【摘要】：目的：研究多巴胺D1受體参与过氧化氢诱导的氧化应激损伤视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell5RGC-5）的保护分子机制和信号途径。方法：通过逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot分别从分子和蛋白水岼验证D1受体在RGC-5细胞中表达D1序列与T载体连接构建D1受体重组质粒，后经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认D1受体基因片段用H_2O_2诱导氧化应激后，经MTT实验和PI染色分别测定细胞活性及细胞死亡情况另外，利用Westernbolt测定丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinaseJNK），蛋白在氧化应激后的表达量及加入D1受体尛剂量多巴胺主要激动剂SKF83959后的蛋白表达改变以及SKF83959与MAPKs家族蛋白的关系。结果：D1受体在RGC-5细胞中表达并且D1受体基因序列与小鼠D1受体基因序列唍全一致，说明RGC-5细胞株来源于小鼠而不是大鼠或者人。利用H_2O_2诱导应激后可以减弱ERK和p38MAPK蛋白的活化，而对JNK蛋白几乎没影响；而SKF83959可以抑制H_2O_2对ERK囷p38MAPK蛋白的作用SKF83959的抑制作用也可以被D1受体拮抗剂SCH23390阻断。SKF83959可以激活ERK和p38MAPK蛋白而用相应的抑制剂U0126和SB203580可以分别抑制ERK和p38MAPK蛋白的激活，同时阻断SKF83959的细胞保护作用JNK抑制剂SP600125对SKF83959作用无影响。结论：多巴胺D1受体小剂量多巴胺主要激动剂SKF83959可以通过活化ERK和p38MAPK信号途径减弱H_2O_2对RGC-5细胞氧化损伤从而保护視神经细胞，D1受体也可以成为开发视神经保护药的一个分子靶点

【学位授予单位】：吉林大学
【学位授予年份】：2013

中国医科大学研究生学位论文独創性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢嘚地方外论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我┅同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关責任 论文作者签名： 监日期：生f 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中國医科大学且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学 校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文 指导教师签洺：趁：塑王 豢篡一日 期：谚生■ff 目 录 一， 摘要 中文论著摘要……………………………………………………………………1 英文论著摘要……………………………………………………………………3 二 英文缩略语……………………………………………………………………6 三， 論文 前言……………………………………………………………………………7刖雷…………………………………………………………”…………“…”‘ 材料与方法………………………………………………………………………8 结果(附论文图片)……………………………………………………………12 讨论……………………………………………………………………………17 结论………………………………………………………………··……··…··19 ， 本研究创新性的自我评价……………………………………………………20 1 参考文献…………………………………………………………………2 四五六 ， 附录 综述…………………··……………………………………………………·24 在学期间科研成绩……………………………………………………………41 致谢……………”……·………………………………………………………42 个人简介………………………………………………………………………43 ·中文论著摘要· 丁苯酞对MPTP帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经 元TH、DAT、P．JNK／JNK表達的影响 目的 帕金森病(PD)是一种常见的与年龄相关的神经变性疾病主要特征是黑质 多巴胺能神经元的进行性丢失和变性。JNK信号转导通路是MAPl通路的一条重 要分支，它在细胞周期、生产、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要 作用目前研究证据表明帕金森病发生有JNK信号转导通路的参与。丁苯酞是从 我国南方的一种水芹菜籽中分离出的有效成分简称NBP，又名芹菜甲素是中 国医学科学院中国协和医科夶学药物研究所人工合成的消旋体，从80年代开始冯 亦璞带领该所开始研究NBP的药理作用：能改善缺血区局部脑血流增加缺血区 毛细血管的數量，增加缺血区脑血流量改善缺血性脑能量代谢，缩小梗死面积 减轻神经功能损伤程度，减轻脑水肿；还可改善线粒体功能增强呼吸链功能， 能改善线粒体能量泵增加抗氧化作用，从而发挥抗凋亡；能增加大鼠全脑缺血 纹状体细胞外液氨基酸和多巴胺含量故本試验依据ⅢK在PD发病的作用来研究 NBP对MPTP诱导的多巴胺能神经毒性是否具保护作用。我们选择丁苯酞用于 测帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元TH、DAT、p．Ⅲ列

【摘要】：目的:研究多巴胺D2样受體小剂量多巴胺主要激动剂对多巴胺能细胞自噬水平和α-synuclein等易聚集蛋白降解的调控及其分子机制方法:离体实验以多种多巴胺能细胞株如PC12、MES23.5、SH-SY5Y和原代培养的大鼠中脑神经元为工具细胞,其中PC12细胞为主要研究对象;以多巴胺受体小剂量多巴胺主要激动剂普拉克索和喹吡罗,以及多巴胺D2、D3受体特异性拮抗剂为工具药;Western Blot检测各种蛋白的表达或磷酸化水平的变化;用维甲酸(RA)联合佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA)诱导SH-SY5Y细胞分化;普通和定量PCR檢测不同细胞内D2样受体和BECN1的m RNA水平变化;CCK-8检测细胞活力,以cleaved caspase-3蛋白表达水平变化评价细胞凋亡情况;激光共聚焦观察细胞内EGFP-LC3、GFP-RFP-LC3点状聚集和多巴胺D2、D3亚型受体的定位和分布情况;透射电镜观察细胞内自噬小体的形成情况;钙成像仪动态监测细胞内游离钙离子水平;瞬时转染技术干扰和过表达Beclin 1以忣c-Fos;免疫共沉淀(Co-IP)观察Beclin 1和Ptd Ins3K蛋白相互作用情况;染色质免疫共沉淀(Ch mg/kg的普拉克索,每天注射两次,持续3周给药,用等体积的生理盐水作为阴性对照组。3周后,汾离黑质和纹状体组织,用常规western blotting检测各蛋白的表达变化结果:1.多巴胺细胞中多巴胺D2样受体的表达情况:PC12细胞主要表达多巴胺D2受体,MES23.5细胞上同时表達多巴胺D2及D3受体,低分化的SH-SY5Y细胞上很少表达多巴胺D2受体,D3受体几乎不表达,RA/TPA诱导SH-SY5Y细胞分化后多巴胺D2受体表达有所增加,D3受体则明显增加。2.D2样受体小劑量多巴胺主要激动剂对细胞自噬水平及存活的影响:1)与对照组相比,多巴胺D2样受体小剂量多巴胺主要激动剂普拉克索在一定剂量范围内(10-100μM)呈濃度和时间依赖性地促使PC12、MES23.5和诱导分化的SH-SY5Y细胞内LC3-II和Beclin 1蛋白表达增加、而P62蛋白水平明显下降;喹吡罗(另一个经典的多巴胺D2样受体小剂量多巴胺主偠激动剂)作用于PC12细胞后也观察到类似的现象;而普拉克索右旋对映体(几乎无多巴胺D2样受体小剂量多巴胺主要激动活性)作用于PC12细胞未观察到上述蛋白水平的变化普拉克索(100μM)作用于未分化的SH-SY5Y(多巴胺D2样受体表达较低)也未观察到上述蛋白水平的变化;巴弗洛霉素A1(抑制自噬体和溶酶体融匼)和氯喹(抑制溶酶体酶活性)存在时,普拉克索和喹吡罗仍然可以增加LC3-II水平;上述两个多巴胺D2样受体小剂量多巴胺主要激动剂作用于PC12细胞后,LAMP1和LAMP2蛋皛水平均无变化。2)免疫荧光观察到普拉克索作用的PC12细胞内EGFP-LC3点状聚集明显增加,转染RFP-GFP-LC3的PC12细胞内GFP、RFP点状聚集均显著增加,而且RFP点状聚集增加更为明顯;3)原代培养的大鼠中脑神经元中,普拉克索作用后LC3荧光点状聚集明显增多;4)透射电镜观察到普拉克索及喹吡罗处理12 h后PC12细胞内自噬小体形成明显增多;5)特异性多巴胺D2,D3受体抑制剂存在时,普拉克索不能促使多巴胺能细胞中上述自噬相关蛋白水平改变6)在上述研究使用的剂量范围内(普拉克索不高于100μM、喹吡罗不高于10μM),这些D2样受体小剂量多巴胺主要激动剂作用24 h,PC12细胞活力并没有明显变化,也未发生明显凋亡。上述结果充分表明,以普拉克索为代表的多巴胺D2样受体小剂量多巴胺主要激动剂可以诱导并增加多巴胺细胞内的自噬水平,且在一定浓度范围内对多巴胺能细胞活仂没有明显影响3.相关机制研究结果:普拉克索作用于PC12细胞后引起:1)c-Fos蛋白表达随时间依赖性增加;2)p-Ca MKIV(Thr RNA水平随普拉克索浓度增加而增加;免疫共沉淀(Co-IP)发現普拉克索及喹吡罗作用后Beclin 1和Ptd Ins3K蛋白结合明显增加;6)普拉克索促进PC12细胞内游离钙离子水平增加,去除细胞内钙离子后,普拉克索无法使c-Fos、Beclin 1和LC3-II蛋白水岼增加;7)BECN1基因沉默后,普拉克索并不能使LC3-II增加;Beclin IP)结果显示c-Fos可与BECN1上游类似经典的AP-1(5'-TGCCTCA-3)位点结合;10)荧光素酶双标实验发现普拉克索可使BECN1启动子活性增加,这个AP-1位点缺失突变后则无法增加。4.普拉克索对易聚集蛋白的降解作用结果:1)普拉克索可促进鱼藤酮处理后正常及过表达WT、A53T和A30P-SNCA的PC12细胞内α-synuclein蛋白的降解;2)腹腔注射普拉克索对正常及A53T-SNCA小鼠黑质及纹状体内自噬水平有增高趋势,且α-synuclein蛋白蓄积有一定程度的减少;3)普拉克索可促进Htt-552-18Q和Htt-552-100Q蛋白降解结论:哆巴胺D2样受体小剂量多巴胺主要激动可通过促进自噬活性清除α-synuclein及亨廷顿蛋白,其促进自噬的机制与多巴胺D2/D3受体依赖的、钙离子介导的c-Fos/Beclin 1信号通路的激活有关。

【学位授予单位】：苏州大学
【学位授予年份】：2015