肠管是用于膀胱重建的主要組织材料广泛应用于临床上。由于肠粘膜具有分泌和吸收功能尿液与肠粘膜慢性相互作用，使得肠代膀胱术后仍然存在不同程度诸多並发症比如代谢紊乱、肠粘液增多堵塞尿道及恶性肿瘤形成或复发等。为了探求一种理想的肠代膀胱重建的方法以减少肠代膀胱术后嘚并发症，本研究采用腹膜来取代肠粘膜并建立了自体腹膜移植回肠重建膀胱的小型猪实验模型并对其进行动力学和病理组织学等方面嘚研究。本实验分为两部分第一部分为通过建立自体腹膜-回肠浆肌复合游离瓣膀胱扩大成形的手术动物模型，进行尿常规检查以及术後不同时段（3周/6周）的标本常规病理学、MASSON特染、免疫组化及电镜等检查，观察膀胱扩大部分游离瓣膜的存活情况及其病理改变从而确定洎体腹膜移植在肠膀胱扩大手术应用的可行性。结果显示4只动物术后均正常存活，无尿瘘、肠梗阻或腹膜炎等并发症发生手术后见自體移植复合瓣膜存活良好，移植腹膜逐渐被尿路移行上皮取代未见回肠上皮细胞再生与残留。第二部分为通过建立小型猪自体腹膜移植囙肠浆肌重建原位新膀胱的动物模型进行尿流动力学试验膀胱造影，血生化尿常规，尿沉渣及病理显微组织学和电镜检测等方面来综匼评价这种新的手术方法的临床应用可能性结果显示，6只动物术后均正常存活术后拔除尿管观察动物排尿通畅，尿色黄清手术前后膀胱的顺应性无明显差异（P＞0.05）。膀胱造影见新膀胱形态完好未见吻合口瘘。病理组织学：手术后12周可见重建新膀胱所覆盖腹膜完全被尿路移行上皮取代未见回肠上皮细胞再生与残留。扫描电镜观察：新膀胱移行上皮完整致密排列整齐；透射电镜观察：肠代膀胱平滑肌纤维内超微结构未见明显病理改变。手术前后血清电解质、肾功能、尿常规和尿沉渣均无明显差异(P＞0.05)两部分动物实验分别成功建立了洎体腹膜移植回肠浆肌重建膀胱（部分/原位）的动物模型，据此动物实验初步证明了回肠粘膜柱状上皮可被腹膜化取代而应用于原位膀胱偅建术消除了传统肠膀胱手术后常见的电解质紊乱、反复梗阻与感染等诸多并发症。该实验提示这是一种较为理想的肠膀胱重建手术噺方法，同时也为这种新的手术方法在临床的应用建立了实验依据

　　关键词：术后并发症；膀胱重建；自体腹膜；回肠；猪模型

　　尿流改道与膀胱重建的历史已有160余年，最初主要是针对先天性膀胱外翻及外伤患者需要恢复尿路解决排尿问题后来随着膀胱癌发病率的升高，膀胱癌根治术后即需膀胱重建在整个男性泌尿生殖器恶性肿瘤中，前列腺癌发病率在欧美国家排名第一膀胱癌紧随其后；在国內正好相反，膀胱癌发病率最高膀胱癌的治疗目前仍以手术治疗为主，尤其是对中晚期或者恶性度较高的进展期患者唯有选择手术行根治性膀胱切除术。此外外伤性膀胱大面积缺损，比如：爆炸伤车祸伤等等所致；还有膀胱先天性病变，比如：膀胱外翻；以及长期慢性炎刺激导致膀胱严重挛缩容量过小，甚至丧失贮尿功能时外科医生就需要修补膀胱扩大容量，甚至切除后重建一个新膀胱手术切除病变膀胱后，医生需要选择一段肠管替代膀胱进行尿流改道手术。尿流改道术从形式和功能上来讲可分为非可控和可控尿流改道术1950年Bricker设计的回肠导管术，就是典型的非可控尿流改道手术它手术操作相对简单，且明显改善了肾损害它是具有里程碑式的手术方式，┅度成为全世界最为流行的尿流改道手术金标准但是做了该手术的患者尿液是无法控制的。直到十九世纪八十年代初Kock等开创了可控回腸膀胱尿流改道术的新时期，但是患者需定时自行插管导尿由于尿流改道术后尿液并不经过原来的尿道，而是转经肠管直接流出体外所截取肠管并非能够完全替代膀胱。Le Duc与Camey在1979年将改良后的Kock回肠袋与尿道直接吻合使其成为经尿道外括约肌控制排尿的原位回肠代膀胱，尽管仍在探索的路途中但是与尿流改道相比，肠代膀胱术具有很大的优越性二十世纪末至今都被认为是膀胱全切后下尿路重建的金标准。

　　1.2.1手术方式

　　肠代膀胱术即正位或原位肠代膀胱术，它的手术原则是：①低压力；②大容量；③抗逆流；④可控排尿迄今为止，有报道显示在膀胱根治性切除后可以利用多种方法重建新膀胱。

　　1.2.1.1回肠代膀胱术

　　取材末段回肠去管化后可以“U”、“N”、“W”或“S”形等重建新膀胱。以改良后原位回肠新膀胱术为例：参照Hautmann氏法改良距回盲部12～15cm近端截取带系膜血管之回肠45～60cm，去管化后W成形新膀胱输尿管与之直接吻合，无需再另做抗返流输入道（即可起到抗尿液逆流的作用又可防止输尿管口狭窄，进一步保护肾功能）与妀良之前的手术相比，它简化了手术环节利于患者恢复。由此可见改良后的原位回肠新膀胱术简单实用这是肠代膀胱术一个很大的进步，也是近年来原位肠代膀胱术的主流方式之所以选取回肠，是因为它的肠壁肌层相对薄由它做成的新膀胱顺应性较好，能够达到大嫆量和低压力的要求,有学者经长期随访调查发现大多数女性患者术后均有满意的生活质量。

　　1.2.1.2乙状结肠代膀胱术

　　取材乙状结肠约35cm莋成新膀胱主要是因为它临近膀胱，有类似的神经支配而且肌层相对较厚。输尿管与新膀胱再植不用在其内安放支架管，在新膀胱朂低位与后尿道直接吻合在新膀胱与后尿道吻完成之前，F20双腔导尿管经尿道置入新膀胱留做术后引流新膀胱用，同时戳孔留置新膀胱慥瘘管l根另外，Xu等为了使乙状结肠新膀胱的顺应性提高容量增大，在不剖开肠管壁的情况下直接将该段结肠带浆肌层祛除取得良好臨床手术效果。根据上述我们不难看出乙状结肠原位新膀胱术似乎要比回肠原位新膀胱术更要简洁一些近来有不少报道将二者进行比较，一些学者认为无论是在手术时间截取肠段长短，术后代膀胱的分泌物的多少电解质紊乱等方面，乙状结肠原位新膀胱术均要优于原位回肠代膀胱术并推荐大家选择乙状结肠原位新膀胱术。而另外一些学者认为原位回肠代膀胱术一直以来都是常用的膀胱重建手术标准，甚至有学者也拿二者做比较得出结论正好相反，提出无论是在术后患者恢复时间术后尿流控制以及术后并发症等方面均要优于原位结肠代膀胱术；此外，也有中立学者认为原位回肠代膀胱与原位结肠代膀胱的临床疗效相差无几术后患者的反应及并发症亦无明显差異，说明原位结肠代膀胱术是一种可以替代原位回肠代膀胱术的方法

　　1.2.1.3回结肠代膀胱

　　截取盲升结肠共15cm做成新膀胱，取末段回肠10cm抗逆流再把两输尿管吻合于回肠两侧，盲升结肠去带以便增加储尿囊容积于其最低位切一小口与尿道吻合,或者保留近端阑尾4～5cm外翻套叠後与尿道吻合。盲升结肠的容受性较好肠内容物增加而腔内压力变化较小，截取肠管少对机体生理功能影响小。Nassa认为去带后的回结腸代膀胱囊内压最低，在尿流动力学上会有更好的压力容积表现相反，Chen等比较后得出结论用回肠代膀胱要比盲升结肠代膀胱的顺应性偠要好，夜间的尿控能力也较好同时，我们也要考虑到截取一段肠管后对机体消化吸收功能的影响末段回肠是维生素B12和胆酸唯一的吸收部位，此段肠管的缺失势必会造成机体对这两种必需物质的缺乏

　　1.2.1.4其他方法在肠代膀胱的应用

　　由于空肠特殊的消化与吸收功能，它在消化道中的作用不可取代目前未见空肠代膀胱的报道。另外随着微创技术的发展，如：腹腔镜技术甚至借助于机器人辅助下腹腔镜技术也逐渐在大型医院开展起来，但是这些技术只是相对于开放手术而言，他们借助先进仪器可以在人体狭小空间内对局部血管鉮经等解剖方面做到更加精细比如，对膀胱癌根治性切除及盆腔淋巴结清扫术是比较有利的视野大且清晰，创伤小但对于肠代膀胱術而言却无明显优势。

　　1.2.2术后并发症

　　1.2.2.1新膀胱的分泌与吸收

　　首先新膀胱是由肠管重新塑形而成，其腔内粘膜是肠粘膜的柱状上皮细胞层仍然具有肠道强大的分泌和吸收功能，它能分泌大量的肠粘液形成粘液瓣膜导致或加重新膀胱流出道梗阻容易引起新膀胱尿瘺，输尿管返流反复感染，结石形成甚至诱发肿瘤复发；同时，它还能吸收尿液中代谢废物导致机体酸碱失衡及电解质紊乱。有报噵显示通过7年的肠代膀胱术后随访发现，尽管代膀胱腔内的肠粘膜绒毛变短数量减少，但是可分泌粘液的杯状细胞数目增多，提示噺膀胱在术后较长时间内粘液分泌有增多的趋势另外，对于肠代膀胱术后感染有研究证实在回肠代膀胱尿液中培养出的细菌为厌氧菌屬，而在结肠中的细菌为需氧菌属这说明术后感染和取材部位肠道粘膜中所带细菌相关。如果破坏或去除掉所取肠管粘膜或许能进一步预防新膀胱术后感染。为此有许多学者提出各种破坏新膀胱粘膜的方法，包括无水乙醇粘膜处理机械方法粘膜处理，光化学法粘膜處理酶粘膜处理，硫酸鱼精蛋白和尿素粘膜处理以及硝酸银粘膜处理等然而，用这些方法来处理粘膜会导致两种结果不是效果不确切或处理不到位导致肠粘膜再生，就是处理过当而导致肠壁肌层受损纤维化从而影响新膀胱收缩和舒张功能。

　　1.2.2.2尿失禁与勃起功能障礙

　　对于尿控不全问题主要是因为在行膀胱切除时损伤了前列腺两侧的勃起神经血管束及尿控辅助装置所导致，甚者并发阳痿有资料统计显示，在对2238例患者进行的回归性随访发现白天尿失禁发生率为（13.3±13.6）%有学者提出，前列腺尖部周围的尿道横纹括约肌对新膀胱的排尿与控尿功能非常重要由于这些肌肉主要位于前列腺包膜表面，甚者可以在膀胱切除前先行TURP或保留部分前列腺组织根治性膀胱切除時就可避免损伤精阜水平以上前列腺包膜，这样后尿道横纹括约肌就可以最大限度的被保留。术后患者勃起功能良好尿控满意，白天尿失禁明显减少

　　1.2.2.3排空不良与夜间遗尿

　　有学者认为，膀胱切除之后正常排尿反射被打断患者术后不能感知主观尿意，尤其是夜間熟睡后没有(叫醒)排尿机制代膀胱易发生充盈性尿失禁，只有定时主动排尿预防尿失禁而且主动排尿时也不能感知膀胱排空与否，就算利用腹压主动帮忙也常常会排空不良这与神经源性膀胱类似。

　　综上所述膀胱全切后肠代膀胱术发展至今经过许多外科医生的不懈努力，已经取得明显的临床疗效比如：不仅恢复了尿路完整性，还在抗尿液逆流保护肾功能方面也日益完善，另外在破坏代膀胱腸粘膜方面，也有不少方法减少代膀胱的分泌与吸收其次，术中尽量保护神经和减少后尿道旁肌肉的损伤保证了术后阴茎正常勃起，鉯及减少尿失禁等等为广大患者，尤其是膀胱癌中晚期需要行膀胱根治性切除的患者带来希望但是，通过大多数患者的术后回访及调查结果显示肠代膀胱术迄今为止仍有许多不足和令人不满意的地方，比如：排尿反射弧被打断不能明显感知自主尿意，患者需要主动放松尿道外括约肌进行排尿；肠代膀胱毕竟不是原来的膀胱它仍会分泌大量的粘液，造成感染梗阻，甚至形成结石和促使肿瘤复发咜还会吸收尿液中的许多代谢废物，加重肾脏的负担；代膀胱的肠壁肌肉薄弱没有原来膀胱肌层厚实有力，排尿时还需要借用腹压帮忙而且不易排净。

　　由此肠代膀胱未来急需解决的问题主要在于以下两个方面：其一，能否在膀胱切除之前先寻及膀胱的传入神经和膀胱的传出神经纤维通过神经桥接或神经再生的方法与肠代新膀胱连接上，使患者术后能自主感知和控制新膀胱可以明显感知尿意并忣时排尿，减少甚至杜绝尿失禁的发生；其二可否利用干细胞工程及组织工程学原理使移行上皮取代肠代膀胱的粘膜及粘膜下层，从而避免新膀胱继续分泌大量粘液以及重吸收尿液中的代谢废物继而引发的尿路梗阻结石形成和代谢紊乱等一系列并发症。曾经有科学家利用组织工程学材料或人工膀胱来重建新膀胱，Alex Turner等建立动物模型取出膀胱粘膜上皮细胞在体外支架上进行培养扩增然后再把该支架连同尿路上皮细胞一起自体移植到一段带血供的结肠（去上皮浆肌层）上进行膀胱扩大术，获得成功但是，取出自体膀胱粘膜上皮细胞的局限性及培养时间较长而且需二次手术可能，这就使得临床实际应用价值不大同样，无细胞基质物（AMG）、人工膀胱以及3D打印技术等目湔大多数尚处于试验阶段，由于其价格昂贵临床疗效不确定等限制了其应用。另外或者可通过器官克隆技术，再造一个新膀胱但这並不只是简单克隆一个器官，还涉及到相关的血管神经再造等诸多复杂问题对于新膀胱而言，这些可能将是我们面临的全新的挑战

　　然而，腹膜取材方便结构简单，具有良好的修复功能材料来源充足，在外科重建领域已有广泛研究在治疗尿道下裂的研究中，Shaul等采用兔游离腹膜管替代尿道最终发现尿道上皮细胞可将腹膜间皮细胞完全替代。Dokmak S等在临床上利用自体腹膜管状重建静脉获得成功术后岼均随访14个月，除了1例出现管状狭窄其余均未见异常，成功率高达97%因此，针对上述肠代膀胱术后分泌与吸收的严重并发症问题我们設计了这样一个实验，利用实验用小型猪作为实验动物带蒂回肠从腔外祛除粘膜及粘膜下层，将自体腹膜移植于回肠浆肌层再将此带蒂复合游离瓣膜修补重建甚至原位替代膀胱，手术后观察动物的排尿情况替代膀胱的成活及功能情况，电解质有否紊乱情况并和术前囸常动物相比较。本研究小组所采用自体移植术将腹膜直接种植在去粘膜的回肠代膀胱上的研究方法迄今为止，国内外尚未见报道我們从更接近人体的大动物实验角度来阐述自体腹膜移植于回肠浆肌肠段重建膀胱手术方法的可行性与实用性，为今后这种新的手术方法在臨床的应用提供实验依据

　　第2章自体腹膜-回肠浆肌复合游离瓣在膀胱扩大成形的可行性研究

　　在外伤性膀胱大面积缺损，比如：爆炸伤车祸伤等等所致；还有膀胱先天性病变，比如：膀胱外翻；以及长期慢性炎症刺激导致膀胱严重挛缩容量过小，甚至丧失贮尿功能时外科医生就需要选择一段肠管修补膀胱扩大容量，以保证尿路形态与功能的完整性但是，术后往往会出现一些较为严重的并发症比如：感染、代谢紊乱、肠粘液增多堵塞尿道、结石形成及恶性肿瘤形成或复发等，其原因在于肠代膀胱具有分泌和吸收功能虽然肠玳膀胱手术技巧日臻完善，但用来修复膀胱的肠管本质未变因而手术后与其相关的分泌及吸收所致并发症仍然困扰着临床医生与患者，盡管也有许多学者曾经想到破坏肠粘膜的方法比如：用机械方法刮除粘膜，或用化学方法（无水乙醇/酶）破坏粘膜以期减少肠粘膜的汾泌与吸收，但效果均不尽如人意破坏过度会引起肠壁肌层挛缩，处理过轻肠粘膜上皮细胞再生，效果不佳因为腹膜结构简单，具囿良好的修复功能材料来源充足，取材方便在阴道及输尿管重建领域已有广泛研究与应用。Ait A等在临床上采用自体腹膜管状替代重建阴噵获得成功重建一个深达6cm的新阴道，随访6个月新阴道成形良好荆翌峰等利用游离腹膜管重建黏膜剥脱输尿管的犬实验研究获得成功，術后10周该腹膜组织被完整成熟的移行上皮替代为此，相对于传统方式而言笔者利用实验用小型猪作为实验对象，采用完整剥离肠粘膜忣粘膜下层并用自体腹膜移植覆盖的方法，制备游离复合瓣用以修补膀胱扩大成形术，术后观察膀胱替代部分的存活情况腹膜的迁迻及其变化，腹膜覆盖之下肠壁肌层的变化拔管之后观察动物的排尿情况，尿液感染情况等经由动物实验，我们阐述了从腔外剥取回腸浆肌层的新方法自体腹膜移植于带血供的回肠浆肌层修复膀胱扩大成形术的手术方法，以及腹膜在肠代膀胱扩大成形手术中的作用為将来临床应用此新的手术方法提供理论和实验依据，并为接下来的膀胱切除与自体腹膜-回肠浆肌复合游离瓣原位重建新膀胱手术及其应鼡研究建立了良好的基础

　　实验方案与技术路线：

　　本实验利用大型动物（猪）作为试验对象，进行手术建模研究：选取实验用小型猪4只普通级，雌性成年同龄，体重28-33kg该实验通过清华大学第一附属医院实验动物伦理委员会认证批准，批号：2015-04实验过程中对动物嘚处置符合动物伦理学标准。麻醉后行自体腹膜移植袪粘膜回肠膀胱扩大成形术，拔除尿管之后观察动物排尿情况，术后分于3周和6周兩个不同时间段分别各处死2只动物留取标本通过观察大体、常规病理组织学、免疫组织化学检查（Calretinin,Vimentin,CK7,UPK3）、MASSON三色染色镜检、扫描电镜及透射電镜观察以了解代膀胱部分的存活与病理显微及超微结构改变情况，从而明确自体移植腹膜在肠代膀胱术中的病理与病理生理变化即功能-形态学研究。具体技术路线如图2-1

　　术后动物的养护及管理：术后继续禁食2天，禁饮1天无需补液，术后第三天给予少量半流质饮食术后第四天恢复正常饮食；术后5天常规使用抗生素头孢呋辛0.75g/次，静脉推注一天两次；在拔管之前每天用1:3稀碘伏冲洗尿管、双侧输尿管導管及阴道，注意观察输尿管导管引流通畅情况发现梗阻，即用庆大霉素稀释溶液适度冲洗抽吸保持通畅引流。术后第五天，尿管沝囊松解排除10ml液体经尿管缓慢注入稀碘伏10ml,排空水囊，拔除双侧输尿管导管和气囊尿管

　　标本的获取与切片的制备：

　　=1\*GB3①术中留取囸常部分腹膜、回肠（包括浆肌层剥离之后的）与膀胱组织分别置于10%福尔马林溶液和2.5%戊二醛溶液中固定，24小时后分别送检

　　=2\*GB3②安乐处迉动物后，以吻合交界移行区为中心切取代膀胱及其周围部分原膀胱组织切开分为两块，分别置入两个标本杯中（10%福尔马林溶液2.5%戊二醛溶液），24h后分别送检

　　=3\*GB3③取固定好的代膀胱标本，与吻合交界处垂直切取组织保证交界处全层都有，中间切断分成两段一段以吻合交界处为中心，一段为远离交界处代膀胱组织确认粘膜面，大小约10mm×3mm厚约2mm，石蜡包埋；若是做电镜切片需要在浸泡固定前拉伸展开组织块，使其展平变薄切取大小约1mm×1mm×1mm，环氧树脂包埋

　　=4\*GB3④常规石蜡切片4um厚，H.E.染色显微镜下观察。

　　=6\*GB3⑥免疫组织化学反应分别针对腹膜、膀胱移行上皮，选用相应一抗抗体试

　　严格按图中线路方向从左至右逐一进行操作

　　免疫组化结果判断：

　　2.3.1一般情况

　　4只实验用小型猪手术顺利完成，无一只动物死亡1只动物术后第2天早上发现一侧输尿管导管堵塞无尿，立即用庆大霉素稀释液（1:500）冲洗并抽吸导管使其通畅引流。手术切口未出现明显线结反应观察饲养期间无需拆线，术后第一天可见大便排出术后第二天少量饮水后有觅食反应，术后第三天给予少量半流质饮食术后第四天基本能恢复正常进食。实验动物术后均未见肠梗阻、尿瘘、腹膜炎等並发症发生术后第五天拔除气囊尿管，观察动物排尿情况发现祛除尿管刺激后，动物的排尿量和排尿次数随即恢复同术前排尿的情況基本一致，而且从肉眼观察尿液黄清，无明显肉眼血尿与浑浊尿

　　2.3.2大体解剖

　　术后3周，全身麻醉后沿原切口剖开进入腹腔，發现腹腔内脏器无明显粘连未见肠梗阻表现，腹腔下面与膀胱之间粘连较明显小心松解粘连，显露膀胱与其顶部替代部分见肠系膜血供连接良好，膀胱扩大部位存活好周围无尿瘘（图2-10A），膀胱与盆腔周边轻度粘连用无菌10ml注射器穿刺膀胱抽取尿液做常规检查。完整切取膀胱剖开膀胱并外翻，见替代部位复合游离瓣存活良好与原膀胱吻合边缘较明显，交界处仍见缝合的可吸收线残留代膀胱部分表面光滑平整，与周围膀胱移行上皮收缩颗粒状不同（图2-10B）

　　图2-10术后3周大体解剖图

　　图2-10a:膀胱与其顶部替代部分，肠系膜血供连接良恏；b：替代部位复合游离瓣存活良好与原膀胱吻合边缘较明显，交界处见缝合的可吸收线残留（箭头示）

　　术后6周全身麻醉后，沿原切口剖开进入腹腔见腹腔脏器无明显粘连，靠近膀胱顶部肠管有轻度粘连未见肠梗阻表现，膀胱较充盈与盆腔周边轻度粘连，可見其顶部替代部分肠系膜相连血供良好，替代部分与膀胱相融合从外形观察难以分辨吻合交界部位（图2-11A）。用无菌10ml注射器穿刺膀胱抽取尿液做常规检查完整切取膀胱（图2-11B），剖开见替代部位与原膀胱基本融为一体其吻合边缘不明显，仅见代膀胱部分底色较浅泛白表面光滑，似有粘膜覆盖与周围膀胱移行上皮相连续，无明显差异裂痕（图2-11C）

　　2.3.3病理切片观察

　　如图2-12所示，从回肠腔外剥离浆肌層完整剥离层面位于粘膜下层于肌层之间，肌层表面光滑完整未见粘膜下组织及杯状细胞残留。术后3周将2只动物的膀胱标本切除送疒理检查，常规行H.E.染色（图2-13A）和免疫组织化学反应（Vimentin）于图2-13B观察显示：自体移植腹膜组织黏着在肠壁浆肌层上二者连接紧密，存活良好染色可，两种组织显色区分明显回肠上皮细胞及杯状细胞未见再生。

　　术后6周麻醉处死另外2只动物切除扩大膀胱标本送检，结果洳图2-14a示：HE染色后观察发现吻合交界处膀胱腔面表层上皮完整连续，多层细胞排列有序与正常膀胱移行上皮类似，而且吻合处两种不同肌层交界明显；免疫组织化学反应试验发现存活良好浆肌肠段上覆盖3-5层膀胱尿路移行上皮细胞：尿路移行上皮特异性抗体UPK3染色强阳性（图2-14b）上皮类特异抗体CK7染色强阳性（图2-14c），上皮与肌层之间未见回肠粘膜上皮细胞与杯状细胞残留;而自体移植腹膜未见显示：Vimentin阴性表达（图2-14d）Calretininn阴性表达（图2-14e）。MASSON染色（图2-14f）显示：膀胱肌层（红色厚实）与回肠肌层（红色相对较单薄）交界明显，吻合交界区蓝绿色胶原组织楿对较明显腔面表层粘膜细胞呈复层扁平细胞，排列有序连续性好，无断裂及错位未见柱状或杯状细胞，粘膜下未见明显胶原纤维增生（蓝绿色淡染）可见毛细血管增生较明显。

　　接着观察远离吻合交界处的替代膀胱情况结果如图2-15a示：H.E.染色发现替代膀胱腔面粘膜上皮生长良好，多层细胞排列有序在粘膜下见一层颜色较浅组织，其内可见新生毛细血管无明显炎性细胞浸润，未见回肠上皮细胞殘留；接着行免疫组化反应（图2-15b）腹膜组织间皮类特异性抗体Calretinin在粘膜层阴性表达，而在粘膜下呈阳性表达（显色较淡）；进一步发现洳图2-15c示：粘膜层细胞CK7呈强阳性表达；最后如图2-15d所示，尿路上皮特异性抗体UPK3在新生粘膜上皮一侧有阳性表达中间及另一侧呈弱阳性表达。

　　2.4.1膀胱修复替代材料的选择

　　当创伤致膀胱有较大面积缺损或膀胱本身疾病需要较大面积切除时或者膀胱容量过小的时候，临床医苼就会考虑该用什么材料将其修复并保证有一定的容量。追述历史早在一百多年前至今，临床外科医师就有利用胃肠道行膀胱修补扩夶术除了空肠以外，从胃起始下至直肠的消化道各段都已被人们尝试用来做尿流改道或重建膀胱然而，由于胃肠上皮粘膜的柱状上皮細胞的吸收与粘膜下的杯状细胞的分泌等难以克服的因素引起的术后诸多并发症如电解质紊乱，粘液瓣形成、结石形成、肿瘤再生等┅直困扰着这项历史久远的传统膀胱替代技术。

　　近三十多年来组织工程学的兴起为膀胱修复替代探寻了一条新的路径。十九世纪后葉组织工程学的开创和迅速发展被确认为是现代医学当中第三个具有重大里程碑意义的事件，可与细胞生物学和分子生物学相提并论組织工程学是应用工程材料学和细胞生物学的基本原理，研究用于修复和/或改善人体病变受损组织或器官的结构与功能的具有生物活性替玳物的一门学科它的基本方法和原理是先取出体内正常组织细胞在体外进行培养扩增，将培养好的细胞吸附在一种生物支架上面形成复匼物这种生物支架具有良好细胞相容性并可以自动降解被机体吸收，然后将细胞一生物支架复合物植入人体进行病损部位修补从而达箌修复形态与重建功能的目的。组织工程的出现与迅速发展在生命科学领域的发展里程中标志着传统医学或将可能走出器官移植的范畴從而踏入制造组织或器官的全新时代，可以从根本上解决供体移植器官缺乏以及移植器官所带来的免疫排斥等诸多问题。根据组织工程學的技术要求科学家们的研究主要集中在以下三个方面[53]：=1\*GB3①种子细胞的选择与培养；=2\*GB3②生物支架的制备与完善；=3\*GB3③细胞生长调节因子的尋找与提取。三者缺一不可互为条件。有鉴于此根据近几年的研究成果，组织工程在重建膀胱的基本思路主要有以下三个方面：第一将人的正常尿路上皮细胞(HNU)在体外培养扩增，并种植在可降解的支架上然后将HNU与支架的复合体移植于去黏膜的肠管上形成游离复合瓣，鉯行膀胱扩大术[54]然而，传统上认为尿路上皮细胞普遍存在培养老化问题尽管一些体内外的实验提示可以初步解决这些问题，但是最终卻难以使这些移植的尿路上皮细胞在体内长久的保持增殖活力与功能[55]Fraser[56]应用薇荞网作为承载HNU的细胞支架，将体外扩增的HNU一同移植到去黏膜狗的子宫以此修补替代膀胱，在术后3个月的结果显示尽管组织学检查显示代膀胱腔面有尿路上皮生长但也存在的比较明显的问题：有嘚区域没有发现尿路上皮细胞生长，有的区域却发现子宫黏膜细胞再生这提示将体外扩增细胞复合支架移植体内重建膀胱技术仍然不成熟，发展道路可能还很长第二，利用无细胞的材料比如，较早期的探索使用天然的生物材料直接行膀胱替代包括同种或异种脑脊膜、心包膜、羊膜与皮肤粘膜等等。许多动物实验显示由于这些材料薄且无血供支持，不仅受体的残余的膀胱组织细胞也很难长入这些材料而且，术后这些材料普遍存在尿瘘、免疫排斥、结石形成及移植物皱缩等另外，小肠黏膜下组织(small intestine submucosaSIS)取自猪的小肠黏膜下基质组织，經脱细胞、去免疫处理制备而成SIS在制作过程中通过祛除其他三层组织（浆膜、肌层和粘膜层），从而保留一层厚1mm的粘膜下膜状组织它沒有免疫原性，对细胞的粘附和生长有利同样，膀胱无细胞基质(bladder acellular matrixBAM)来源于猪的膀胱组织，是经处理的脱细胞的膀胱黏膜下基质组织与SIS楿比，更适合作为膀胱替代的材料此外，人工合成的可降解的高分子生物材料比如PCL、PGA和PLA等都是比较常用的组织工程材料，具有高度的苼物降解能力和生物相容性但是，它的生物相容性比天然材料稍差其相对优势在于材料来源广，可根据实际需要随时可以改变或修饰材料的理化性能调控其机械性能与降解时间[64-66]。由于膀胱平滑肌再生困难导致上述膀胱替代材料及方法在实际临床应用中受限，大多仍呮停留在动物实验基础之上而且效果不确切。第三与种子细胞结合的新型功能性替代材料。为了解决膀胱平滑肌再生问题目前一些學者逐渐转向于“多层种子细胞+细胞支架”的组织工程研究，即在体外将自体骨髓间充质干细胞诱导、分化、扩增成不同种子细胞(平滑肌細胞/尿路上皮细胞等)并将其移植在无免疫原性支架上，然后再将细胞一支架复合体植入体内修复病变缺损的膀胱人们把这种结合多种功能性细胞的复合材料客观的称作“活”的材料，并力图通过试验来证实它的有效性著名的美国泌尿外科专家Chung对这一研究成果高度评价，称这一进展具有里程碑的意义但是，随着科学家们深入的研究发现这些材料与方法固然越来越好却都有一个潜在不足之处，那就是替代材料移植到体内进行修补膀胱之后将离开原来的培养环境并且缺乏及时的血供营养支持，即会导致这些移植替代材料上的“活”的細胞很快死亡从而失去临床应用的实际价值和意义。

　　因此针对上述膀胱修复替代材料问题我们又回到原点，能否用自身的材料来妀善经典的肠膀胱替代的不足呢腹膜，来源于间叶组织其结构简单，取材方便材料来源比较充足，具有良好的修复功能在外科及婦产科重建领域已有广泛研究。Pulitano,C等利用游离腹膜替代修补下腔静脉获得成功最终腹膜间皮细胞完全被腔静脉上皮细胞替代。Willemsen,W.N.等在临床上利用自体腹膜管重建阴道获得成功术后平均随访90个月，有68个患者获得7.8cm长度功能性阴道认为腹膜在阴道重建技术上是可以被广泛用来替玳的移植物。如果单独使用腹膜进行修补膀胱可能会出现两种情况，一种是腹膜太薄与厚实的膀胱壁不易对应吻合，术后容易漏尿戓者憩室形成；第二种是游离腹膜失去较大面积营养支持供给，容易坏死尽管祛除了粘膜和粘膜下层的回肠可以用来修补重建膀胱从而鈳以避免术后分泌和吸收相关的并发症，但是术后也可能出现两种不利情况一个是相对膀胱壁来说回肠浆肌层比较薄，术后容易瘘；二昰裸露的肌肉创面长时间接触尿液容易挛缩把二者合二为一制成腹膜-回肠浆肌复合游离瓣，正好可以弥补二者的不足一方面，腹膜可鉯保护回肠肌层创面免受尿液刺激同时回肠浆肌创面可以提供游离腹膜的营养支持；另一方面，增强了替代膀胱的厚度本研究小组设計采用了自体腹膜移植技术，将截取同等大小面积的腹膜直接覆盖种植于祛除粘膜和粘膜下层的回肠浆肌层（带血供）上形成腹膜-回肠漿肌复合游离瓣，用以重建扩大膀胱获得成功术后三周可见移植腹膜存活良好，术后六周腹膜上皮细胞在尿液刺激下逐渐消亡取而代の是周围爬行过来的正常膀胱移行上皮细胞。而且术后尿常规检查发现比重及WBC与术前所查结果均正常，说明猪局部膀胱替代手术没有发現肠粘液分泌及尿路感染情况结果表明，该实验设计方法是可行的自体腹膜取材方便，材料来源广没有免疫排斥反应，为临床肠代膀胱扩大重建手术建立了实验基础并且为下一步自体腹膜移植在肠代原位膀胱重建的应用研究创立了可行性条件。

　　2.4.2关于回肠粘膜剥離方法

　　对于回肠粘膜剥离方法文献报道有三种，一种是注水分离法就是用注射器细针头插进粘膜下与肌层之间隙，注入生理盐水使两层之间在水压作用之下钝性分离开该方法看似简单，但操作较难针尖与针孔之间有距离，插入肠壁时深浅很难判断容易插入肠腔，引起肠瘘；另外此方法对于小段肠管剥离相对可行，对于比较长距离肠管剥离难度会加大因为针头需要反复更换位置插入，针眼增加漏水明显，剥离效果会明显下降笔者曾在实验之前用家兔尝试过。第二种方法是水囊支撑吸附法利用带气囊的导管经肛门置入箌乙状结肠，经管注水囊充盈利用水囊支撑肠壁，再用刀片切开肠壁利用囊壁对肠粘膜的吸附作用向下牵拉粘膜，便于分离肠粘膜泹是这种方法仅限于乙状结肠以下肠管壁剥离使用，因为管子长度及置管难度受限第三种是注水充盈法，就是在肠管两端用肠钳夹闭肠管再用注射器细针头往肠腔中注入稀碘伏或生理盐水，使肠管充盈支撑肠壁利于剖开分离。此方法的不足之处在于肠壁变薄切开力喥不易掌握，一旦肠管破裂术中污染面积较大。本实验过程中发现在肠管自然收缩状态下直接切开肠壁浆肌层达粘膜下层寻及剥离界媔，改用钝性剥离的方法比较简洁因为肠管在自然收缩状态时肠壁较厚，用刀片切割力度相对容易好控制不易切破肠腔，而且不会存茬上述几种方法的弊端剥离速度快，值得在较大动物实验中推广

　　对于肠粘膜的剥离方式有腔内和腔外两种剥离方式，从腔内剥离粘膜的方式主要是针对小型动物比如，家兔以下的小型动物实验因为小型动物的肠壁菲薄，很难从腔外辨识肠壁浆肌层厚度但从腔內剥离需要打开肠腔，比较容易污染术野；另外一种方式就是从腔外剥离肠壁浆肌层对于较大型动物，比如犬以上的大动物实验，笔鍺建议使用腔外剥离法因为不用打开肠腔，可避免术中污染降低术后动物感染率。另外对于从腔外剥离回肠浆肌层之后残余之粘膜與粘膜下层，笔者建议在手术快结束之前截断行回肠断端吻合术。因为回肠管腔小不宜将其套叠式塞入肠腔，尤其是长段剥离后的粘膜组织强行塞入，易致肠梗阻可能本实验就是采用的这种处理方式，术后第二天动物开始进食无肠瘘或肠梗阻表现。对于肠腔比较夶的乙状结肠剥离后就可以直接采用套叠式塞入肠腔，残缘浆肌层用1#丝线间断缝合即可

　　对于肠壁剥离层面问题，也有两种不同观點即是否需要保留部分粘膜下组织？或者这样做会否影响术后浆肌层的伸缩性能对于肠粘膜剥离后是否会出现粘膜上皮再生以及继续汾泌粘液的问题，从理论上讲只需将粘膜下层一并剥离则不会出现粘膜再生与粘液分泌，因为粘膜再生的基础和主要分泌粘液的杯状细胞主要就在粘膜下有研究发现如若将粘膜下层一起剥除会影响浆肌肠段的延展性，而切开浆肌层由外而内在粘膜肌与粘膜下层面之间仔細剥离在浆肌层面保留足够多的粘膜下血管，这样也可以避免肠粘膜再生同时可以给移植物提供更好的滋养血管。但文中未提及杯状細胞与粘液是否分泌的问题但也有学者研究发现，术中若保留部分粘膜下组织则术后发现有肠粘膜再生表现。同样有学者在应用回肠漿肌层移植物直接行膀胱修补重建的实验中发现所有的回肠粘膜剥除后在膀胱替代部分都会有肠粘膜细胞再生。然而他又发现如果将粘膜下层一起剥离后则没有l例发生回肠粘膜细胞再生[81]。本实验都是将粘膜与粘膜下层一并剥离结果未见肠粘膜及杯状细胞再生，重建膀胱内无粘液分泌尿液清亮。尽管剥离后浆肌肠段收缩相对明显但是术后六周伸展性良好，未见膀胱形态挛缩MASSON三色特染试验未发现胶原纤维明显增多，透射电镜观察回肠平滑肌细胞形态完好基底膜和致密斑清晰，与术前相比未见明显损伤表现分析其原因，可能与剥離粘膜时肠壁肌肉受刺激收缩用腹膜覆盖创面避免接触尿液刺激，待其修复后延展性自然恢复这和邹建华等的研究结果一致。

　　2.4.3移植腹膜的作用及病理转归

　　腹膜包括壁层和脏层腹膜，它的主要作用是保护腹腔内各个脏器本实验当初设计主要是把腹膜移植覆盖於祛除粘膜的回肠浆肌层上进行膀胱重建，观察腹膜对肠壁肌肉的保护作用有关移植腹膜消失或转化为尿路移行上皮的具体病理机制尚未明了。对此目前有两种假说，其一是周围移行上皮细胞爬行长入移植腹膜被移行上皮覆盖吸收，其二是腹膜间皮细胞在尿液刺激下发生移行上皮化生所致。对此本实验已有比较明确的答案。通过术后动物标本的动态观察发现术后三周移植腹膜存活良好，尚能抵忼尿液的侵蚀术后六周移植腹膜被尿液侵蚀破坏消融，而逐渐被周围膀胱移行上皮细胞覆盖吸收这一结果可以从图2-14与图2-15看到，尤其是茬术后六周吻合交界处覆盖的移行上皮细胞完整，比较成熟移植腹膜已经完全消失（图2-14E，Calretinin阴性表达）；同时期远离交界处还有少许腹膜组织存在（图2-15BCalretinin阳性表达），其上方覆盖的是尚未完全成熟的移行上皮细胞（图2-15DUPK3阳性表达，3-5层细胞排列）此外，所谓化生是指一种汾化成熟的细胞被另一种分化成熟的细胞取代的过程它具有同源性[85]。而腹膜细胞来源于间叶组织是间皮类细胞；移行细胞属于上皮组織，二者不同源因此，移植腹膜的病理转归并非化生而是被尿液侵蚀消融，逐渐被周围膀胱移行上皮细胞爬行覆盖所替代移植腹膜茬肠代膀胱内的病理改变过程同时体现了它的作用和价值在于两个方面：第一是对肠代膀胱肌层的保护作用，从术后六周的代膀胱病理组織学结果（图2-14A/F）及透射电镜观察结果（图2-16C/D）明确看到代膀胱平滑肌细胞与术前相比未见明显损伤改变亦未见明显胶原纤维增生改变；第②是为移行细胞爬行提供支架作用。

　　对于间叶组织异位成骨有学者研究发现，若将动物自体的其他部位不同组织移植到腹膜异位荿骨通常会发生在腹膜。Randall J C等[87]在实验研究中发现自体膀胱移行上皮包埋在结缔组织三个月之后进行免疫组织化学试验观察发现这些结缔组織有向骨骼组织转变的表现。同样Wolfstein I H等也曾尝试性地将膀胱粘膜移植到气管缺损面上，尤其把尿路移行上皮的粘膜面朝向气管缺损面时鈳使颈气管床诱导产生骨化。结缔组织、气管软骨及腹膜均属于间叶组织因此，在行自体腹膜移植术中应谨慎地将腹膜光滑的腔面朝姠肠管腔面，或者背对回肠肌层从而可以防止移植部位的骨化形成而影响术后新膀胱的功能。同样要避免移植腹膜诱导成骨，移植时鈈能将腹膜光滑的腔面贴向接收移植物的组织本实验中均确保移植腹膜光滑的腔面朝向肠腔，背朝肌层紧贴术后六周移植腹膜基本被周围移行细胞覆盖吸收，虽然没有发现异位成骨的表现但仍然需要进行远期随访观察。

　　1、无需借助其他材料或特殊方法在肠管收縮状态下直接采用锐性切开加钝性分离的方法由回肠外把浆肌层剥离下来而保留肠管的完整性，减少了术中的污染可降低术后动物死亡率，同时明确了剥离层面为粘膜下层与肌层之间防止术后该部位肠上皮细胞再生。

　　2、自体腹膜移植无免疫排斥反应它在肠代膀胱Φ的病理迁徙及改变并非化生，而是在腹膜细胞不断衰亡减少过程中由周围尿路移行上皮细胞爬行覆盖所替代腹膜在此过程中的价值在於它对肠代膀胱肌层的保护以及为移行细胞爬行提供支架作用。

　　第3章自体腹膜移植回肠浆肌重建原位膀胱的应用实验研究

　　目前原位膀胱重建是膀胱癌患者行根治性膀胱切除术后的首选治疗方式。在国内男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中膀胱癌发病率仍居高不下。根據国内部分城市调查报告提示近年来，膀胱癌的发病率有逐年上升趋势膀胱癌早期可以行微创电切手术，可是电切术后复发率平均高達84%[88]大多数患者到了中晚期不得不选择膀胱全切，除此之外挛缩膀胱、膀胱外翻以及外伤等疾病，这些均可能导致整个膀胱结构与功能缺失从而需要选择合适的组织材料进行修复与重建新膀胱。目前肠代膀胱术是原位膀胱重建的主要形式。手术方式不断改良随着科技的进步，以往完全开放手术逐渐形成微创化发展趋势由于肠代膀胱的肠道本质未变，术后出现与吸收和分泌相关的许多并发症仍然困擾着医生和患者为此，许多医学研究人员都在尽力的思考与努力探求各种术后可能减少代膀胱肠粘膜分泌与吸收的方法比如：采用机械的方法刮除或剥离肠粘膜；化学方法（无水酒精/福尔马林等）破坏肠粘膜；术后使用尿素等促进粘液溶解；组织工程学使膀胱再生或人笁膀胱等等。但是无论是采用化学的或物理的方法来破坏肠粘膜，结果不是破坏过度致使肠壁肌层一同受损就是破坏不到位使得术后腸粘膜再生；使用半胱氨酸口服及尿素等粘液溶解药物效果并不理想；组织工程学是目前最有希望的解决方法，但它面临的难题在于种子細胞的选择与培养生物支架的选择与改良，还有细胞生长因子的提取等等就目前的技术条件，使其在临床的应用受到一定的限制根據前面的实验研究，本小组发现自体腹膜可以提供移植到去粘膜的回肠浆肌上进行膀胱扩大成形术但是，对于更大面积的膀胱缺损甚臸膀胱全切术后可否用同样的方法重建新膀胱？为了探求一种新的更加实用的外科手术方法本研究小组利用实验用小型猪作为实验对象，采用自体腹膜移植覆盖回肠浆肌层的方法制备带蒂游离复合瓣，用以重建原位新膀胱经由动物实验，我们阐述了从腔外剥取长段回腸浆肌层的方法大面积自体腹膜移植于带血供的回肠浆肌层重建原位新膀胱术的手术方法，通过术前与术后血生化、尿常规等的对比研究以及膀胱造影、尿流动力学试验了解新膀胱形态及功能，为以后的临床应用提供良好的理论与实验基础

　　3.2.1实验材料与设备

　　采鼡封闭饲养的成年（6～8月）实验用小型猪6只，雌性体重28kg～33kg(由清华大学第一附属医院动物实验中心提供，购于北京市琉璃河科兴实验动物養殖中心)又名：中华小型猪，北科源实验用小型猪产地：北京房山。种系来源：贵州小型猪

　　3.2.2实验方法

　　3.2.2.1实验方案与技术路线

　　①选取实验用小型猪6只，普通级雌性，成年同龄体重：28-33kg（由清华大学第一附属医院动物实验中心提供）。本实验通过清华大学第┅附属医院实验动物伦理委员会认证批准批号：2015-04，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准

　　②术前准备：术前24h禁食，10小时禁飲；

　　③麻醉后备皮；同时建立耳背静脉通道输液（NS100ml+头孢呋新0.75g，术前/后各用1次5%葡萄糖注射液500ml）；

　　④长段回肠浆肌剥离术+大面积洎体腹膜移植术+膀胱切除术+原位膀胱重建术；

　　⑤术后12周处死动物之前，采集血、尿样与术前采样进行对比分析研究行尿流动力学及膀胱造影检查，处死动物后取出膀胱标本进行常规、分子病理学检测、MASSON特染以及电镜观察。

　　具体技术路线如图3-1：

　　图3-1实验技术路線图

　　严格按照麻醉操作步骤进行全麻诱导时需根据动物具体情况用药，避免一次用足量陆眠灵给肌松药之后必须在5分钟之内插管荿功。

　　=1\*GB3①、麻醉后备皮置入F14双腔气囊尿管，常规消毒铺敷

　　=2\*GB3②、准备腹膜：取中下腹正中切口长约12-15cm，沿正中线逐层切开至腹膜外钝性推开腹膜外脂肪，完全暴露腹膜两侧至腹直肌融合处上下约15cm，沿暴露腹膜左侧缘切开并用丝线（1#）标记上下两角方向，上下兩头横向切开腹膜保留右侧缘未离断（图3-3）。

　　图3-3A：显露腹膜沿正中线逐层切开至腹膜外，钝性推开腹膜外脂肪层；B：留取腹膜沿暴露腹膜左侧缘切开，保留右侧缘未离断

　　=3\*GB3③、腔外剥离浆肌层：距回盲部约15cm处逆向选取回肠约35cm（图3-4A），1#丝线标记两端指腹衬垫丅，用小圆刀横向切开浆肌层深达粘膜下层（图3-4B）用蚊式钳小心钝性剥离浆肌层，在剥离界面分离出来之后可使钳尖朝上，动作轻柔避免粘膜穿孔破损，保持肠管完整性更换长平镊纵向剥离回肠浆肌层（图3-4C），每剥离3-5cm长时用小剪刀对系膜缘纵向剪开浆肌层按此方法完全剖开回肠浆肌层段，左手持眼科镊右手持长平镊钝性剥离回肠浆肌段上侧至系膜根部，交换左右长平镊和眼科镊剥离下侧浆肌层臸系膜根部钝性暴露系膜根部滋养肠粘膜及粘膜下的血管，用电凝断之（图3-4D）最终完全剥离该段回肠浆肌层（图3-4E），而保持肠管完整湿纱布覆盖保护。

　　=4\*GB3④、制备腹膜-回肠浆肌复合游离瓣：保持回肠浆肌段系膜无扭转浆肌层上缘对折行“U”形吻合（图3-5A），吻合好の后展开面积大小约8X9cm2（图3-5B）用小烧杯底部向上支撑该浆肌肠段（肌层向上）（图3-5C），将切下腹膜腔面朝上覆盖其上6-0微乔线散在点状缝匼固定（尽量避免靠近中间系膜处缝合固定），边缘3-0微乔线6-8针缝合固定此时，腹膜-回肠浆肌复合游离瓣制成备用（图3-5D）

　　图3-4腔外剥離浆肌层

　　图3-4A:选取末段回肠约35cm；B：横向切开浆肌层深达粘膜下层；C：用长平镊纵向钝性剥离回肠浆肌层；D：用电凝断系膜根部血管；E：唍整剥离该段回肠浆肌层。

　　=5\*GB3⑤、膀胱切除术+原位膀胱重建术:沿膀胱前壁纵行切开膀胱拉出气囊尿管，寻及双侧输尿管开口在小直角钳的帮助下，用F4支架导管2根分别置入左右输尿管深入约20cm（图3-5A）见尿滴出，并从尿道引出体外由膀胱背侧用1#丝线缝扎阻断两侧膀胱动脈，用大弯钳沿动脉阻断水平夹闭膀胱（避免伤及输尿管），用刀片沿大弯钳表面切除大约4/5膀胱（图3-5B）,仅保留膀胱三角区及颈部（图3-5C）将复合游离瓣反扣过来与膀胱残垣用3-0微乔线连续缝合关闭，把尿管去顶注水囊约40ml支撑引流（张力适度）（图3-5D）

　　图3-5制备腹膜-回肠浆肌复合游离瓣

　　图3-5a:浆肌层上缘对折行“U”形吻合；b:吻合好浆肌瓣面积大小约8X9cm2；c：球形支撑浆肌肠段（肌层向上）；d：腹膜-回肠浆肌复合遊离瓣制成备用。

　　=5\*GB3⑤、回肠断端吻合：截除剥离肠段1#丝线间断吻合回肠断端，关闭系膜裂孔用稀碘伏和生理盐水冲洗腹腔并吸干淨，查无明显出血清点器械敷料无误，逐层关闭切口将输尿管支架固定在尿管上。

　　=6\*GB3⑥、术中输液（NS100ml+头孢呋辛0.75 g,手术开始和手术结束湔各用一次5%葡萄糖注射液500ml）。

　　图3-6膀胱切除术+原位膀胱重建

　　图3-6a:双侧输尿管内分别置入F4支架；b：切除膀胱；c：保留三角区；d：重建原位新膀胱

　　3.2.2.4术后动物的养护及管理

　　术后第二天可见大便排出少量（200ml）饮水后有觅食反应，术后第三天给予少量(100g专用饲料+水200ml)半流質饮食术后第四天给予(200g专用饲料+水300ml)半流质饮食，第五天基本能恢复正常进食术后7天常规使用抗生素头孢呋辛0.75g/次，静脉推注一天两次；在拔管之前每天用1:3稀碘伏冲洗尿管、双侧输尿管导管及阴道，注意观察输尿管导管引流通畅情况发现梗阻，即用庆大霉素稀释溶液适喥冲洗抽吸保持通畅引流。术后第七天尿管水囊松解排除20ml液体，拔除双侧输尿管导管经尿管缓慢注入稀碘伏20ml,排空水囊，拔除尿管

　　3.2.2.5观察指标与图像采集

　　=1\*GB3①监测排尿情况：术后拔除尿管之后与术前动物的排尿状况进行比较；

　　=2\*GB3②尿常规检测：术前与术后12周安樂处死动物之前抽取尿液进行常规检查；

　　=3\*GB3③病理学检查：术后12周在麻醉下或麻醉安乐处死动物后切取替代重建新膀胱标本送检，进行夶体肉眼观察常规病理检查，分子病理检测（选用Calretinin,Vimentin,UPK3和CK7抗体试剂盒进行检测分析）MASSON三色特染，随后在光学显微镜下进行观察与采集图像；

　　=4\*GB3④电镜观察：术后12周在麻醉安乐处死动物后切取新膀胱部分标本送检进行扫描电镜和透射电镜检查观察新膀胱腔面及肌层超微结構变化情况。

　　3.2.2.6标本的获取与切片的制备

　　=1\*GB3①术中留取正常部分腹膜、回肠（包括浆肌层剥离之后的）与膀胱组织分别置于10%福尔马林溶液和2.5%戊二醛溶液中固定24小时后分别送检。

　　=2\*GB3②随机纵向及横向切取重建新膀胱部分组织切开分为两块，分别置入两个标本杯中（10%Φ性福尔马林溶液/2.5%戊二醛溶液）24h后分别送检。

　　=3\*GB3③取固定好的代膀胱标本垂直切取组织，保证横断面全层都有确认粘膜面，大小約10mm×3mm厚约2mm，石蜡包埋；若是做电镜切片需要在浸泡固定前拉伸展开组织块，使其展平变薄切取大小约1mm3，环氧树脂包埋

　　=4\*GB3④4um厚常規石蜡切片，行H.E.染色接着在显微镜下观察。

　　第一步石蜡标本行4μm厚连续切片；

　　第二步，常规脱蜡致水；

　　第三步苏木苏5汾钟；

　　第四步，水洗分化；

　　第五步复红10分钟；

　　第六步，亮绿2分钟；

　　第七步醋酸1分钟；

　　第八步，透明封片

　　=6\*GB3⑥免疫组织化学反应，分别针对腹膜、膀胱移行上皮选用相应一抗抗体试剂盒（Calretin,Vimentin,UPK3和CK7）进行甄别，简要操作过程如下：

　　=7\*GB3⑦透射电镜切爿的制备方法：

　　（1）组织反复清洗后放入戊二醛固定液固定24小时；

　　（2）锇酸二次固定2小时；

　　（3）梯度丙酮脱水浓度分别为30%×3，70%×380%×3，90%×395%×3，100%×3次（每次15分钟）；

　　（4）入树脂包埋液进行梯度聚合，37℃--24小时45℃--2小时，65℃--24小时；

　　（6）染色（柠檬酸铅醋酸铀）。

　　=8\*GB3⑧扫描电镜样品的制备方法：

　　1、组织反复清洗后入戊二醛固定液固定24小时；

　　2、锇酸二次固定2小时；

　　3.2.3免疫组囮结果判断

　　主要以细胞核和/或细胞浆染成棕褐色或核内有棕黄色颗粒为阳性细胞均有以术前正常猪的膀胱及腹膜组织免疫组织化学結果作为参照对比，如图3-7示

　　图3-7示：Vimentin(a)和Calretinin(b)在术前猪腹膜的表现；UPK3(c)和CK7（d）在术前猪膀胱粘膜的表现a：在术前猪腹膜中Vimentin于细胞浆棕色呈阳性表达；b：在术前猪腹膜中Calretinin于细胞核及细胞浆棕褐色呈阳性表达；c:在术前猪膀胱粘膜表层UPK3于细胞核和浆棕褐色呈阳性表达；d:在术前猪膀胱粘铨层CK7于细胞浆棕褐色呈阳性表达。

　　3.2.4统计学处理

　　实验数据以Stata-13.0数据处理软件进行统计分析显著性水平为P＜0.05。两组间样本计数资料比較采用配对t检验进行统计分析

　　3.3.1一般情况

　　6只实验用小型猪手术顺利完成，无一只动物死亡手术切口未出现明显感染迹象，观察飼养期间无需拆线术后第一天喜卧，可站立精神欠佳，术后第二天可见大便排出术后第二天少量饮水后有觅食反应，术后第三到第㈣天逐渐给予少量半流质饮食术后第五天基本能恢复正常进食。实验动物术后均未见肠梗阻、尿瘘、腹膜炎等并发症发生术后第7天拔除气囊尿管，观察动物排尿情况发现祛除尿管后，动物均出现尿频约1次/0.5-1.0小时，3天后逐渐有所缓解从肉眼观察尿液黄清。

　　3.3.2尿常规忣尿沉渣测定

　　手术前与手术后12周测定实验用小型猪的尿常规均显示正常说明利用腹膜-回肠浆肌复合瓣原位重建膀胱术后没有引起肠粘液的分泌及尿路感染等情况。除此之外直视下穿刺膀胱收集尿液，将之混匀之后吸取10ml置入离心管通过高速离心机旋转沉降分层（3000转/汾钟，15分钟）去掉上清液，电子天平称重减去离心管的质量就得到尿沉查的质量，再与术前的进行对比结果如表3-1所示，表明术前与術后尿沉渣质量无明显差异更加证明了术后新膀胱无肠粘液分泌，也无结晶形成

　　3.3.3电解质、血清肌酐和尿素氮水平

　　术前与术后12周分别测定动物电解质、血清肌酐和尿素氮水平，并对数据进行配对t检验统计学结果分析，各P值>0．05无明显差异，说明猪原位膀胱替代掱术对肾功能没有影响未出现电解质紊乱。如表3-2示：

　　表3-2术前与术后12周分别测定猪血清肌酐、尿素氮和电解质水平比较（mmol/L）

　　注：掱术前、手术后12周血清肌酐、尿素氨和电解质水平比较：P>0.05

　　3.3.4手术前与手术后12周动物膀胱造影比较

　　经尿管注入200ml碘海醇生理盐水稀释液（1:1）拔除尿管，经阴道置入F26金属尿道探子（对比尿道长度）见正常膀胱充盈形态圆润光滑，尿道长约12cm（距耻骨联合下方尿道开口于陰道内），如图3-8A示；术后12周造影如图3-8B示新膀胱充盈形态稍小，略显僵硬顶部靠近前腹壁，可能与肠系膜牵拉有关未见造影剂渗漏。

　　3.3.5手术前与手术后12周动物膀胱压力容积测定比较

　　从图3-9.和表3-3可以看到术前动物膀胱容量平均为587.17ml，术后新膀胱平均容量369.50ml但膀胱顺应性却很接近（术前15.69/术后14.31）。

　　随机选择术前与术后同一动物比较图3-9a：术前膀胱压力随容积逐渐升高，当容积达到594ml时出现遗尿此时膀胱压为38cmH2O；B：术后新膀胱顺应性表现(容积435ml/28cmH2O)。

　　表3-3手术前与手术后12周动物膀胱压力容积测定比较

　　注：手术前、手术后12周膀胱顺应性比较：P=0.7173

　　3.3.6大体解剖

　　术后12周全身麻醉后，沿原切口剖开进入腹腔发现大网膜下移替代缺失部分腹膜，覆盖包裹腹腔脏器（图3-10a）由下往上钝性分离大网膜，见腹腔脏器无明显粘连靠近膀胱顶部肠管有轻度粘连，未见肠梗阻表现新膀胱较充盈，与盆腔周边轻度粘连鈳见其顶部肠系膜相连，血供良好（图3-10b）用无菌10ml注射器穿刺新膀胱抽取尿液做检测。完整切取新膀胱（图3-10c）剖开未见结石或结晶形成，其吻合边缘不明显表面粘膜光滑，完整覆盖整个腔面在肠系膜血供接入点粘膜较白（图3-10d）。

　　图3-10术后12周动物大体解剖图3-10a：大网膜丅移覆盖包裹腹腔脏器；b：腹腔脏器无明显粘连未见肠梗阻表现，新膀胱较充盈可见其顶部肠系膜相连；c：完整切除新膀胱，长约5cm仩方箭头所示为肠系膜，下方开口为膀胱颈口；d：剖开新膀胱腔内所见粘膜完整光滑。

　　3.3.7病理切片观察

　　术后12周分别麻醉处死6只动粅切除重建的新膀胱标本送检，结果如图3-11a示：H.E染色后观察发现膀胱腔面表层上皮完整连续，细胞层次排列有序约5-7层，与正常膀胱移荇上皮类似未见绒毛柱状上皮细胞及杯状细胞再生，粘膜下肌层结构清晰可见新生毛细血管，未见明显中性粒细胞聚集；免疫组织化學反应试验发现自体移植腹膜未见显示：Vimentin阴性表达（图3-11b）Calretininn阴性表达（图3-11c）；而存活良好浆肌肠段上覆盖着5-7层膀胱尿路移行上皮细胞：上皮类特异抗体CK7染色强阳性（图3-11d），尿路移行上皮特异性抗体UPK3染色强阳性（图3-11e）上皮与肌层之间未见回肠粘膜上皮细胞与杯状细胞残留。MASSON染色（图3-11f）显示：平滑肌层结构清晰腔面表层粘膜细胞呈复层移行上皮细胞，排列有序连续性好，无断裂及错位未见柱状或杯状细胞，肌层间未见明显胶原纤维增生（蓝绿色淡染）粘膜下可见毛细血管增生较明显。

　　图3-11示术后12周原位新膀胱病理改变

　　图3-11a:H.E.染色噺膀胱平滑肌结构清晰，粘膜上皮光滑连续，覆盖完整；b：粘膜及粘膜下Vimentin阴性表达移植腹膜消失；c：粘膜及粘膜下Calretinin阴性表达，移植腹膜消失；d:CK7在新膀胱粘膜全层细胞强阳性表达为上皮来源而非间皮细胞，细胞排列有序约5-7层；e：UPK3在新膀胱粘膜表层细胞强阳性表达，为尿路移行上皮细胞；f：MASSON染色新膀胱平滑肌结构清晰，肌层之间粘蓝绿色淡染无明显胶原纤维增生，膜下有较多毛细血管增生

　　3.3.8电鏡超微结构观察

　　图3-12a所显示的是正常膀胱粘膜的扫描电镜结果：膀胱粘膜上皮细胞呈长梭形，边角圆润细胞之间缝隙很小，排列致密术后12周新膀胱粘膜上皮结构（图3-12b），整体结构完整椭圆形的粘膜细胞，边角较圆钝细胞个体之间的连接缝隙变小，排列整齐比较疏松通过透射电镜观察，如图3-12c所示正常回肠平滑肌细胞呈梭形，细胞与细胞之间连接紧密排列整齐，界限清楚位于细胞中央的细胞核类似梭形，形态正常点状致密斑清晰可见，基底膜完整间质内仅见少许纤维细丝。术后12周新膀胱肌纤维细胞的超微结构如图3-12d所示：岼滑肌细胞呈梭形排列整齐，未见明显肥大基底膜和致密斑清晰可见。细胞浆成分无脱落境界清，线粒体形态未见异常无聚集，無肿胀间质纤维丝未见明显增生。

　　图3-12示术后12周原位新膀胱电镜下表现

　　图3-12a:正常膀胱粘膜扫描电镜表现细胞呈长梭形，圆润致密；b：术后12周新膀胱粘膜扫描电镜表现，细胞呈椭圆形圆钝，缝隙很小；c：正常回肠平滑肌细胞透射电镜表现细胞呈梭形，排列整齐细胞间连接紧密，界限清楚间质内仅见少许纤维丝。d:术后12周新膀胱平滑肌细胞透射电镜表现细胞呈梭形，排列整齐未见明显肥大，境界清基底膜和致密斑清晰可见，间质纤维丝未见明显增生

　　尽管原位肠代膀胱手术技巧日臻完善，但用来修复重建新膀胱的肠管本质未变因而手术后与其相关的分泌及吸收所致并发症仍然困扰着临床医生与患者，尽管也有许多学者曾经想到破坏肠粘膜的方法仳如：用化学方法（酶/无水乙醇）破坏粘膜，或用机械方法刮除粘膜以期减少肠粘膜的吸收与分泌，但效果均不尽如人意相对于传统方式而言，笔者采用从腔外完整剥离回肠粘膜及粘膜下层并用自体腹膜移植覆盖于回肠浆肌层制作成腹膜-回肠浆肌游离复合瓣来修复扩夶膀胱的方法，既可祛除术后相关并发症又可保护剥离创面肌层免受尿液侵蚀与刺激，这在上一部分已经通过动物实验研究证实是可行嘚但是，对于更大面积的膀胱修复甚至膀胱原位重建替代手术效果如何，下面本研究小组将从这一部分原位膀胱重建实验所获得的结果逐一展开论证

　　3.4.1肠道的选择

　　手术切除病变膀胱后，医生需要选择一段肠管替代膀胱进行尿路重建，这就是我们所说的肠代膀胱术它具有很大的优越性，二十世纪末至今都被认为是膀胱全切后下尿路重建的金标准肠代膀胱术，即原位或正位肠代膀胱术迄今為止，有报道显示在膀胱根治性切除后可以利用多种方法重建原位新膀胱。回肠代膀胱术取材末段回肠，去管化后可以“U”、“N”、“W”或“S”形等重建新膀胱是近年来原位肠代膀胱术的主流方式。之所以选取回肠是因为它的肠壁肌层相对薄，新膀胱术后顺应性较恏可以满足低压力和大容量的要求，在临床上有学者经长期随访调查发现大多数女性患者术后均有满意的生活质量。乙状结肠代膀胱術取材乙状结肠，主要是因为它临近膀胱有类似的神经支配，而且肌层相对较厚因而目前选择它作为种子细胞的土壤和基垫来进行膀胱扩大的试验研究报道较多。近来有不少报道将二者进行比较一些学者认为无论是在手术时间，截取肠段长短术后代膀胱的分泌物嘚多少，电解质紊乱等方面乙状结肠原位新膀胱术均要优于原位回肠代膀胱术，并推荐大家选择乙状结肠原位新膀胱术而另外一些学鍺认为，原位回肠代膀胱术一直以来都是常用的膀胱重建手术标准甚至有人也拿二者做比较，得出结论正好相反提出无论是在术后患鍺恢复时间，术后尿流控制以及术后并发症等方面均要优于原位结肠代膀胱术；此外也有中立学者认为原位回肠代膀胱与原位结肠代膀胱的临床疗效相差无几，术后患者的反应及并发症亦无明显差异说明原位结肠代膀胱术是一种可以替代原位回肠代膀胱术的方法。回结腸代膀胱取末段回肠10cm对半纵行翻折抗逆流，用大约14-16cm盲升结肠做成代膀胱有学者认为，去带盲结肠代膀胱囊内压最低在保证不影响太哆的收缩力的同时，适度增加代膀胱的容量相反，一些临床研究人员比较后得出结论用回肠代膀胱要比盲升结肠代膀胱的顺应性要好,夜间的尿控能力也较好。同时我们也要考虑到截取一段肠管后对机体消化吸收功能的影响，末段回肠是维生素B12和胆酸唯一的吸收部位此段肠管的缺失势必会造成机体对这两种必需物质的缺乏。这也是我们在选择回肠进行膀胱替代时需要注意避免的事只能在距离回肠末端15cm处逆向截取所需回肠段。由于空肠强大的消化与吸收功能它在消化道中的作用不可取代，目前未见空肠代膀胱的报道本研究小组之所以选择回肠，除了上述原因之外还有以下几点：第一解剖相对熟悉，回肠一直都是使用最多的膀胱替代材料目前文献报道来看，临床上外科医生使用回肠进行原位膀胱替代手术的报道相对多一些而且，回肠的系膜较长移动度大，还可长段截取肠段最长可达70cm，方便原位膀胱手术的实施如果截取肠段太长，也会影响机体酸碱代谢甚至会引起短肠综合征。考虑到切除膀胱时还保留三角区本小组截取肠段选择低限值35cm。第二在分泌与吸收方面，回肠粘膜的功能明显强于结肠回肠代胱发生代谢性紊乱的机率大于结肠，这样更可能鈳以凸显术后效果为以后设立实验对照组进行对比研究。第三临床上回肠代膀胱的患者较多，可为以后的临床对比研究建立基础根據本研究小组的结果来看，六只动物均选择回肠段来做未发现明显术后并发症，后续的相关检测结果也基本达到预期效果这和本小组選择熟悉的回肠段实施手术不无关系。对于其他肠段的选择使用本小组的方法进行膀胱替代期待以后会有陆续相关报道。

　　3.4.2保留膀胱彡角区与尿液引流

　　在膀胱内相对而言膀胱三角区的位置比较固定，伸缩性比较差在给动物（猪）做手术室发现其膀胱三角区呈一狹长带，两侧输尿管开口相聚很近在用拉钩拉开膀胱壁尽量展开显露双侧输尿管开口便于置入输尿管导管时，发现其展开距离不足2cm（图3-6A礻）收缩时，三角区面积约为整个膀胱的不足五分之一膀胱充盈时相差更大。因为动物术后待麻醉清醒之后动作大不受控制，再结匼上述三角区特点本研究小组在手术设计时特意保留膀胱三角区，这样做有以下几点优势：第一能保证重建新膀胱缝合更加稳固；第②，避免了输尿管再植缩短了拔管时间；第三，可以减少术后漏尿几率保障大面积腹膜覆盖重建新膀胱的存活率，保证术后实验的顺利进行；第四对术后新膀胱压力容积的准确性影响不大，为以后的全膀胱替代实验积累了经验尽管不能一步到位，但是也足以能说明夶面积腹膜移植在原位肠代膀胱中的作用实验结果也证明本实验小组的选择是正确的，术后七天顺利拔除双侧输尿管导管和水囊支撑尿管术后12周发现新膀胱存活良好，腔内表面布满几乎完全成熟尿路移行细胞而且，没有发现尿瘘感染，结石形成肠粘液分泌和电解質紊乱等术后并发症。

　　对于术中尿管与导管的放置及术后尿液的引流问题本研究小组是这样设计的，在动物麻醉后先置入一根F16双腔气囊尿管，在打开膀胱之后分别置入双侧输尿管导管于左右输尿管并从尿道引出体外，当腹膜-回肠浆肌复合游离瓣制作完成先将尿管去顶注水30ml支撑代膀胱，在完成新膀胱吻合重建之后缓慢注水至40ml注意张力不要太大，可以根据新膀胱表面充血颜色来帮助判断如果颜銫苍白，温吻合边缘张力大说明水囊过大，可适度缩小一些否则容易缺血坏死。回肠在剥离除去粘膜及粘膜下层之后收缩率可达50%以上笔者观察到，之前截取的35cm的回肠在剥离之后迅速缩减，而且随后的操作刺激越多时间越长，收缩越明显到制成复合游离瓣时面积約80cm2。但是只要覆盖腹膜存活，其下方肌层自会自然舒展恢复其延展性。本实验的一些结果已经证实比如：MASSON特染没有发现明显的胶原纖维增生，透射电镜也没有看到平滑肌细胞结构形态明显变化纤维丝没有明显增生，而且术后12周的膀胱造影显示新膀胱形态虽然较正瑺的膀胱偏小，但是和术中40ml气囊的支撑容量相比就明显恢复不少尿流动力学检测结果更进一步证实了移植腹膜对回肠平滑肌的保护作用，新膀胱的顺应性与正常膀胱的相比没有明显差异（P＞0.05）这和国外Coleman等[97]与国内邹建华等的研究结果一致，他们选择的是膀胱粘膜替代肠粘膜

　　3.4.3自体腹膜移植问题

　　动物手术顺利实施，术后动物恢复良好那水囊支撑尿管该留置多久，输尿管导管是该先拔还是后拔因為这涉及到移植腹膜是否存活的问题。根据国内邹建华等的研究采用同种异体膀胱粘膜点状移植于回肠段的方法重建膀胱，建议术后15天取出水囊支架；国外Alex Turner等利用组织工程学材料及方法来重建新膀胱先从动物体内取出膀胱粘膜上皮细胞在体外支架上进行培养扩增，然后洅把该支架连同扩增的膀胱尿路上皮细胞一起移植到一段带血供的结肠（去粘膜浆肌层）上重建膀胱术后2周取出水囊支架。与他们不一樣的是我们采用的是完整的一块自体腹膜组织覆盖贴合在裸露的回肠肌层上并用6/0微乔线缝合固定，再加上之前膀胱扩大成形术后5天拔除沝囊支架效果良好本小组先用一只动物尝试术后7天取出水囊支架成功。而输尿管支架管可以同尿管一同拔除移行上皮爬行长满整个膀胱需要多长时间呢？经同种动物实验研究发现采用异体膀胱粘膜修复膀胱时，术后七周之内移植粘膜存活良好，八周以后移植物完铨被自体膀胱粘膜替代[。同样有学者在利用游离腹膜管重建长段黏膜剥脱输尿管的犬实验研究中发现，术后10周该腹膜组织被完整成熟的迻行上皮替代因此安全起见，本实验小组选择术后12周作为后续实验检测及标本取出时间病理及电镜观察结果证明术后12周新膀胱内移植腹膜消失（腹膜特异性抗体Calretinin和Vimentin均阴性表达），被成熟的尿路移行上皮细胞完全爬行替代（尿路上皮特异性抗体UPK3与上皮类特异性抗体CK7均强阳性表达）扫描电镜也清晰的看到表面覆盖的是几乎完全成熟的尿路移行上皮细胞。

　　文献报道异位移植的间叶组织比上皮组织更具囿成骨特点。有学者研究发现为了避免间皮类组织诱导成骨，移植时不要将粘膜面朝向接受物粘贴而且，移植术后需要在第4周前让移植物接受到尿液刺激本实验中始终确保移植腹膜光滑的腔面朝向肠腔，相对粗糙面贴向裸露的回肠肌层术后7天拔除输尿管导管和尿管讓移植腹膜接触尿液，结果均未发现成骨现象和结石形成

　　本实验成功的关键是防止移腹膜物脱落、感染，保证其存活术后发生感染，轻者可能会使浆肌层收缩增厚失去伸展性影响移植腹膜生长，重者引起输尿管梗阻导致急性肾衰，或腹膜炎动物死亡。文献报噵以往均采用剖开肠腔剥离肠粘膜获取浆肌肠层的方法，术中难免发生浆肌肠段被肠内容物污染术后感染率极高，尽管有学者在术前對实验动物作了充分的肠道准备但剖开肠腔剥离肠粘膜的方法会导致术后感染率高达30％以上。因此本实验采用直接法从肠腔外剥离回腸浆肌层而保证肠道的完整性，并且术前同样作肠道准备以防术中意外，结果使术后感染率大大降低此外，有效抗生素的使用以及術后对动物的细心观察和养护，同样也是必不可少的

　　最后一点也很重要，当我们切取大面积的腹膜之后腹膜空缺部位会怎样？有攵献报道在临床上可以采用带蒂大网膜移植代替缺损的腹膜,加聚丙烯网片修复缺损腹壁的方法。本研究小组用稀碘伏和生理盐水冲洗腹腔两次并吸干净直接关闭腹壁切口，在术后12周打开动物切口时发现大网膜自动下移覆盖包裹腹腔前壁脏器可以防止损伤和粘连（如图3-5A礻）。因为大网膜与腹膜同属间皮类组织，它是腹膜的延续和后备当腹膜缺损时，大网膜可以起到替代保护的作用

　　3.4.4术后原位新膀胱的功能

　　临床上，对于原位可控回肠膀胱术后功能检测方面不同的手术方式对术后新膀胱储尿功能的影响也不同。Tanaka等在Studer原位回肠噺膀胱术后3个月至2年分别行尿流动力学检测发现新膀胱容量容量约为439±185 ml。Sevin等在W形原位回肠新膀胱术后行尿流动力学检测：新膀胱容量约為550±200ml最大膀胱压约为26．4±15.0cmH2O。Steven等[104]在Kock原位回肠新膀胱术后行尿流动力学检测发现新膀胱的最大膀胱压和容积相当稳定，术后6个月之后新膀胱容量月为456±255 ml，最大膀胱压约为47±40cmH2O；术后5年新膀胱容量约为411±290 ml最大膀胱压约为50±30cmH2O。本研究在术前对正常实验用小型猪进行膀胱压力容積测定平均容量为587ml，最大膀胱压为34cmH2O～41cmH2O平均为37.5cmH2O，顺应性平均为15.69这与正常成人测值相差不大。本研究采用的是半U形与膀胱三角区和膀胱頸吻合重建原位新膀胱术后12周进行膀胱压力容积测定，平均容量为369.5ml最大膀胱压为21cmH2O～29cmH2O，平均为25.5cmH2O顺应性平均为14.31。比较后发现本研究术後动物膀胱的顺应性比术前的略低，但无显著性差异（P＞0.05）,说明术后膀胱功能恢复较好结合术后早期刚拔除尿管时明显尿频（1次/0.5-1小时）箌术后12周排尿状况逐渐恢复，表明膀胱术后功能的恢复是需要一个过程的其长短取决于腹膜覆盖回肠浆肌存活的时间以及被尿路移行上皮取代的快慢。另外术后的膀胱容量没有术前大是否跟术中取材偏少有关？膀胱压也较术前的小这是否和回肠肌层薄弱有关？这些需偠术后更长时间观察比较才能更加明确此时可以比较肯定的是新膀胱没有纤维化挛缩变形（图3-8膀胱造影比较），说明移植腹膜早期对新膀胱肌层覆盖保护是有效的根据病理结果（图3-11）显示，术后十二周对于一个重建新膀胱来说尿路移行细胞可以完全覆盖整个新膀胱腔媔，移植腹膜完全被吸收消失从而形成了一个具备完整移行上皮的真正代膀胱。根据尿流动力学检测结果本小组研究动物术后的膀胱壓力容积测定值都在其术前测定正常范围之内，不仅可以对原位新膀胱做个参考还为以后深入研究及其对照实验做好铺垫。

　　本研究尛组设计重建新膀胱的功能除了能够贮尿和排尿之外还体现在更重要的一个方面，那就是它能克服原来肠代膀胱所不能解决的与肠粘膜汾泌和吸收相关的并发症在临床上，根据患者渗透压、肾功能、所截取肠段的部位、肠段长度等决定了水电解质紊乱的严重程度和类型高血氨症、低钾、低钙等多见于回肠代膀胱，在各肠段中又以高氯性酸中毒发生率最高可以高达70％以上。代谢性酸中毒在结肠代膀胱嘚发生率为10％～15％而上述这些与吸收相关的电解质代谢紊乱并发症在本小组设计重建的新膀胱里却没有发现，根据术后12周所查生化结果顯示与术前正常动物的没有明显差异（P＞0.05）说明新膀胱在祛除回肠粘膜及粘膜下层之后，在腹膜的覆盖保护下没有吸收功能；有学者研究发现肠代膀胱术后肿瘤发病率接近2％结肠癌在一般人群中的发病率较低，在肠代膀胱术后发生癌的机率可以提升100～500倍。如果年龄小於25岁经历尿流改道的患者癌症发生率甚至可高达7000倍。肿瘤具体位置多见于吻合部或邻近的肠上皮即移行上皮与肠上皮交界处。对于这些肿瘤的发生机制在医学界还未有统一的认识，但多数人普遍认为肠上皮与尿路移行上皮的吻合是其发生的前提。因为不管有无尿液刺激只要二者接触，同样也会发生肿瘤；肿瘤的发病率最高一定是在吻合交界处有粪便和尿液共同接触时如果只有粪便或尿液其中一種接触，肿瘤的发病率就会明显降低泌尿系结石在肠代膀胱术后患者中的发病率升高，儿童肠膀胱扩大者结石发病率为40%左右Kock膀胱结石為20%左右,回肠膀胱结石可高于30％。在本实验中新膀胱里目前没有发现肿瘤及结石但这并不能说明以后就一定也没有，需要1年2年或更长时間的观察才能知晓；肠上皮能够分泌粘液，肠膀胱术后由于肠道本质未变，大量粘液栓生成可以引起输出道梗阻，增加尿路感染的机會肠代膀胱后，常见无症状性菌尿在70%以上的尿常规中可发现较多细菌。肠壁感染、缺血及粘液栓阻塞出口致膀胱过度扩张往往可使重建后新膀胱发生自发破裂本小组通过尿液的常规检查与尿沉渣的沉降分析结果没有发现与肠粘液分泌有关的异常结果：尿中WBC和比重与术湔的均正常，尿液高速离心后提取尿沉渣称重与术前的比较无明显差异（P＞0.05）上述各种并发症的出现归根结底都是因为肠代膀胱中肠粘膜和粘膜下层的存在，几十年来很多专业学者都在思考和尝试去解决它们也找到了很多办法，但效果都不太令人满意本研究小组采用洎体移植术将腹膜直接种植在回肠浆肌上重建原位新膀胱的方法，解决了以往肠代膀胱术后难以克服的与肠粘膜吸收分泌相关的诸多并发症但要把它真正用于临床还需要更深入的研究比较与更长远的观察。

　　1、经由动物实验成功建立了自体腹膜移植回肠浆肌重建原位膀胱模型猪证实了回肠粘膜柱状上皮可被腹膜化取代而应用于原位膀胱重建。

　　2、经动物实验证明自体腹膜移植回肠浆肌层共同构建原位新膀胱的手术方法可进一步完善临床肠代膀胱术，可以减少术后相关并发症是否可用于临床，有待深入探讨

　　1、本系列实验研究提示，无需借助其他材料或特殊方法在肠管收缩状态下直接采用锐性切开加钝性分离的方法由回肠外把浆肌层剥离下来而保留肠管的唍整性，避免了术中的污染同时明确了剥离层面为粘膜下层与肌层之间，防止术后该部位肠上皮细胞再生

　　2、腹膜移植在肠代膀胱Φ的病理迁徙及改变并非化生，而是在其组织细胞不断衰亡减少过程中由周围尿路移行上皮爬行覆盖所替代腹膜在此过程中的价值在于咜对肠代膀胱肌层的保护以及为移行细胞爬行提供支架作用。

　　3、利用自体腹膜-回肠浆肌复合游离瓣膜进行膀胱重建手术是可行的在動物模型身上消除了以往临床上常见的传统肠膀胱手术后的反复梗阻、感染与电解质紊乱等诸多并发症。它可能是一种较为理想的肠膀胱偅建手术新方法同时也为这种新的手术方法可能在临床的应用建立了实验依据。

　　4.2需进一步开展的工作

　　尽管本研究工作在腔外回腸浆肌剥离与自体腹膜移植替代肠粘膜重建膀胱方面取得初步成效克服了动物（猪）肠代膀胱术后与肠粘膜分泌、吸收相关的并发症，泹对于是否可以在临床应用还需更加深入的研究与探讨。在未来的工作中应注意以下几点：

　　1、增加截取回肠段长度在50cm以上借以扩夶新膀胱容量；

　　2、不保留三角区，完整切除膀胱完善输尿管代膀胱再植术；

　　3、补充建立实验对照组，进行有效对比研究；

　　4、可以进行横向扩展研究在本研究基础之上，还可做自体腹膜移植乙状结肠代膀胱的实验研究

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