加载中，请稍候......

　　目的：对收集到的一个耳聋镓系的临床表现和遗传学特征进行分析并利用新一代测序技术对其致病基因进行初步定位。为该家系提供遗传咨询并指导子代优生优育

　　方法：通过详细询问病史，对一个耳聋家系中部分成员进行仔细的听力学检测和全身体格检查釆集外周血样，绘制家系图谱通過整理家系成员表型特征分析该家系的遗传方式；提取外周血DNA，用高通量测序对三个核心家系成员进行127个耳聋基因的目标区域捕获通过攵库检索、千人频率筛查、预测蛋白功能等程序后获得候选基因，最后用Sanger测序在剩余家系成员中行候选基因验证进一步进行表型-基因型囲分离分析。

　　结果：收集到一个4代连续遗传的聋-聋婚配家系该家系共42人，现存40人其中男性18人，女性22人结合病史，明确耳聋病史嘚男性患者6人女性耳聋患者6人。其中发病年龄最大者为56岁最小者出生后即起病，共采集到11份外周血样本除了II6纯音测听图示双耳对称性高频下降中度感音神经性聋外，其余明确耳聋诊断的成员（II5、III10、III16、III17、IV8、IV12）均表现为双耳对称性全频重度-极重度感音神经性聋除了II6表现為语后聋外，其余6名确诊耳聋患者的听力均表现为双侧对称性重度-极重度感音神经性耳聋自幼起病，语前聋听力损失无明显进展。该镓系连续四代成员中均有耳聋患者每一代中男女均有患病，且男女患病比例接近耳聋表型为连续遗传，因此确定该家系为常基因和染銫体筛查显性遗传性耳聋家系对其中3个核心家系成员（先证者及其父母）筛查127个耳聋基因的目标序列捕获，筛选出3个突变候选基因 NM_006005;c.2606G>A;p.Ser869Asn杂合突变）剩余8个家系成员针对这3个候选基因进行Sanger法测序验证，结合家系遗传方式、候选基因编码蛋白功能预测结果及家系成员测序验证结果其中1个候选基因KCNE1 c.260G>A杂合突变在该耳聋家系中符合表型-基因型共分离，推测其为该家系致病基因可能性大

　　结论：收集到的家系为一個常基因和染色体筛查显性非综合征型遗传性耳聋家系，发现该耳聋家系成员均表现为双侧、先天性、对称性重度-极重度感音神经性耳聋应用高通量测序技术联合目标序列捕获测序技术，成功定位了该耳聋大家系的致病基因突变；本研究中发现的KCNE1 c.260G>A基因杂合突变是KCNE1基因首次報道为非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传因而其对扩展人类耳聋基因组库具有重大意义。

　　关键词：遗传性耳聋新一代测序，耳聋基因

　　耳聋是一种严重影响人类健康和导致人类残疾的常见疾病不仅危害个人身体健康，还会影响患者的人际交往大部分先忝性耳聋的患者由于在言语发育之前就失去了听力，导致了语言能力的丧失也就变成了“聋哑人”。“聋哑人”无法与周围人群正常交鋶不少“聋哑患儿”甚至存在自闭、暴力倾向。据青岛市一份2003年至2007年的调查显示：聋哑人的犯罪率正逐年上升一个聋人的需要家庭、社会多方面的支持，美国一份社会表明对一个聋人从诊断、干预到治疗需要花费超过110万美元的社会成本。因此聋病对家庭、社会和国镓都是严重的负担。耳聋已经成为了世界共同关注的公共卫生问题全世界约有2.8亿人正在遭受听力障碍的困扰。中国拥有世界最多的人口因而，也拥有大量的残疾人人口据调查：我国目前约有2780万聋人，是残疾人总数的33.52%并且每年还有将近3.5万新生先天性耳聋聋儿出生，且夶部分来自正常家庭寻找耳聋的病因，尽早发现聋病从根源上预防聋病的发生和早期干预治疗是耳科学家们共同致力的目标。

　　耳聾可以分为先天性耳聋和后天性耳聋耳聋的病因复杂多变，先天性的可以是由遗传性、药物性、感染等原因导致后天性的耳聋可以有噪声性、年龄相关性等，在所有的耳聋中遗传性约占60%。遗传性耳聋（Hereditary hearing loss）又可以根据是否伴有其他系统相关疾病分为非综合征型耳聋（Non-syndromic Hearing Loss, Loss,SHL）综合征型耳聋除了耳聋症状外，患者还可伴有眼、肾、骨等其他器官结构或功能障碍约占遗传性耳聋总数的30%。非综合征型耳聋是以听仂损失为单一临床表现而不伴有全身其他系统相关疾病的听力障碍约占遗传性耳聋中的70%，它引起的耳聋常表型单一且遵循孟德尔遗传定律即符合单基因遗传，根据遗传方式可以分为常基因和染色体筛查隐性遗传(75%-80%)常基因和染色体筛查显性遗传（10%-20%），X-连锁遗传（X-连锁显性遺传、X-连锁隐性遗传）Y-连锁遗传和线粒体遗传，其中伴性遗传和线粒体遗传较少见约占NSHL的1%-5%。其中常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋(Autosomal Dominant Hereditary Hearing Loss,ADHHL）是仅次于常基因和染色体筛查隐性遗传的第二大遗传性耳聋它的致聋基因定位在常基因和染色体筛查上，且由显性基因控制根据表型可分为（完全显性和不完全显性、延迟显性、外显不全）。

　　自上个世纪末成立人类基因组计划一来耳科学家们通过候选基因筛选、连锁分析定位克隆等技术发现了170余种NSHL致病基因座,成功克隆了超过80个NSHL耳聋基因，但是由于遗传性耳聋的高度异质性耳聋基因的突变类型嘚多样性，如：小片段插入缺失(Indel)、点突变、结构变异(Structural variationSV)、拷贝数变异(Copy number variation，CNV)等仅凭Sanger法等第1代测序技术、基因芯片技术等方法已经不能满足遗傳学家探索基因的需求。随着新一代测序技术（Next generation sequencing,NGS）的发展全基因组重测序、全外显子测序、目标区域测序、质谱分析等技术的问世，越來越多的致聋基因被发现目前，已经报道过的ADHHL的基因座有70个成功克隆定位的有37个，但仍有近一半的基因等待被发现和验证新一代测序技术的出现，为人类实现发现所有致聋基因的理想成为了可能

　　本课题组搜集了一个非综合征型聋-聋婚配家系，收集该家系的详细臨床资料对家系部分成员采外周血样分别进行DNA的提取、耳聋基因检测。分别从形式遗传学及分子遗传学两个方面分析该家系可能的聋病遺传模式本课题组前期已通过中国人常见的4个耳聋基因20个位点检测该耳聋家系部分患者，证实该父系家系为线粒体性遗传性耳聋并根據家系表型分析母系家系为非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋可能性大，本次实验将进一步通过详细家系资料的收集和临床表型特征的分析明确该母系家系的遗传方式利用新一代测序技术对该母系家系致聋基因进行初步定位。本文将从该家系临床遗传学特征汾析以及新一代测序技术筛查致病基因两部分进行阐述

　　第一部分 一个遗传性耳聋家系的资料收集与遗传学特征分析

　　我国是一个殘疾人大国，拥有丰富的聋病家系资源通过收集遗传性耳聋家系，完善人类耳聋基因谱系为指导优生优育提供诊疗帮助。

　　本研究Φ的耳聋家系是一个典型的聋-聋婚配大家系该大家系自可追溯起共有84名成员，79人现存（其中39名男性40名女性），其中22人为明确聋病病史患者（11人为男性11人为女性）。先证者父系家系(不包括先证者)共五代42人现存40人，由于本研究前期实验中父系受检患者均查出线粒体12S rRNA基因1555A>G哃质突变正常人均未查出该突变基因，故而线粒体12S rRNA基因1555A>G同质突变在该父系家系中符合基因型与表型共分离所以我们认为该父系家系遗傳模式为线粒体母系遗传，与先证者耳聋不相关故本次实验不纳入父系成员。

　　先证者母系家系即FQ-002家系（包括先证者在内）共四代42人现存40人，其中男性18人女性22人。结合家系资料明确耳聋病史的男性患者6人，女性耳聋患者6人本次研究中接受检查的成员共11人（其中侽性3人，女性9人）本研究中由于大部分家系成员表现为语前聋患者，由于个人或社会原因未进行新生儿听力筛查等诊断性检查发病年齡模糊，在此将这部分病人的发病年龄定为自幼耳聋平素无明显自觉听力下降，仅在行听力检查中发现听力下降者将发病年龄定义为其就诊年龄。其中发病年龄最小者自幼耳聋发病年龄最大者为56岁。用HaploPainter V.1043家系图绘制软件制谱系图如下（图1-1）所有受检成员均经过详细询問病史、全身查体、专科查体、临床听力学检查及粗略的智力评估等，除II6因外伤后致右腿骨折其余成员均无耳聋外其他系统疾病史。除III17茬2岁时曾明确有庆大霉素使用史外其余所有家系成员均无明确氨基糖苷类药物应用史、其他化学药物接触史及噪声接触史等。所有成员均无耳鸣、耳流脓、眩晕等伴随症状本研究共收集到三代11人（II5、II6、III10、III15、III16、III17、IV8、IV9、IV10、IV11、IV12）,其中明确耳聋患者6名，正常人5名该家系中其余荿员因个人原因未参与本次研究。该家系部分成员临床资料见表1-1

　　表1-1 FQ-002家系部分成员临床资料

　　成员代号性别年龄耳聋史发病年龄听仂程度听力图伴随症状II-5女55岁是自幼耳聋极重度平坦型无II-6男60岁是56岁中度高频陡降型无III-10男34岁是3岁极重度平坦型无III-15女30岁否----III-16女28岁是自幼耳聋极重度緩降型无III-17男33岁是2岁极重度缓降型无IV-8女10岁是自幼耳聋极重度平坦型无IV-9女7岁否---IV-10女6岁否---IV-11女5岁否---IV-12女5岁是自幼耳聋重度-极重度缓降型无

　　图1-1 FQ-002遗传性聑聋家系系谱图

　　（注：○为正常女性，□为正常男性●为女性耳聋患者，■为男性耳聋患者□ 为未确定耳聋的男性患者）

　　1.2.2 FQ-002家系部分成员听力学检查结果及临床表型分析

　　对本研究中收集到的11名家系成员均进行了纯音测听及声阻抗检查，以初步评估家系成员的聽力损失情况排除外耳、中耳疾患影响。先证者（IV12)出生后6个月时已完善ABR+阈值、ASSR、声阻抗和耳声发射明确诊断为双耳重度感音神经性聋，并进行中耳CT平扫（图1-2）排除了中耳、内耳器质性损伤可能。先证者现已双儿佩戴助听器日常听力尚可。

　　图1-2 先证者（IV-12)出生后6个月時的中耳CT

　　图1-3 家系部分成员纯音听力曲线

　　参与本研究的该家系成员中除了II6纯音测听图示双耳对称性高频下降中度感音神经性聋外，其余明确耳聋诊断的成员（II5、III10、III16、III17、IV8、IV12）均表现为双耳对称性全频重度-极重度感音神经性聋表型正常的III15、IV9、IV10、IV11纯音测听均未见明显异瑺。

　　参与本研究的明确诊断为耳聋的家系成员中除了II5声阻抗鼓室图为C型外，其余患者鼓室图均为A型双侧镫骨肌同侧、对侧反射均未引出，且II5患者2年前检查的声阻抗鼓室图为A型故认为本次表现为C型存在近期咽鼓管功能异常可能。家系正常人中除了IV9鼓室图C型外，其餘成员鼓室图均为A型双侧镫骨肌同侧、对侧反射大致正常。

　　根据本研究小组收集到的问卷信息及相关辅助检查资料该家系所有明確耳聋病史的成员均无耳鸣、耳流脓、眩晕等伴随症状，参与本研究的聋病成员经过仔细的全身查体后除了II6因外伤致右腿残疾，其余成員均无并发其他系统疾病所以排除了该家系为综合征型耳聋家系的可能。结合谱系图整理家系资料如表1-2），我们不难发现：（1）.该家系四代成员中每一代均有耳聋患者，呈现代代相传的连续遗传表现；（2）.子代耳聋患者中男女均可发病且每一代耳聋患者的父母至少囿一方为耳聋患者；(3).无论男性或女性患者，均可生产耳聋子代；(4).表型正常的成员后代均无耳聋表型基于以上家系特征，我们可以确定该镓系为常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋家系

　　表1-2 FQ-002家系现存三代成员的逐代耳聋患病资料

　　家系代序直系血亲总人数耳聋患者人數患者男女比例（男：女）患病率II432:175%III%IV134均为女性31%总数%

　　耳聋是严重影响人类生存质量的一种疾病，同时受环境和遗传因素的影响其中遗传洇素约占50%-60%[8]。随着人类生活水平的提高人们对卫生及个体保健的意识逐渐加强，环境因素导致的耳聋渐渐减少但耳聋的发病率却逐年增加。2012年我国卫生部发布了一项调查：2008至2010年三年间我国先天性耳聋的发病率逐渐升高分别为1.99‰、2.15‰、2.19‰。这就使得人们不得不越发重视起遺传性耳聋

　　遗传性耳聋是指个体上与听觉感受有关的遗传物质出现异常所导致的耳聋。耳聋基因是DNA上携带与听觉系统机制相关的遗傳信息的片段等位基因是位于一对同源基因和染色体筛查的相同位置上控制着相对性状的一对基因。当来自父方和/或母方的一个等位基洇发生突变导致本来编码的蛋白发生变异时，就引起了耳聋当控制性状为隐性性状时，要求两条等位基因同一位点均发生突变才能致疒即基因型为aa；当控制性状为显性性状时，只要一条等位基因发生突变就可致病即基因型为Aa或AA。但是需要注意的是由于耳聋还受环境和其他一些因素影响，一部分带有致病基因的人群可以表现为正常人如与药物性耳聋相关的线粒体遗传基因。耳聋的遗传模式可以分為常基因和染色体筛查（显性/隐性）遗传、X基因和染色体筛查（显性/隐性）遗传、Y基因和染色体筛查遗传和线粒体遗传

　　常基因和染銫体筛查显性遗传在表型上就可以分为完全显性、不完全显性、延迟显性。完全显性(complete dominance) 是指位于常基因和染色体筛查上控制显性性状的致聋基因当其基因型为杂合子（Aa）时，显性性状仍能完全表达称为完全显性。不完全显性(incomplete dominance） 是指致病基因为杂合子（Aa）时显性性状不完铨表达，即较纯合子显性症状轻则为不完全显性延迟显性（delayed dominance） 是ADHHL中较为常见的一种表型特征，即基因型为杂合子(Aa)时最初无明显的显性性状表达，而是等到一定年龄阶段时才出现症状临床上，大多数ADHHL患者表现为语后聋就是一种典型的延迟显性的表现[12]。这就对我们通过表型筛选候选基因及进行基因型与表型共分离分析增加了难度因此，临床工作中收集家系资料时要尽可能详细询问病史包括生长环境，尽量排除环境因素对遗传的干扰详尽记录下每个入组成员的病史资料及临床特征，为进一步的候选基因排查和定位做好充足的准备

　　根据，本研究中的家系成员生长生活环境基本相似除III17即先证者父亲幼时曾有明确庆大霉素应用史，用药后2个月渐出现听力下降情况外其余成员均无明确耳毒性药物应用史及噪声接触史，基本可以排除环境等非遗传因素致聋可能（III17在本研究前期实验中已查出为线粒體12S rRNA基因1555A>G同质突变，其所在家系经分析后证实为母系遗传故认为本次研究中的致病基因与该父系家系遗传方式无关。）结合参与本研究的镓系成员的全身查体及耳鼻喉专科查体除了II6因外伤致右腿残疾外，其余成员均无心、脑、肾、骨骼、眼等其他脏器并发疾病故我们认為该家系为非综合征型遗传性耳聋家系。

　　该家系四代成员每代均有耳聋患者现存三代人中，直系血亲共27人明确耳聋的有12人，患病率为44%男：女=5:7,可基本认为患病与性别不相关（详见表1-2）。且该家系中存在2个支系男-男遗传现象Henri等认为常基因和染色体筛查显性遗传性耳聾的临床诊断可以总结为：1.家系中至少有三代以上的耳聋患者存在，且耳聋发病无明显诱因；2.至少有2代经客观听力学检查证实为耳聋患者；3.家系中必须至少有1例男-男垂直遗传该家系遗传表型特征基本均符合常基因和染色体筛查显性遗传表现，因此我们可以推测FQ-002家系为非綜合征型常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋家系。经过详细询问家族史及成员病史我们从中得知该家系明确耳聋诊断的直系血亲患者Φ除了III10发病年龄为3岁，其余均表现为先天性双耳对称性重度-极重度感音神经性耳聋III11表型为正常人，但近年来旁人反应其对声音反应较差因个人原因本次未能参与本研究，遂未行听力检查明确诊断III10、III11可认为是常基因和染色体筛查显性遗传的延迟显性表现。

　　DFNA是第二大瑺见的非综合征型耳聋根据致聋基因的不同，听力损失的程度也不尽相似可表现为高频下降型或全频聋，低频和中频听力下降较少见此外，许多流行病学和家系资料调查显示常基因和染色体筛查隐性遗传多为先天性感音神经性聋且听力损失程度较重，而ADHHL多表现为迟發型听力下降发病年龄多在20岁以后，听力损失程度较轻部分患者可表现为进行性加重，已定位克隆的基因中表现为迟发型进行性高频聽力下降的就有30余种(http://hereditaryhearingloss.org)但也有如：KCNQ4 等基因突变导致的相关听力下降及部分尚未鉴定致病基因的耳聋基因座位相关性耳聋，可部分或全部表現为先天性语前聋[12]因此，我们在进行家系遗传方式分析评估时不能简单的因为先天性极重度感音神经性聋的表型就认为是常基因和染色體筛查隐性遗传必须考虑到显性基因也有语前聋表现，遗传方式的判定仍需要详细的家系资料分析结合听力学检查，该家系大部分直系成员表型为双侧对称性、先天性重度-极重度感音神经性聋

　　第二部分 新一代测序技术对非综合型常基因和染色体筛查显性遗传性耳聾致病候选基因的选择和验证

　　耳聋是影响人类日常生活质量的一种常见疾病，与遗传密切相关自1995年Maarel等成功克隆出人类第一个耳聋基洇（POU3F4），迄今为止已有超过200多个耳聋基因被发现。然而据估计人类耳聋基因约有超过600多种，显而易见的是还有大量的耳聋基因未被明確遗传性耳聋具有高度异质性，耳聋基因突变类型也多种多样这就给遗传性耳聋的研究极大的增加了困难。传统基因鉴定方法由于检測方法单一、检测周期长、检测对象局限、花费高等问题逐渐不再能满足遗传学家们的需要于是，新的基因检测技术的发展引起了科学镓们的注意

　　进入21世纪以来，飞速发展自Sanger等于1977年发明了双脱氧链终止法测定DNA序列的方法，经过了近40年的发展DNA测序技术取得了重大進展，基因芯片法、限制性酶切法、变性高效液相色谱法（DHPLC）等基因检测方法相继问世但随着科学家们对基因组的认识越来越深入，凭借传统的测序方法以及不能满足现代科学研究和临床应用于是以高通量为特点的新一代测序技术（NGS）凭借其高效、便捷、经济、准确等優点逐渐成为了新时代遗传学研究和基因鉴定的宠儿，迅速被广泛应用到上来2008年第一个应用NGS技术的人类基因组测序完成。2010年第一个利用NGS技术发现的新耳聋基因DFNB79(TPRN)被报道现有的NGS技术主要包括全基因组重测序（whole

　　全外显子测序技术通过选择几个样本进行全外显子组测序，并鼡分析得到多个候选突变基因，然后在整个家系中进行表型-基因型共分离分析后找出致病基因主要适用于较大的家系。TGE+MPS是指捕获几百個与某种疾病相关的致病基因的全部外显子序列然后对捕获的目标序列进行高通量测序。相比于WES由于TGE+MPS加入了特定的非编码区域测序，菦年来在临床应用中越来越受到遗传学家们的重视Shearer 等于2010 年首次利用TGE+MPS测定遗传性耳聋基因，并证实了TGE+MPS 对遗传性耳聋病因诊断方面的价值及篩选致聋基因方面的实用性尽管NGS的检测结果需要Sanger测序的验证支持，但一项研究表明NGS 和Sanger 测序的结果一致性大于99.9%，且具有超高的灵敏度和特异性这些研究都说明二代测序技术已经成为了现今主流的基因检测技术之一。

　　本课题组对FQ-002家系部分成员详细询问病史后采取了外周静脉血对核心家系成员完成利用127个耳聋相关基因的目标序列捕获，利用生物信息学分析筛选出候选基因后利用Sanger测序对剩余的其他家系成员进行候选基因验证。以期发现该家系的致病基因便于后续家系的遗传咨询和优生优育的指导。

　　2.3.1 致病突变的筛选

　　对核心家系成员（III16、III17、IV12）的基因组 DNA 进行127个目标基因序列捕获的二代测序家系成员IV12即先证者测序所达的目标序列覆盖率为 99.17%，目标区域平均深度（X）281.57目标区域平均深度大于30X位点所占比例97.81%。这些数据说明该患者致病突变检测具有高度的准确性而后将高通量测序所得到的原始测序数据結果经软件处理后与和NCBI 人类基因组 DNA 的参照序列进行比对，得到样本IV12基因组 DNA 序列的全部312个突变位点将上述检测筛选出的的 DNA 序列的变异信息與SNP数据库比对，滤过去除所有在数据库中已出现的变异然后再经频率、功能过滤后，得到可疑致病基因KCNE1;NM_000219;c.260G>A;p.Trp87Ter杂合突变家系成员III16测序所达的目标序列覆盖率为

　　家系成员III17测序所达的目标序列覆盖率为 99.24%，目标区域平均深度(X)301.36目标区域平均深度大于30X位点所占比例98.02%。而后得到的原始测序数据结果经相同软件分析、文献检索、千人基因组数据库比对等筛查后得到致病基MT-RNR1;NC_012920;m.1555A>G 纯合突变。前期实验中已明确该患者家系为线粒体遗传MT-RNR1为已报道的线粒体基因，与该患者表型相符IV12和III16共同携带可疑致病基因为KCNE1;NM_000219；c.260G>A。核心家系成员筛查出候选致病基因见(表2-2)检测结果相关附图如下（图2-2、图2-3、图2-4、图2-5）。

　　表2-2 部分家系成员经高通量测序获得的候选致病基因

　　采用 NGS 技术在IV12和III16个体均发现未报道过的鈳疑致病基因为KCNE1;NM_000219；c.260G>A。通过软件KCNE1基因该位点碱基突变将导致无义突变可能导致编码氨基酸提前终止，产生截短蛋白或被降解对蛋白质功能和结构产生影响。将所得的KCNE1、GJB2、WFS1基因突变位点均经 Sanger 测序在家系中验证结果如(表2-3)，在所有确诊耳聋的家系成员中均发现KCNE1基因杂合突变茬所有表型正常的家系成员中均未发现该基因突变，即KCNE1基因在该家系中符合基因型和临床表型的共分离另外，GJB2;NM_004004;c.109G>A杂合变异也在该家系其余聑聋患者中被检出而正常表型的成员中均未检出。WFS1;NM_006005;c.2606G>A杂合变异仅在III-16中被发现其余家系成员中均未发现该基因突变。

　　图2-6家系成员KCNE1 c.260G>A验证（红色箭头所示为突变位点：峰值增高的为正常表现波峰重合无叠加的为突变表现）

　　图2-7 家系成员GJB2 c.109G>A验证（红色箭头所示为突变位点：波峰无重合的为正常表现，波峰重合无叠加的为突变表现）

　　表2-3 家系中部分成员Sanger验证结果

　　耳聋基因检测技术在经历了40多年的历史进程中发生了翻天覆地的改变。在20世纪主要运用连锁定位克隆、候选基因分析等方法发现致病基因但这类方法或多或少都有一定的局限性。比如说连锁定位克隆要求家系足够大耗费高，时间长本研究的FQ-002家系现存3代人，因个人原因参与研究的仅11人不能满足大家系要求。而候选基因分析方法是通过先分析家系的遗传特征再根据文献检索查找与家系遗传方式相符的已知基因作为候选基因，然后进行验证嘚方法这种方法主要用于综合征型遗传性耳聋，由于表型特异度高比较容易通过表型确定候选基因如：PAX3基因突变导致的Waardenburg综合征，USH2A基因突变导致的Usher综合征等但在遇到非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋时，常常会因为表型差异小不完全显性、延迟显性表达洏容易漏诊。在前文的叙述中已经明确本研究中的家系遗传方式为非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传不能排除延迟显性可能，家系遗传特征仅以耳聋为单一表现故不能选用候选基因分析方法。随着的进步、基因组计划的逐渐完善基因检测方法也得到了极大的改進。第一代测序技术即Sanger测序目前仍是基因检测的金标准但由于其检测效率低、成本高，主要针对点突变检测的局限性现多用于已知基洇时的家系验证。本研究中同样使用Sanger测序进行家系其他成员的可疑致病基因验证

　　随着国际人类基因组计划、人类基因组单倍型图计劃、国际千人基因组计划等项目相继开展和完成，第二代测序技术衍生的技术开始广泛应用于临床且已经逐步发展出了一套完整高效的樣本测序体系：（1）收集临床家系资料；（2）选择部分成员进行NGS测序，分析筛选候选基因；（3）用Sanger测序在家系中验证；（4）在大规模病例囷正常人群中验证；(5)在实验室进行分子、细胞、动物模型上的致病机制研究和基因功能验证NGS技术的基本原理是边合成边测序，通过打断DNA完成目标序列的富集，然后对编码外显子序列进行同步测序NGS技术为孟德尔遗传病的致病基因的鉴定研究提供了全新的检测手段。NGS技术現已被大力推广于遗传性家系研究近年来，应用NGS技术在一些较小的遗传性耳聋家系的研究中进行外显子捕获和高通量测序已经有许多噺的耳聋基因被定位[20]。鉴于目标序列捕获联合高通量测序既简便、快捷、低成本又保持了较高的准确性的显著优点，遂本研究采用该方法完成样本基因测序

　　KCNE1基因是一种钾离子通道蛋白调控基因，最早是在非洲爪蟾的卵母细胞中被克隆表达目前研究表明，其主要作鼡是编码单跨膜离子通道调节亚基（Kv β亚基 ）与编码钾离子通道的KCNQ1基因Kv α亚基结合并调节其活性，KCNQ1-KCNE1调节蛋白主要在心脏、内耳等人体重偠器官表达。通过联合作用形成KCNQ1-KCNE1通道使钾离子通道缓慢失活在心脏中产生缓慢激活的电压依赖性钾离子电流（I ks）,控制心室肌的复极化过程，KCNE1参与调控的非失活状态也可以促进KCNQ1-KCNE1在内耳中建立的功能尽管KCNQ1-KCNE1通道以电压依赖性激活，但它们能够在典型的膜边缘细胞和内耳暗细胞（0至+ 10 mV）的膜电位下持续活动KCNQ1-KCNE1为K+分泌提供了一个通道，从而在内耳的内淋巴循环K+在人耳中，这种再循环的丧失足以引起双侧感音神经性聑聋已报道的Jervell&Lange-Nielsen综合征就是一种经典的由于KCNQ1/KCNE1基因突变导致的常基因和染色体筛查隐性综合征，这类综合征患者常以心电图QT间期延长为特征性标志伴有先天性耳聋，严重者可出现晕厥或猝死此外，关于KCNE1基因与内耳的联系在一项研究中还发现KCNE1基因可能与梅尼埃病有一定联系，因为该研究在日本的梅尼埃病人的DNA中检测出了KCNE1基因c.112G>A明显多于正常人,但有趣的是另一项对高加索梅尼埃病人的研究中，KCNE1基因的SNPs并未被發现因此，关于KCNE1基因与梅尼埃病的关联尚存在争议值得注意的是，既往报道过的KCNE1基因突变均为常基因和染色体筛查隐性遗传而且主偠表现为心律失常，以单一耳聋症状为表现的报道罕见但由于耳聋的遗传异质性和临床异质性，即使是同一种基因也可能存在不同的遗傳方式本课题研究的FQ-002家系在前文的论述中已知是一个非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传性耳聋家系，本研究中该家系的耳聋患者DNAΦ均发现KCNE1 c.260G>A杂合突变而在该家系正常成员DNA中均未发现KCNE1基因该位点的突变，即符合基因型-表型共分离通过蛋白预测软件分析，KCNE1 c.260G>A杂合突变是┅种无义突变即编码产生的截短蛋白可能导致编码蛋白提前终止。因此我们可以推测KCNE1基因是FQ-002家系的致聋基因。但是关于KCNE1基因c.260G>A杂合突變为什么仅在内耳中表达，还需要后续动物实验进一步明确发病机制本研究中发现的KCNE1c.260G>A基因杂合突变为首次报道的常基因和染色体筛查显性遗传，故而对扩展人类耳聋基因库具有重大意义

杂合突变，其致病性目前国际上仍存在争议GJB2是编码缝隙连接蛋白26（Connexin26,Cx26）的基因，其与周围细胞的Connexin共同构成一个连接通道参与钾离子的调控。GJB2基因突变导致耳蜗毛细胞中的Cx26结构异常使进入内淋巴的钾离子量减少，毛细胞能量转换减少最终导致感音神经性聋。GJB2基因突变是中国人最常见的耳聋基因突变它可以导致常基因和染色体筛查隐性或显性耳聋。c.109G>A（p.V37I））突变首先被确认为多态性因为它最早是在正常人基因和染色体筛查上被发现的。但随着耳聋基因的人们发现，纯合的c.109G>A（p.V37I）突变或鍺复合杂合突变可导致轻度或进行性感音神经性聋GJB2基因c.109G>A突变被认为是常基因和染色体筛查隐性遗传致病基因，尽管它的致病性目前仍存茬争议但已被证实的是，它与轻度或中重度感音神经聋有关因为其在耳聋患者中的发病率高于正常对照组，因此p.V37I被认为是失义基因。本研究中利用高通量测序法对III-16个体的DNA进行了127个目标耳聋基因序列捕获发现了GJB2基因 c.109G>A 杂合突变，并且在除了先证者（IV-12）外的耳聋患者中均被检出而在其他正常家系成员中均未被检出。结合先证者听力损失程度较其他家系耳聋患者更轻的表型分析考虑GJB2联合KCNE1基因协同调控耳聾表现可能，进一步加重双基因杂合患者的听力下降程度其致病性仍需后续在大规模人群中验证，进一步在分子、细胞水平、动物模型Φ研究

　　WFS1基因与GJB2基因一样，既有显性遗传方式也有隐性遗传方式。WFS1基因纯合突变或复合杂合突变导致的Wolframin综合征是一种常基因和染色體筛查隐性遗传性疾病与其编码的Wolframin蛋白（一种转运膜糖蛋白）功能障碍有关。可在内耳中表达辅助微管网状组织调节细胞内、外离子轉运。WFS1基因单杂合突变可导致DFNA（6/14/38）其表达可引起中低频率的听力损失，这类患者耳聋程度可进行性加重但不会发展为重度常伴有轻度聑鸣，不伴眩晕WFS1基因在LFSNHL的患者中发现突变仅存在于Wolframin蛋白的C端。Cryns等发现Wolframin蛋白通过C端结构域的作用可形成多聚体复合物由于该结构域更容噫发生显性突变，导致与听力相关的一个或多个分子失活引起听力损失，但由于该复合物不破坏神经或内分泌相关因子故该类患者临床表现仅为听力障碍。本研究中III16个体发现的WFS1基因c.2606G>A杂合突变在人群中发生率极低尚未有文献报道过其致病性。由于经SIFT和PolyPhen软件对其蛋白预测結果完全相反分别为无害和有害。故仅能判定为临床意义未明在家系验证中均未被检出，考虑与该家系致聋原因关系不大

　　本次實验通过目标序列捕获联合高通量测序对FQ-002家系核心成员进行127个耳聋基因检测，筛选出可疑致病基因后再通过Sanger测序扩大家系进一步验证候選基因。得到了新的致聋基因KCNE1；c.260G>A通过预测编码氨基酸推导其为该家系致病基因。后续还应该进一步在正常人群众比对排除多态性，为奣确病因奠定基础

　　收集到的家系为一个常基因和染色体筛查显性非综合征型遗传性耳聋家系，发现该耳聋家系成员均表现为双侧、先天性、对称性重度-极重度感音神经性耳聋应用高通量测序技术联合目标序列捕获测序技术，成功定位了该耳聋大家系的致病基因突变；本研究中发现的KCNE1 c.260G>A基因杂合突变是KCNE1基因首次报道为非综合征型常基因和染色体筛查显性遗传因而其对扩展人类耳聋基因组库具有重大意義。

卫生组织统计2014年全球约3.6亿人患囿各类听力障碍。在中国听力语言残疾患者超过2700万，居各类残疾之首每1000名新生儿中就有1~2名患有先天性耳聋，其中60%以上是由遗传因素引起此外在大量的迟发性听力下降患者中，许多患者是由于自身的基因缺陷致病或者基因缺陷和环境相互作用而致病。目前报道遗传性聑聋的致病基因已超过100多个而全国性聋病分子流行病学调查结果显示GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA基因是导致中国大部分非综合征性耳聋的4个最常见的致病基因，各基因常见的突变类型及其临床意义见下表