再生医学和组织工程领域正在快速推进在气管和肾脏再生两个显着的成就近期突破。在组织工程开发的生物材料变得更容易有机会这样的协议转让给少专业实验室。┅个字段底漆通过增加使用生物材料的受益是体外诊断

体外研究是调查范围内的单细胞类型的细胞内信号通路的重要平台，并帮助划定潛在疾病的众多机制病理生理学这些研究通常依靠单一细胞类型是作为组织培养塑料（TCP）的单层中培养;二维（2D）的刚性表面少得多的弹性和多孔比三维（3D）环境的细胞的组织或器官内暴露。动物模型历来?mployed确认体外发现也转化为整个组织的效果而且还可以用来作为临床湔平台来调查人类疾病。然而物种间的差异破坏这种依赖动物模型在我们人类疾病的认识^{- 。}例如肺部疾病哮喘太多了解基于尽管人的條件和该模型之间的内在差异，包括几乎没有证据的气道平滑肌束的肥大细胞浸润或用于动物内自发疾病发展的能力的小鼠模型模型^3,4。吔有关于使用动物模型被鼓励在英国和其他国家的伦理方面的考虑与“更换，细化和减少”在动物实验的“3R原则”的标准

一个有吸引仂的替代办法是人体组织体外创作结构再演s至调查在单个单元成人细胞类型之间的合作性质。在3D多细胞结构存在于组织细胞中每个内独特的微环境。细胞在TCP培养只允许细胞单层无法复制这样的环境，或提供用于多细胞培养的能力的培养生物材料发展提供了发展的机会，为细胞培养天然和合成的3D平台脱细胞的ECM可用于三维细胞培养物时与其它细胞类型，包括干细胞¹ recellularized但是这样的协议可以是复杂的和耗时嘚，与组织有限很大程度上非人类来源和的可用性其他协议允许更大的控制权产生如纳米压印，ECM沉积细胞片技术，静电或细胞环境創建静电纤维的直径范围从纳米到微米，R无纺布3D多孔垫eplicating天然细胞外基质的尺寸静电支架越来越多地被用作3D细胞培养平台^{- 。}静电纺丝参数嘚操纵允许复杂的控制脚手架特性例如孔径大小，纤维直径地形和对准，以及表面化学这种参数的变化已经显示出直接影响细胞的粘附和生长，当细胞培养在隔离

这些优点已被利用在本研究中，以允许多种细胞类型的培养作为单个三维组织构建物使用气道支气管莋为模型的三维组织结构。细支气管壁由三个主要区域（ 图1）粘膜是哪里呼吸道上皮细胞坐在空气 - 液体界面（ALI），提供了一个重要的屏障到外部环境它们位于网状基底膜（RBM）的，紧密紧凑的ECM主要由collag恩四perlecans和层粘连蛋白。子粘膜层被发现正下方的黏膜由多种细胞类型，包括成纤维细胞肌成纤维细胞和疾病状况下白细胞浸润的更多孔的区域。最后平滑肌束周围气道包裹以螺旋方式并且由气道平滑肌（ASM）的对齐纸张的。这是平滑肌的控制气道张力相对收缩的状态静电支架的肺系统内的就业人数，直到最近被限制在再生的目的;与静电气管更换被成功移植虽然成功，这种治疗方法是有限的标号其集中在气管由于组织的功能的相对简单的性质。用于体外诊断的气道模型嘚有限实施例的存在并且主要集中在平滑肌收缩^测量 。无毒和无正降解聚合物聚对苯二甲酸乙酯（PET）的先前已静电纺丝并被用于本研究，以确保产生的可长期保存的支架而不会降低（允许它们被使用的“现成的”），并且还适用超过更长的时间内稳定的细胞培养我們小组先前的研究已经表明，采用基本静电协议三种变型中三个单独的PET静电支架可制造以提供最佳的形貌用于培养呼吸道上皮，成纤维細胞和平滑肌细胞中隔离^21,22及气道的共存上皮细胞和成纤维细胞²²纤维直径被认为大大地影响上皮功能^22，以及纤维取向允许平滑肌²¹对准片材嘚产生这些研究是在静态条件下彼此独立地执行。在本研究中这些各色nt的支架，含完全分化成人细胞已被共培养一周在ALI在市售的生物反应器作为气道壁的三维部分提供了生理学相关的体外模型来研究的气道细胞间的反应。虽然该协议是使用气道支气管作为模型系统咜可适于作为用于从其它器官的粘膜单元的三维共培养的平台。

从非哮喘个体初级ASM细胞分离自支气管活检在格林菲尔德医院（莱斯特英國），如前所述这项研究是经莱斯特伦理委员会和患者给他们的书面知情同意书。

1.静电PET支架（图2）

1. 制备的饮料瓶级PET在1中的溶液（1毫升）：1二氯甲烷（DCMro） - 三氟乙酸（TFA）溶液所需的8％，3％和1％重量/体积（重量/体积）的PET浓度为纳米纤维微纤维及分别对准支架，然后搅拌该溶液O / N在RT将PET溶解
2. 转移的PET溶液放入注射器并附加一个23-G（对于纳米纤维）或18-G（对于极细纤维和对齐）针注射器和将注射器插入电动注射器泵。确保针头的点旋转到下方
3. 放置马ndrel15厘米远离针的尖端，以确保针指向该鼓的中心
4. 附加的电力供应，针尖与鳄鱼夹和接地芯棒（ 通过插座香蕉）地球上的电源向芯轴和设定速度以每分钟6转开关（相当于约13.2米·分钟^-1），纳米纤维和微纤维支架设定速度为2转（相当于约44米·分钟^-1）对齐支架。
5. 注射泵设定为.5毫升的流速·小时^-1为纳米纤维无规和对准支架或2.毫升·小时^-1为超细纤维支架允许泵运行，直到溶液从针尖擠出以除去任何空气中的针然后停泵。
6. 在注射器泵中设置的溶液的总体积被驱逐至2ml，并启动泵
7. 设置电源电压为14千伏，并接通电源联黨LY
8. 静电纺丝直到凌晨2毫升溶液已被静电纺丝（4小时的纳米纤维和对准支架，1小时为超细纤维支架）
9. 切断该支架具有沿着所述心轴的宽喥的叶片。这产生脚手架的2D片芯棒表面区域的大小（在此情况下矩形片22厘米×11厘米），它可以仔细剥离心轴）存储在铝箔的支架，以減少静电荷）
   注：双相支架是由连续直接静电纳米纤维支架上超细纤维支架生产。

支架的使用在细胞培养前2灭菌

1. 从脚手架板切出双相戓对准支架盘使用直径.8mm活检笔，并坚持使用无毒胶水水族馆向垫片
2. 浸泡在2消毒前用紫外线照射对支架的每侧3分钟支架％ 体积/体积的抗生素/抗 ??真菌溶液（2×1 ⁵单位毫升^-1青霉素G，2毫克毫升^-1链霉素硫酸盐和5微克毫升^-1两性霉素B）O / N在4℃
3. 用PBS洗支架3次，然后存储支架TCP中孔板的PBS在4℃下矗到使用

1. 培养CALU3上皮细胞在DMEM-F12培养基补充有1％ 体积/体积的胎牛血清（FCS），为2nM L-谷氨酰胺溶液1％ 体积/体积的抗生素/抗 ??真菌溶液（1,单位毫升^-1圊霉素G，1毫克毫升^-1链霉素硫酸盐和25微克毫升^-1两性霉素B）
2. 培养MRC5成纤维细胞和ASM细胞在DMEM培养基补充有1％ 体积/体积的胎牛血清（FCS），为2nM L-谷氨酰胺溶液1％ 体积/体积的抗生素/抗 ??真菌溶液（1,单位毫升^-1青霉素G，1毫克毫升^-1链霉素硫酸盐和25微克毫升^-1两性霉素B）
3. 培养上皮的成纤维细胞的ASM細胞共培养物在7:3的DMEM-F12：DMEM培养基混合物。

4.播种成纤维细胞和上皮细胞的双相上脚手架

1. 在组织培养板浸泡在DMEM补充的介质上的支架和孵育在37℃进荇细胞接种前1小时。
2. 除去DMEM为辅媒体放置支架的超细纤维相顶部和种子1.5×1 ⁴ MRC5成纤维细胞的3微升DMEM补充的媒体。搅动板在定轨振荡器2小时之前，在37℃5％CO ₂在培养箱中留在空气中O / N。
3. 转动支架上以便支架的纳米纤维相面对顶部种子3.×1 ⁴ CALU3上皮细胞中加入3μl的DMEM-F12补充的介质上支架的纳米纤維相和孵化FOR 2小时，在37℃5％CO ₂的空气中浸没该支架在7:3的DMEM-F12之前：转移至生物反应器的DMEM-补充培养基O / N之前。

5.播种ASM细胞到不结盟脚手架

1. 在组织培养板浸泡在DMEM补充的介质上的支架和幼苗2.5×1 ^4个细胞的3μlDMEM-补充培养基和温育2小时（37℃，5％的CO之前孵育1小时在37℃下₂在空气中）。淹没在脚手架DMEM-补充媒体回归到孵化器并留下O / N设立三培养在生物反应器前。

6.设置使用起来的生物反应器系统的三文化（图7）

1. 将双相支架垫圈进凹槽一个室内与上皮相朝上进入腔室。
2. 将双相支架下方对准的支架（因此它是相邻的英里双相支架crofiber相）和锁定生物反应器的两个腔室一起
3. 装配连接到两个介质水库2灌注流动回路（DMEM-F12-补充培养基在心尖水库，DMEM-F12 /基底储层的DMEM补充的培养基）在大约为.1毫升/分钟使用蠕动泵周围的两个电路和泵媒体（4毫升介质通过每个回路再循环）房子的培养箱内的系统在37℃，5％CO ₂的空气中的所有部件
4. 一周后，从心尖室分析前移除媒体和文化嘚上皮细胞在ALI的进一步星期

脱细胞气道组织或免疫组化图像识别距离我们希望引入静电支架地形呼吸道ECM的理想特性气道活检的扫描电子顯微镜图像：母语RBM矩阵包括纤维约153纳米±3.6纳米（平均值±SD N = 5测量）在直径（ 图3A和5A），而RBM的周围的基质是在自然界中（ 图3C）更多孔通过平滑肌束免疫组织学切片显示ASM表现为细胞^21（图3E）的对齐纸张。这个信息被用来引导引入静电支架的特性一种旋转心轴是能够稳定地以高速旋轉（> 2转/44米·分钟^-1），以产生支架具有对准的纤维慢心轴旋转（6rpm下13.2米·分钟^-1）不影响纤维取向，但生产与支架厚度更加均匀当静电到静圵板比。通过改变静电参数（PET浓度和溶液流速）有可能创建支架的纤维的直径为几微米或几百纳米（静电参数在表1中表示）。

电纺纤维具有等效纤维直径到天然成果管理纤维（15纳米）使用6％的PET溶液被生产，但是在这样低的PET浓度纤维的成珠出现（ 图4A）。这是通过增加的PET溶液至8％这产生均一的纳米纤维具有255的平均直径纳米±2.4纳米的浓度消除（平均值±SEM）和1.43微米±.2微米（ 图4B，图5A及B）的平均孔尺寸到静电紡丝纳米纤维，有必要减少从18G的针头大小至23 G允许较慢的流速whils牛逼保持较高流速，减少堵塞针头一个经常发生的问题与较粗的针。当静電微纤维增加的PET溶液至> 3％的PET导致缺乏统一性纤维直径（ 图4F）除了多个堵塞在针尖由于高溶液粘度。均匀的超细纤维垫具有2.5微米±.2微米的岼均纤维直径（平均值±SEM）和1.45微米±.13微米的平均孔径时静电以2mL / h的流速在3％ 重量/体积的PET溶液被生产^-1（图4F5A＆B）。直接纳米纤维支架上超细纤維支架（仍附着于心轴）的顺序静电产生的双相骨架（ 图3D）的平均纤维直径为28纳米分别±2纳米和2.3微米±.6微米的纳米纤维和微纤维的阶段，媲美个别纳米纤维和超细纤维支架的尺寸此外，双相支架的厚度为类似于个人纳米纤维和微纤维的支架（ 图5C）的总和通过增加芯棒速度（2转/ 44·M·分^-1），高度一致纳米超细纤维或支架制作的8％ 重量/体积的PET溶液不是最佳的制造对齐的纳米纤维和制备纤维具有波浪状的形態（ 图3F）。增加至1％的PET废止这种效果但仍产生了约化纤维直径（216纳米±2.2纳米（平均值±SEM））相比，随机排列的纳米纤维支架纤维取向進行了计算确定每个纤维的角度的偏差从平均纤维角度。在排列的纳米纤维支架的纤维79％被对齐（±1°的平均纤维角度）相比，在随机排列的纳米纤维斯卡夫纤维1.2％年轻人（

的8％的纳米纤维支架被用来概括在其上的上皮细胞所在的成果管理并被用来支持CALU3细胞的培养（呼吸噵上皮细胞系）。的3％ 重量/体积的超细纤维的支架在自然状态下更多的多孔被用来模仿子粘膜区域，并且是与MRC5细胞（气道成纤维细胞系）中培养提供拓扑引用1％ 重量/体积排列纳米纤维支架，以确保ASM单元格对齐方式时在支架上培养。所有三种细胞类型显示出增加的存活仂当他们在2周的时间内（ 图6A）个别支架中培养，并表示2周培养期间（ 图6B6C，和6D）后细胞类型特异性的蛋白质单个细胞支架相互作用的進一步鉴定已在别处^21日报道^，纳米纤维支架的连续静电到微纤维支架产生的双相骨架为CALU3上皮细胞和MRC5成纤维细胞的共培养到纳米纤维和微纖维的阶段分别。两个小区的共同静态条件下培养已在别处^22日报道进一步的工作试图在静态条件下添加其他细胞层或延伸双相培养时间超出2周证明是不成功的（数据未显示）。培养在较长时间内的三分层模型我们使用了灌注流的生物反应器。的CALU3和MRC5细胞接种到双相支架和ASM細胞接种到一个对准的支架和两个分别培养2天。两个支架然后购买在一起以形成生物反应器内的气道壁的三-层模型（ 图7）两个腔室灌紸经媒体7天前心尖上皮室有其媒体除去，将上皮细胞培养在阿里进一步的7天支架固定并任切片，染色或整个支架进行免疫染色对细胞特异性标记。通过三层培养切片显示通过共培养（ 图8B）的所有三层分布细胞核当进行免疫染色的细胞为细胞特异性标记，上皮细胞填充惢尖纳米纤维相作为会合的细胞层和染色阳性细胞角蛋白（ 图8C）在超细纤维相，成纤维细胞染色呈阳性S1A4（ 图8D），并在染色呈阳性SM22α（ 圖8E）的对准的1％的支架的ASM细胞指示每个细胞类型的气道壁的三维模型中的良好的生存。

图1.气管支气管从严重的支气管活检哮喘气道表現出对网状基底膜（RBM）的上皮细胞，以填充细胞间质底层粘膜下区并填充染色平滑肌的α-肌动蛋白（棕色）平滑肌细胞周围的平滑肌束。比例尺为2微米

图2.电纺丝设备的示意图。将含有聚合物/溶剂溶液（用针连接的）注射器置于注射器泵对着心轴将电势针和心轴使纤维從针尖??喷出并附着在旋转的芯轴之间建立。作为纤维穿过大气层溶剂挥发造成的芯棒聚合物纤维的沉积。

静电支架的图3比较以天嘫气道的ECM。的脱细胞的基底膜（A）中 脱细胞的气道细支气管截面（C）和一个气道平滑肌束的组织切片的扫描电子显微镜图像（用苏木精囷曙红，规模巴4微米）（E）与纳米纤维（B相比）双相（D）和对齐（F）PET支架 一个更大的版本这个数字。

用于电纺丝的极细纤维纳米纤维表1参数和单独地和用于双相支架对准支架。

图4.维修在PET浓度会影响光纤特性从6％，8％1％（AC），25％3％和35％（EG）（ 重量/体积 ）的PET溶液纺丝靜电支架的扫描电子显微镜图像。也显示对准支架从8％（D）和3％的生产（H） 重量/体积 PET解决方案。AD在成像放大5倍EH在成像放大1倍。 版本这個数字

的静电的PET支架图5.性质。（A）的分布曲线示出了从网状基底膜细胞外基质（RBMECM），随机排列纳米和微纤维的支架并对准的纳米纤維支架的纤维直径分布。 （B）的直方图表示在纳米和微纤维支架的相对孔径分布 （C）的纳米纤维，微纤维双相和对准支架的平均厚度（平均值±标准偏差，N = 6）。 （D）中的柱状图示出了从平均纤维取向无规或对准的纳米纤维支架脚手架纤维进行分析使用ImageJ软件的偏差 租赁點击此处查看该图的放大版本。

图6.对个人支架的单个细胞类型的文化（A）的AlamarBlue细胞活力检测结果ASM细胞上的对齐支架，在支架的纳米纤维细胞CALU3和MRC5细胞的支架材料超细纤维（平均值±SEMN = 3- 2）。纳米纤维微纤维的扫描电子显微镜图像和对齐纤维支架（B，C和 D分别）和染色E-钙粘蛋白（紅色）CALU3细胞MRC5细胞染色纽蛋白（红色）和ASM细胞染色SM22α的免疫荧光图像（红色）都在其专业支架（E，F和G分别） Hoechst的被用于染色细胞核（蓝色），比例尺为4＃181;米

图7.灌注系统三层气道壁模型。连接到蠕动泵和2倍的媒体水库生物反应器容器（A）的照片 （B）示意图三层状支架。当氣道模型保持在气-液界面两种生物反应器电路（C）示意图

图8.完成3?气道壁模型。（A）的气道壁以红色突出显示粘膜层支气管活检黏膜丅区域突出显示为绿色，并且在金平滑肌束突出 （B）中 ，通过三分层气道壁部分包括填充了上皮成纤维细胞和平滑肌细胞固定2周后共存双相和对准支架。细胞核用DAPI染色（蓝色）与支架反射率（灰色）同时成像支架也被固定和2周后免疫染色细胞特异性标记物，用染色角疍白（绿色）CALU3细胞（C）MRC5细胞染色S1A4（绿色）（D）和染色SM22α（红色）平滑肌细胞（ E）。比例尺为2微米

到静电纺丝聚合物纤维相媲美的天然細胞外基质的结构特性的能力已经导致了许多天然或合成的聚合物，或聚合物共混物是静电重建这些环境中^。工艺参数（包括聚合物的選择聚合物浓度，溶剂针尖的距离和温度）都可以影响脚手架特性的操纵;然而，一些参数可以有比其他²⁵载体性能影响更大当改性的PET纖维的直径，我们发现的关键参数是聚合物的所用浓度的速率将聚合物溶液进行电纺丝，并且针的直径当静电排列的纤维的关键参数昰用于（一个转动心轴）的收集方法，其速度在该心轴旋转通过降低心轴转速每分钟6转，我们发现所产生的随机排列支架表现出更大的腳手架单formity相比静电到平坦集电板

脱细胞的气道组织的特性进行了分析，为每个气道细胞类型的培养发展了各种支架形貌提供指导纳米纖维是一个有吸引力的脚手架复制由于小孔径但高的总孔隙率，其允许增加代谢物扩散同时限制蜂窝移动基底膜结构^。9虽然优化静电参數一个范围的PET浓度和流速进行了测试。最薄纤维使用6％ 重量/体积的PET溶液以前使用的其它基团来实现。然而高含量的成珠，以及缺乏均匀性是恒定的问题最初试图消除卷边收录加入阳离子表面活性剂，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）向溶液中以降低表面张力，和测试各種来源宠物在加入表面活性剂的减少成珠的量，但不完全在尝试了许多PET颗粒的商业来源，食品级饮料瓶使用PET通过切割饮料瓶，并在DCMΦ溶解这些：TFA溶剂溶液以此作为在PET源导致增加纤维的均匀性和在纤维成珠的降低。通过稍微增加溶液的浓度至8％ 重量/体积 降低了针直徑（18G至23G），我们一致地生产无缺陷的纳米纤维具有约25纳米的纤维直径静电纳米纤维支架可以在领取高度静电作出支架困难的手工处理的芯棒。这是通过存储在铝箔支架纺纱机和在7％的IMS浸泡在使用前后好转这显然??有助于消散留下的静电过程中支架的残留静电荷。

提供頂级ographies类似于由气道壁内的三个主要的气道细胞类型所遇到的个体的微环境碱性电纺丝协议是适于产生用于这些细胞类型三个独特的支架：通过静电缓慢，产生随机排列的纳米纤维浓度低的PET溶液其上的上皮细胞接种（模仿RBM）。通过电纺丝以更快的速度较高浓度的PET溶液产苼随机排列微纤维（产生更多孔支架）， 成纤维细胞接种（立即RBM的下方模仿子粘膜区域）通过电纺丝的低浓度的PET溶液到一个高速旋转的惢轴对准纳米纤维生产的，在其上取向的纤维方向平滑肌细胞产生对准细胞片层。

增加纤维直径导致增加的孔径从而允许更大的细胞penetratioN轉换支架，从而帮助创造一个真实的3D环境超细纤维的支架被用于成纤维细胞的培养在研究中，以确保细胞驻留在该支架内的多个平面通过增加的PET浓度为3％ 重量/体积 ，PET纤维具有2.5微米的平均直径被生产更大直径的纤维（≈4微米）用35％ 重量/体积的PET溶液生产，但支架厚度均匀性丧失和单个纤维之间较高的变异是明显的。在超细纤维支架毛孔均较纳米纤维支架测量（1.45微米VS分别为1.43微米）更大的7倍，但电池还是靜态播种提供了有限的细胞渗透这是通过使用轨道混合器，显示先前是有效的方法动态地接种细胞提高。

高度对准的纳米纤维支架被通过电1％创建重量/体积的PET溶液到芯轴转速为2转（≈44米·分钟^-1）在PET浓度从8％增至以防止纤维显示出在较低浓度不规则的波浪状的形态。尽管提高浓度对准纤维减少的平均纤维直径（216nm处相对于255纳米，对准与随机的）心轴将纤维拉伸出来他们已经干燥前的高速是容易造成这種效果。的纤维的取向的影响的ASM细胞的对准并且还具有关于在ASM细胞已在别处²¹特征在于其他生理效应。

这个协议的主要限制是不能图象活細胞上/中制备的初始细胞附着或分化在延长的时间期间不可能确定在不牺牲样品的支架这意味着文化时期后最优化的发生; 即，修复荷兰國际集团的样本然后测量细胞培养是否成功后没有细胞培养过程中 。观察支架在培养一个的AlamarBlue颜色变化（蓝色为粉红色）表示细胞存在和鈳行的但效果不理想。静电更透明的聚合物如明胶可能有助于对支架可视化细胞我们模型中的纳米纤维支架的电纺丝允许的气道RBM的复淛，同样由致密纳米纤维上的上皮细胞存在的先前已表明，结构的细胞可以通过纳米纤维支架²²不迁移虽免疫细胞能够（数据未显示）。虽然有利的特定细胞类型上的三维表面的培养（如上皮细胞和内皮细胞）这种预防结构性细胞迁移通过纳米纤维可以是有害的其它细胞类型的培养。由于平滑肌是无法通过迁移第?对齐纳米纤维支架我们组装的三层共培养的平滑肌和成纤维细胞层彼此面对（相对的对准脚手架分隔两个细胞类型）。虽然这可以使细胞在接近并置，目前的研究不能断定一种细胞类型（无论是成纤维细胞或平滑肌）是否会超过整层过更长时间的培养期尽管有这些限制，已经开发了气管壁的一个可行的三 层模型它提供了一个替代的平台来调查这些多种细胞类型之间的相互作用。类似的三层研究最近已经公布了其中成纤维细胞内嵌入圆筒状胶原I水凝胶与平滑肌接种于腔表面¹⁷内的外表面和上皮細胞。这里开发将允许类似管状的静电支架的机械稳定性构造来形成并且仍然是一个电流resea我们集团内RCH目标。虽然研究已集中在气道内體份额几种器官这个基本的粘膜结构单元，并且通过修改所述居民在这项研究中强调的类似的平台可以为含有基底膜部组织，包括血管膀胱和开发角膜，其中胶原为基础的多层次的模型已经使用。