选实施方案在上文中已经提及。

    在本发明的一个更优选的实施方案中至少一种抗原或忼原决定簇，即PrP蛋白、PrP肽或PrP域分别与核心颗粒和病毒样颗粒融合。如上所述VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此在本发明嘚一个更优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇优选地至少一种血管紧张肽部分，与病毒样颗粒或一种能够掺入VLP内的蛋白质的至少一种亞单位融合产生嵌合VLP-亚单位-血管紧张肽部分融合蛋白。

    血管紧张肽部分的融合可以按如下实现：插入VLP亚单位序列内或与VLP亚单位或能够摻入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中当提到一种肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内嘚内部插入

    也可以通过向VLP亚单位变体内插入血管紧张肽部分的序列来实现融合，其中亚单位序列的一部分缺失被称为截短突变体。截短突变体可能有VLP亚单位序列N端或C端缺失或内部的一部分缺失例如，氨基酸残基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体血管紧张肽部汾与截短突变体VLP-亚单位的N端或C端的融合也是本发明的实施方案。同样一种表位向VLP亚单位序列内的融合也可以通过置换实现，例如对于特萣VLP HBcAg用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此如下文所述，实现融合的方法包括：向VLP亚单位的序列中插入血管紧张肽部分序列用血管紧张肽蔀分序列置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合

    嵌合血管紧张肽部分-VLP亚单位通常能够自装配为VLP。展示与其亚单位融合嘚表位的VLP在此也称为嵌合VLP如所说明的，病毒样颗粒包含或由至少一种VLP亚单位组成在本发明的一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不含融合抗原的VLP亚单位)的混合物组成产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可能是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高

    可以将侧翼氨基酸残基添加到与VLP亚单位序列任一端融合的肽或表位序列的任一端，或者向VLP亚单位序列内部插入这种肽序列甘氨酸和丝氨酸残基是特别优选的氨基酸，可以在添加到待融合的血管緊张肽部分的侧翼序列中使用甘氨酸残基提供额外的柔韧性，这可降低外源序列与VLP亚单位序列融合时可能的去稳定作用

    在一个更优选嘚实施方案中，至少一种血管紧张肽部分与一种Qβ外壳蛋白融合。已经描述了融合蛋白构建体，其中表位与Qβ A1蛋白截短形式的C端融合或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人Intervirology，39：9-15(1996))A1蛋白是通过UGA终止密码子的抑制产生的，长度为329个氨基酸或者如果考虑N端蛋氨酸的切除，为328个氨基酸丙氨酸(QβCP基因编码的第二个氨基酸)之前的N端蛋氨酸的切除通常在大肠杆菌中发生，Qβ外壳蛋白CP的N端也是如此位于UGA琥珀密码子3’的A1基因的一部分編码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个血管紧张肽部分产生本发明的另外的实施方案(KozlovskaT.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))血管紧张肽部汾在C端截短的QβA1蛋白C端的融合产生本发明的更优选的实施方案。例如Kozlovska等人(Intervirology 39：9-15(1996))描述了Qβ A1融合蛋白，其中该表位在位点19处平截的Qβ CP延伸的C端融合

    如Kozlovska等人(Intervirology 39：9-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要存在A1蛋白-血管紧张肽部分融合和野生型CP才能形成镶嵌颗粒。然而本发明的范围内也包括包含病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP(其仅仅由融合至少一个血管紧张肽部分的VLP亚单位组成)的实施方案。

    镶嵌颗粒的產生可以用许多方法实现Kozlovska等人，Intervirology 39：9-15(1996)描述了两种方法它们均能在本发明的实施中使用。第一种方法通过在大肠杆菌株中表达在CP与CP延伸の间含有一个UGA终止密码子的编码QβA1融合蛋白的质粒，介导VLP上融合表位的有效展示该大肠杆菌株携带编码克隆的UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(SmileyB.K.等人Gene 134：33-40(1993))。另一种方法将CP基因终止密码子修饰为UAA，与表达A1蛋白-血管紧张肽部分融合蛋白的第二种质粒共转化该第二种质粒編码一种不同的抗生素耐药性，其复制起点与第一种质粒相一致(KozlovskaT.M.等人，Intervirology 39：9-15(1996))第三种方法，CP和A1蛋白-血管紧张肽部分融合蛋白以双顺反子的形式编码与一种启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人Intervirology 39：9-15(1996)的图1所示。

    表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白N端突起的β-发夹中的融合以及随后融合表位茬RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递，也已经被描述(WO 92/13081)血管紧张肽部分通过插入或置换融合到MS-2 RNA噬菌体的外壳蛋白内也属于本发明的范围。

    在本发明嘚另一个实施方案中血管紧张肽部分与能够掺入TyVLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中血管紧张肽部分与p1或TYA基因编码的衣壳蛋白融合(Roth，J.F.Yeast 16：785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和SandmeyerS.B.，“酵母转座因子”《酵母的分子和细胞生物学：基因组动力学、蛋白质合成和能量学》，p.193Cold Spring HarborLaboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物组分的copia类别有关而Ty3属于逆转录轉座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白也被称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸在VLP的成熟过程中p1在位点408处被切割，产生p2蛋白后者是VLP的基本成分。

    与p1的融合蛋白和在酵母中表达所述融合蛋白的载体已经被描述(AdamsS.E.等人，Nature 329：68-70(1987))例如，通过向pMA5620質粒的BamHI位点内插入编码血管紧张肽部分的序列该血管紧张肽部分可以与p1融合(Adams，S.E.等人Nature 329：68-70(1987))。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合疍白的表达该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合同样，血管紧张肽部分的N端融合或向p1序列内的内部插入，或p1序列┅部分的置换也属于本发明的范围。具体而言血管紧张肽部分被插入Ty序列内Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间(EP0677111)，产生本发明的优选实施方案

    夲文描述了核心颗粒与血管紧张肽部分结合的不同方法，并在2002年1月18日提交的共同未决的美国专利申请号10/050,902中进一步描述在此完整引用作为參考。方法包括JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白域分别用作本发明的第一和第二附着位点。

    本发明的优选实施方案包括非天然分子支架与血管紧张肽蔀分通过化学交联偶联已经研制了大量化合物来促进蛋白质/肽的交联或蛋白质与衍化分子(例如血管紧张肽部分)的偶联。包括但不限于本領域技术人员周知的羧酸衍化的活性酯(活化的化合物)、混合酸酐、酰卤、酰基叠氮、烷基卤、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯它们能够与蛋白质分子的反应性基团形成共价键。根据活性基团的不同反应性基团是一种蛋白质分子上的赖氨酸残基的氨基，或┅种载体蛋白质或修饰载体蛋白质分子中的硫醇基它们在反应时导致酰胺、胺、硫醚、脒、脲或硫脲键的形成。本领域技术人员可以确萣其它合适的活性基团例如，见普通参考文献如《(蛋白质偶联和交联的化学》(Wong(1991)CRC Press，Inc.Boca Raton，Fla.)大多数试剂优先与赖氨酸侧链基团反应。

    在一些实施方案中使用异双功能交联剂，使血管紧张肽部分通过化学交联附着于核心颗粒有几种异双功能交联剂在本领域公知。在一个实施方案中异双功能交联剂含有一个能够与核心颗粒的赖氨酸残基的侧链氨基反应的功能基团，以及另一个能够与血管紧张肽部分上存在(鈳通过还原使之能够参与反应)或构建(任选地也可通过还原使之能够参与反应)的半胱氨酸残基或巯基反应的功能基团该方法的第一步，称為衍化是核心颗粒与交联剂反应。反应产物是活化的核心颗粒也称为活化载体。第二步用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的茭联剂。第三步抗原(例如血管紧张肽部分)与活化的核心颗粒反应，该步骤被称为偶联步骤未反应的抗原任选地可在第四步除去。

    在一個替代实施方案中用适于交联第一附着位点的活性部分衍化血管紧张肽部分，产生活化的血管紧张肽部分这种衍化可以在分离的血管緊张肽部分上发生或者通过化学合成发生。活化的血管紧张肽部分然后与核心颗粒反应从而发生偶联。

    有几种异双功能交联剂在本领域公知包括交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它可利用的交联剂，例如可从Pierce Chemical Company(RockfordIL，USA)获得含有一个氨基反应性的功能基团和一个SH残基反应性的功能基团。上述交联剂均能导致硫醚键的形成适用于本发明的另一类交联剂，其特征在于偶联后在血管紧张肽部分与核心颗粒之间引入一個二硫键属于这一类的交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)根据有机化学领域的反应理论，众所周知交联剂衍化核心颗粒的程度可能受不同实验条件影响，如每个反应物的浓度一种试剂相对于另一种试剂的过量程度，pH温度和离子强度。偶联程度即每个载体上血管紧张肽部分的數量，可通过改变上述实验条件来调节以满足疫苗的要求。血管紧张肽部分的溶解度可能限制能够在每个亚单位上偶联的抗原的数量當获得的疫苗不可溶时，减少每个亚单位上抗原的数量是有利的

    在一个具体实施方案中，化学试剂是异双功能交联剂ε-马来酰亚氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Tanimori等人J.Pharm.Dyn.4：812(1981)；Fujiwara等人，J.Immunol.Meth.45：195(1981))其含有(1)氨基反应性的琥珀酰亚胺基，和(2)SH基反应性的马来酰亚胺基可以改造第一附着位点的异源蛋白质或多肽，使之含有一个或多个赖氨酸残基作为异双功能交联剂的琥珀酰亚胺部分的反应部分。一旦与异源蛋白质的赖氨酸残基囮学偶联异双功能交联剂的马来酰亚胺基即可与抗原或抗原决定簇上半胱氨酸残基的SH基反应。在此情况下抗原或抗原决定簇的制备可能需要构建一个巯基作为第二附着位点，使其可与交联剂上的游离马来酰亚胺功能基团反应而该交联剂与非天然分子支架第一附着位点結合。因此在这种情况下，异双功能交联剂与非天然分子支架的第一附着位点结合并且将该支架与血管紧张肽部分的第二结合位点连接。

    血管紧张肽部分与核心颗粒偶联的其它方法包括血管紧张肽部分与核心颗粒利用碳二亚胺键交联的方法这包括碳二亚胺EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS。一种方法EDC与含有游离羧酸、氨基或氨基部分的血管紧张肽部分混合，然后添加到蛋白质载体上其它方法中，使用同双功能交联剂如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，RockfordIL，USA)或其它已知的均一双功能交联剂(其含有对核心颗粒的胺基或羧基具有反应性的功能基团)使该部分附着于核心颗粒。

    将核心颗粒与血管紧张肽部分结合的其它方法包括核心颗粒被生物素标记、该部分与链霉亲和素融合的方法戓该部分和核心颗粒均被生物素标记的方法。在这种情况下通过调节血管紧张肽部分与链霉亲和素的比例，首先使该部分与链霉亲和素戓亲和素结合使得仍有游离结合位点可与下一步添加的核心颗粒结合。此外也可以在“一锅”反应中混合所有成分。其它配体-受体对吔可以作为结合血管紧张肽部分与核心颗粒的结合剂其中有能够与核心颗粒或血管紧张肽部分交联的受体和配体的可溶形式。

    因此本發明的一个方面是提供适用于针对血管紧张肽部分免疫的这些部分的有序、重复阵列。优选的血管紧张肽部分是包含或由血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其片段组成的如上所述，可以向血管紧张肽部分序列的C端或N端适当添加一个或多个额外氨基酸以确保特别是血管紧张肽部分与核心颗粒定向、有序的结合。

    在本发明的偶联物和制剂中使用的优选的血管紧张肽部分是包含或由血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的全长序列组成的优选地，血管紧张肽部分包含或由下列序列组成：血管紧张肽II的全长序列如CGGDRVYIHPF(在此称为“Angio 1”；血管紧张肽序列之外的氨基酸用斜体表示)，或血管紧张肽I的全长序列如CGGDRVYIHPFHL(“Angio 2”)，DRVYIHPFHL GGC(“Angio 3”)和CDRVYIHPFHL(“Angio 4”)其它优选的实施方案是包含或由血管緊张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II序列的片段组成的血管紧张肽部分。一些这样的实施方案包括包含或由血管紧张肽C端的至少3个氨基酸組成的血管紧张肽部分在一个替代实施方案中，其N端的至少4个氨基酸被删除其它有关实施方案包括来源于血管紧张肽I的血管紧张肽部汾，如CHPFHL(“Angio 5”)和CGPFHL(“Angio6”)或来源于血管紧张肽II的血管紧张肽部分，如CYIHPF(“Angio7”)、CGIHPF(“Angio 8”)和CGGHPF(“Angio 9”)

    然而，本领域普通技术人员应当理解血管紧张肽部汾的上述例子是非限制性实例，为了偶联在C端或N端添加的氨基酸的数量和性质可能不同

    在本发明中，用于免疫的血管紧张肽部分不是必須含有任何特定血管紧张肽部分的全部完整分子可以使用血管紧张肽部分的片段或其衍生物、突变体或突变型蛋白产生对目的血管紧张肽部分的适当免疫应答。

    本发明包括不同的连接位点和血管紧张肽部分与核心颗粒的连接方法本文的其它部分描述了其非限制性实例。優选的连接位点和连接方法也可由普通熟练技术人员根据已有经验、理论和常规实验确定

    本发明提供可用于预防和/或缓解与RAS的一种或多種成分(特别是一种或多种血管紧张肽部分)有关的疾病的偶联物。本发明还提供用来预防和/或缓解个体、特别是动物(如哺乳动物特别是人)疾病或病症的接种方法。在一个优选实施方案中本发明的偶联物和制剂刺激免疫应答，导致可与一种或多种血管紧张肽部分结合的免疫汾子(包括抗体)的产生本发明还提供用来预防和/或缓解个体的RAS相关疾病或病症的接种方法。

    免疫应答的性质或类型不是本公开内容的限制性因素根据本领域众所周知的原则，根据疾病的不同治疗或预防性免疫应答所希望的结果可能不同。下面的技术性说明并非意在限制夲发明本发明的偶联物可诱导与一种以上血管紧张肽部分结合的抗体，从而同时阻断所有相关的血管紧张肽种类或者，诱导的抗体可特异性结合血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的C端在这些条件下，诱导的抗体将阻断肾素或ACE分别对血管紧张肽原或血管紧张肽I的噭活然而，不同于ACE或肾素的蛋白酶如内肽酶和氨肽酶，能够从N端降解血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II从而阻止与抗体结合嘚完整的血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的积累。

    此外根据本领域公知的原则，根据不同疾病可能希望刺激不同类型的免疫應答。例如众所周知，某些免疫应答比其它免疫应答更适于特定抗原某些免疫应答实际上是不适当的，能够引起病状如病理性炎症。

    抗原性质、导入体内的途径、剂量、给药方案、抗原的重复性质、宿主背景和免疫系统的信号传导因子可能够影响免疫应答的性质这些知识在本领域众所周知。同样利用本领域公知的理论和常规实验可以调整免疫应答。

    此外本发明还包括在对血管紧张肽部分接种过程中使用不同的核心颗粒。对核心颗粒如菌毛产生强烈免疫应答的个体可以用包含相同血管紧张肽部分但核心颗粒不同的偶联物免疫。

    鈈希望局限于理论作为产生免疫应答的药物制剂，特别是作为针对一种或多种血管紧张肽部分的疫苗本发明的现有偶联物具有新的出囚意料的优点。本领域周知的其它载体包括BSA、匙孔血蓝素、破伤风类毒素、细菌外膜蛋白、霍乱毒素和铜绿假单胞菌外毒素A，对个体可能不适用特别是对于人。上述载体可诱发变态反应或刺激病理性免疫应答(例如霍乱毒素、KLH、BSA)。上述载体可能需要使用佐剂如现在认為不适于人用的弗氏完全佐剂。有大量载体可能是现有疫苗的成分(例如破伤风类毒素、霍乱毒素、外毒素A)。因此一个个体可能已经具囿对这些载体的高水平免疫，因此用抗原-载体偶联物免疫将比新型抗原诱发针对载体的相对更强的免疫应答由于其中一个或全部这些原洇，本发明的偶联物和制剂与上述载体蛋白相比是有益的改进

    在本发明实施方案的应用中，与核心颗粒偶联的一种或多种血管紧张肽部汾能够被抗原呈递细胞摄取从而刺激T细胞辅助诱发免疫应答。T辅助细胞应答可被分为1型(TH1)和2型(TH2)T辅助细胞应答(RomagnaniImmunol.Today 18：263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素-γ和其它细胞因子，引发B细胞产生IgG1-3抗体相反，TH2细胞产生的一种重要细胞因子是IL-4它使B细胞产生IgG4和IgE。在许多实验系统中TH1和TH2应答的发展互相排斥，因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导反之亦然。因此引发强烈TH1应答的抗原同时抑制TH2应答的发展，因此抑制IgE抗体的产生有趣的是，实际上所有疒毒都在宿主中诱发TH1应答但不能引发IgE抗体的产生(Coutelier等人，J.Exp.Med.165：64-69(1987))IgE同型抗体是变态反应的重要成分。肥大细胞在其表面结合IgE抗体并且在特异忼原与结合在肥大细胞表面的IgE分子结合后，释放组胺和变态反应的其它介质TH1应答典型的同型模式不限于活病毒，用灭活或重组病毒颗粒吔可观察到(Lo-Man等人Eur.J.Immunol.28：98))。因此利用本发明的方法(例如AlphaVaccine技术)，病毒颗粒能够装载不同的血管紧张肽部分用于免疫。由于产生这种阵列的“疒毒结构”将引发TH1应答，产生“保护性”IgG1-3抗体并且阻止产生引起变态反应的IgE抗体。因此本发明包括能够诱发优选的免疫应答(特别是TH1型应答)的偶联物。此外本发明还包括本发明的偶联物对抗由针对目的抗原的其他疫苗诱发的变态反应的用途。

    本发明的另一个有利特征昰血管紧张肽部分可以在颗粒上以有序、重复的阵列存在，无论是否有T细胞辅助均能够诱发有效的免疫应答。本发明的这一特征特别囿用

    与分离的蛋白质不同，在不使用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下病毒均诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann &Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15：235-270(1997))尽管病毒通常仅含极少的蛋白质，但它们比其分离成分能引发更强的免疫应答对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和順序许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示有序的表位阵列可有效交联B细胞上表位特异性免疫球蛋白(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17：553-558(1996))B细胞上表面免疫球蛋皛的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞T辅助细胞随后诱導B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体的转换，以及长期B细胞记忆的产生一这是所有接种的目标(Bachmann &ZinkernagelAnn.Rev.Immunol.15：235-270(1997))。本发明提供一种提高接种效果的方法是通過血管紧张肽部分与核心颗粒结合，提高用于免疫的血管紧张肽部分的重复程度如前所述，本发明提供所含的核心颗粒经修饰改变了形荿体(orgnizer)数量和/或排列的偶联物

    如果接受个体能够耐受本发明偶联物的施用，则认为该偶联物是“药物学可接受的”进而，本发明的偶联粅将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用

    为了诱发免疫应答，可以用本领域周知的多种方法对动物(适当地为哺乳动物洳人)施用本发明的偶联物，但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法给药该偶联物也可肌肉内、静脉内、经粘膜、經皮肤或皮下施用。给药制剂的成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水性溶液和悬液非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和注射用有机酯如油酸乙酯可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。

    本发明的其它实施方案包括用本发明的偶聯物免疫产生的免疫分子免疫分子包括抗体和T细胞受体。这些免疫分子可用于接种的个体结合一种或多种靶性血管紧张肽部分。当转迻给未对本发明的偶联物或制剂免疫的另外的个体时免疫分子也可能是有用的，从而“被动”转移了免疫在一个实施方案中，免疫分孓是一种抗体可以将适于结合一种或多种血管紧张肽部分的一种单克隆抗体转移到个体内，实现治疗或预防

    本发明也包括用本发明的耦联物免疫产生的抗体在试剂盒中的使用，用于通过免疫测定(例如ELISA)检测一种或多种血管紧张肽部分在一个相关实施方案中，血管紧张肽蔀分的重复、有序阵列能够用于通过结合试验检测这些部分的抗体本发明的其它实施方案包括生产本发明的偶联物的方法，和使用这些耦联物进行医学治疗的方法特别是治疗一种或多种RAS相关疾病，如高血压、中风、梗塞、充血性心力衰竭、肾衰竭或视网膜出血

    本领域普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下可以对此处所述的方法和用途进行适当的调整和修改。现在巳经详细描述了本发明通过下列实施例将能更清楚地理解本发明，这些实施例只是用于说明并非意在限制本发明。

    实施例1：来源于血管紧张肽I和血管紧张肽II的肽与Qβ的偶联，以及用获得的偶联物对小鼠的免疫

    应当注意到人和鼠的血管紧张肽序列彼此相同。因此分别鼡本发明的包含血管紧张肽部分作为抗原决定簇的疫苗或偶联物免疫人或小鼠，是针对自身抗原的接种

    检测同一小鼠的免疫前血清作为對照。用与Qβ或其它载体交联的无关肽免疫小鼠，用其血清进行对照ELISA实验表明检测到的抗体是对各自肽特异的抗体。ELISA滴度计算为在ELISA中产苼半数最大信号(最大光密度的50％)的血清稀释度倒数

    Angio 5和Angio 6的结果表明，能够诱导选择性识别血管紧张肽I的肽此外，Angio 7-9的结果表明能够诱导選择性识别血管紧张肽II而非血管紧张肽I的抗体。血管紧张肽I和II仅在C端有两个氨基酸不同而仍有8个氨基酸相同，这些结果证实Angio 5或Angio6诱导的所有抗体均选择性识别血管紧张肽I的C端，而Angio 7-9、特别是Angio 8-9诱导的抗体选择性识别血管紧张肽II的C端因此，共有的8个氨基酸不被识别特别是共囿的N端不被识别。这表明当结合时N端不会被埋藏于抗体内部，因此蛋白酶可及

    为了清楚地理解，已经通过说明和实施例全面、详细地描述了本发明本领域普通技术人员应当理解，在广泛和相当范围的条件、组成和其它参数内修改或改变本发明也能够进行本发明，而鈈影响本发明或其任何具体实施方案的范围这些修改或改变将包括在附加权利要求的范围之内。

    本说明书中提到的所有公开文本、专利囷专利申请均代表本发明所属领域技术人员的技术水平在此引用作为参考，如同每个公开文本、专利或专利申请特别地、单独地被指出莋为参考引用

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