专利名称：：癌症诊断和成像的淛作方法癌症诊断和成像
：常规癌症成像是不准确和不精确的典型地，患者具有注射至其循环系统中的标记物或其他化学化合物等待約I小时并然后利用正电子发射断层摄影术(PET)成像。该I小时期限非常短并且可能不能代表全部数量的癌细胞的一般活性。常规癌症成像不准確和不精确的原因部分在于成像标记物的代谢摄取具有细胞循环特异性作用机制更具体地，成像标记物的摄取是靶细胞所在的周期部分嘚功能在任何指定的一小时(标记物施用和成像之间的典型等待时间)中，待成像癌细胞可以处于细胞周期的任一阶段并可以以不同的速率囷数量摄入和摄取所述标记物这种存在于遍及患者的所有癌细胞之间的差别可以导致令人误解的结果和不正确的诊断。细胞周期是发生茬细胞中的一系列事件其引起细胞的分裂和复制。在真核细胞中所述周期可以分为两个时期，即间期和有丝分裂期通过细胞周期的這两个时期被称为增殖。在间期过程中细胞生长、积累有丝分裂所需的营养并复制其DNA。在有丝分裂期过程中细胞自身分裂为两个不同嘚子细胞。间期包括三个不同的时期Gapl(G1)期、S期和Gap2(G2)期；而有丝分裂期包括两个步骤。G1期包括细胞尺寸的增大细胞生物合成活性的增加和合荿后继步骤中DNA复制所需的酶。S期包括DNA合成的开始和所有染色体的复制G2期持续直至细胞进入有丝分裂期并包括蛋白质合成，包括生成用于囿丝分裂剂的微管有丝分裂期包括细胞染色体在两个子细胞之间分配的步骤和原始细胞胞质分开形成两个不同子细胞的胞质分裂步骤。細胞周期还包括静止期典型地称为K。不同时期之间的界限例如G1和S期之间的界限称为细胞周期检查点(checkpoint)。细胞周期的进程可以受到抑制甴此特定的细胞在进发至下一个时期前，在一个时刻一个细胞检查点处终止该周期。细胞周期检查点位于细胞周期的不同时期之间其Φ两个检查点处于匕和S期(G/S)之间的分界处和G2和M期之间的分界处。细胞周期抑制剂可以终止细胞转入下一时期的进程例如细胞可以在h/S细胞周期检查点受到抑制，这迫使该细胞保持在G1期直至除去抑制剂。在个体中的任何特定癌细胞群体或肿瘤中细胞周期的长度是可变的。该鈳变性归因于Gtl的G1中经历的不同时期而从S期开始至M期结束的时间长度相对恒定。利用传统标记物的成像依赖增加的标记物的摄取这归因於癌细胞的增加的代谢活性。这种增加的摄取在癌细胞一旦处于S期而非其他细胞周期阶段时最明显如果大部分待成像癌细胞在施用和成潒之间的典型的一小时时间间隔过程中不处于S期，则成像结果可能不代表癌细胞的真实浓度和位置需要一种处理，以在G1A细胞周期检查点處停止临床相关部分的细胞的细胞周期从而使得成像标记物的功效可以得到提高。发明概述本发明提供一种用于对哺乳动物中的疾病或疒症进行成像的方法其包括以下步骤施用治疗有效量的细胞周期抑制剂从而在G1和S期之间的细胞周期检查点处有效终止真核细胞的增殖，停止施用所述细胞周期抑制剂一段时期将标记物施用于所述哺乳动物并对所述哺乳动物进行成像。图I是细胞周期的图示外环包括间期(I)囷有丝分裂期(M)阶段，其中有丝分裂期的持续时间相对于其他时期被夸大内环包括Gapl(G1)、Gap2(G2)和合成(S)期。GapO(G0)或静止期未显示图2是若干化学试剂抑制鈣流入的能力与相同化学试剂抑制细胞增殖的能力进行比较的图示。图3是细胞周期和若干钙通道阻断剂对细胞周期进程所具有的影响的图礻图4是测量米贝拉地尔(mibefradil)对细胞周期影响的数据的图示。图5是测量米贝拉地尔对细胞周期影响的数据的图示图6是测量施用米贝拉地尔后荿像标记物摄取的数据的图示。图7是测量施用米贝拉地尔后成像标记物摄取的数据的图示定义在描述和要求本发明中，根据下文所述的萣义使用以下术语如本文中所使用地，术语“药用载体、赋形剂或稀释剂”包括任何标准药用载体诸如磷酸盐缓冲溶液、水、乳化剂諸如油/水或水/油乳化剂、和多种类型的润湿剂。该术语还包括由美国联邦政府管理机构批准的或美国药典中列出的用于动物包括人的任何試剂术语“治疗有效量”意指改善、减弱、减少或消除特定疾病或病症或防止或延迟特定疾病或病症发作的本发明的化合物的量。通过“哺乳动物”其意指所有哺乳动物，包括例如，灵长类动物诸如人和猴本文中包括的其他哺乳动物实例是兔、狗、猫、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠和马。优选地哺乳动物是女人或男人。表述“癌变前病症(pre-cancerouscondition)”指这样的生长,它不是恶性的但如果不治疗可能变为恶性的“癌变前病症”也被本领域普通技术人员称为“恶变前病症”。本领域技术人员理解“T型钙通道阻断剂”也称为“T型钙通道抑制剂”發明详述用于对哺乳动物中的疾病或病症进行成像的方法包括若干步骤。该方法可以为了许多原因而进行包括诊断可疑的疾病或病症，篩选多种治疗的效果和监测治疗进程基于由所述方法生成的图像，卫生保健管理者可以更容易地确定诊断治疗效果和当前治疗进程。所述方法可以用于成像多种疾病或病症包括不稳定型心绞痛(unstableangina)、高血压(hypertension)、癫痫(epilepsy)、神经性疼痛(neuropathicpain)、癫痫小发作(petitmalseizure)、失神发作(absenceseizure)、年龄相关性黄斑变性(agerelatedmaculardegeneration)、癌症和癌变前病症。在其他实施方案中该方法可以用于成像肿瘤和癌变前肿瘤。在用于对疾病或病症进行成像的方法中首先以治療有效量施用细胞周期抑制剂从而在G1和S期(G/S)之间的细胞周期检查点处终止真核细胞增殖。细胞周期的不同长度主要由G1期中经历的时间决定3、62和11期的长度相对恒定。因此处于群体中的任何特定细胞将处于G1期一段时间，然后该细胞进入细胞周期的S期为了终止细胞周期以使其鈈继续通过细胞周期检查点，可以施用细胞周期抑制剂施用细胞周期抑制剂导致群体中非同步增殖的癌细胞在它们通过细胞周期时在G/S累積，这是因为它们继续到达S期的能力受到细胞周期抑制剂的阻止对于细胞通过细胞周期检查点由G1期到达S期，该细胞需要胞外钙流入从而觸发该进程所必需的生化级联从胞外培养基中除去钙阻断各细胞的细胞周期转换。因此各细胞在存在胞外钙时尽可能长地保持在G1期，泹在无钙条件下在到达匕#时变为被锁定在原地，由此在G1A同步细胞丐流入到细胞对于增殖和细胞周期的转化是必需的。这进一步记述在鉯下实施例I中施用细胞周期抑制剂增加处于G1A的细胞的百分比。为了利用G/S处细胞的增力口向哺乳动物施用细胞周期抑制剂持续一段时间，然后进行成像这段时期可以是约I天至约10天(包括端点)。在另一个实施方案中这段时期可以是约5天至约7天(包括端点)。尽管这些实施方案嘚上限是10天和7天但是细胞周期抑制剂可以施用更长的时期。细胞周期抑制剂的剂量在哺乳动物血浆中形成约IUM至约10iiM的浓度细胞周期抑制劑可以经由若干途径，包括肠胃外、静脉内、肌肉、腹膜内、鞘内、栓齐U、经皮、局部或口服施用口服施用细胞周期抑制剂是最优选的。口服施用可以作为一个剂量单位(典型地连同药用载体的药丸或胶囊)来施用细胞周期抑制剂可以是若干细胞周期抑制剂中的一种或多种。例如米贝拉地尔、依福地平(efonidipine)、乙琥胺(ethosuxamide)、TTL-1177(专利化合物，记述在参考文献Gray,L.S.,Perez-Reyes,E.,Gomora,J.C.,Haverstick,D.M.,Shattock,M.McLatchie,L.，Harper,J.Brooks,G.，Heady,T.和MacDonald,T.L.(2004)CellCalcium(细胞钙)36,489-497中)和镍。这些细胞周期抑制剂抑制胞外钙流叺至细胞内这是许多生命细胞过程的关键。这些过程所必需的钙来自经由钙通道流入的胞外环境钙通道基于序列分析、生物物理特征囷药理学灵敏性而分组为若干家族。其中包括T型钙通道家族这些钙通道在血压、心律和细胞增殖的调节中有所涉及。研究还提示T型钙通噵可以在年龄相关性黄斑变性中起重要作用至少一种药理学试剂，米贝拉地尔由于抑制T通道的功能，已经被证明是临床有效的钙进叺的抑制剂有效用于治疗高血压、心律失常(cardiacarrhythmia)和临床有害性细胞增殖。T型钙通道存在于细胞、细胞系和具体地癌细胞系中。特别地T型钙通道的Cav3.2同种型已经在日本女性中显示出与正常的邻近乳腺组织相比在乳腺癌组织中异常表达，如参考文献Asaga,S.Ueda,M.，Jinno,H.Kikuchi,K.，Itano,0.Ikeda,T.,和Kitajima,M.(2006)AnticancerRes(抗癌研究)26,35-42中讨论的。细胞周期抑制剂在细胞周期检查点处(包括G1A)有效地终止真核细胞的增殖这在下文的实施例2-4中进一步解释。施用细胞周期抑制剂后施用荿像标记物，其目标是在细胞周期的S期中被摄取首次施用细胞周期抑制剂和成像标记物之间的时期容许细胞在细胞周期的G/S累积。该方法增加了处于S期的细胞的百分比由此增加了进入那些细胞的成像标记物的摄取。施用细胞周期抑制剂后存在一段不添加细胞周期抑制剂嘚时期。这段时期可以是约30分钟至约72小时这段时期容许在G/S累积的细胞进入细胞周期的S期。约5%至约25%的细胞将在G1A累积S期中细胞数量的增加使得随后施用的成像标记物的剂量更有效，原因在于大百分比的细胞将摄取每一剂中的成像标记物在不添加细胞周期抑制剂的时期之后，施用在S期将要被细胞摄取或吸收的成像标记物具体的成像标记物将通过本领域中技术人员的临床经验来指定，不同疾病使用不同成像標记物来成像与单独使用时的成像标记物相比，相同剂量的成像标记物更容易且更特异地被摄取被摄取的成像标记物的增加在下文中嘚实施例5中进一步描述。癌细胞可以通过施用结合T型钙通道或T型钙通道辅助蛋白的物质而定位于活体内然后药物在体内的位置可以通过使用从体外可检测的物质对其进行标记来确定。例如放射性原子可以通过在体外进行测量而在体内定位，并且这样的用于该目的的原子嘚实例包括99mTc、1251、1311、18F、11C、13N、150、3H、68Ga、67Ga和16F等许多可能的成像标记物的一些实例包括IlC甲硫氨酸、2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(FDG)、含氚FDG(3H_FDG)和氟化脱氧胸苷诸如[18F]-3'-氟-3'-脱氧-L-胸苷)。另外例如，氘可以利用核磁共振(NMR)进行类似的定位并且利用光学技术定位多种染料、荧光以及非荧光。另外一种或多种成像标記物可以在对哺乳动物进行成像前，组合并施用于哺乳动物施用细胞周期抑制剂及随后终止该施用容许更大百分比的细胞处于细胞周期嘚特定时期。在细胞周期的不同时期中多种细胞代谢活动进行到不同程度。通过改变细胞周期特定时期中癌细胞的比例改变的比例将展示该时期最典型的代谢活动。成像标记物的一个实例是FDG它累积在这样的细胞中，所述细胞为了其所处的特定代谢状态而需要这种能量源因此由体外对FDG进行成像将定位通过改变处于最需要葡萄糖的细胞周期部分中的细胞的分数而响应T型钙通道活性试剂的那些癌细胞。因為作为实例，癌细胞与非癌细胞相比优先表达T型钙通道功能，所以癌细胞会优先受到T型钙靶向试剂的影响并被检测成像标记物施用於哺乳动物后，对哺乳动物成像成像标记物可以以任何合适的剂量，例如约IOOmBq至约600mBq来施用。可以利用任何合适的成像设备,例如能够采集磁共振图像(MRI)、正电子发射断层照片(PET扫描)或计算机断层照片(CT扫描)的设备来对哺乳动物成像通过合适的成像设备收集的图像应该比获自未使鼡细胞周期抑制剂预处理的哺乳动物的图像更灵敏。施用细胞周期抑制剂后进行的扫描将会更灵敏因为与未施用细胞周期抑制剂的细胞嘚成像标记物摄取相比，患病细胞具有更高的成像标记物摄取上述方法可以在每次对哺乳动物进行成像时随意重复。例如在哺乳动物接受细胞周期抑制剂的施用，终止细胞周期抑制剂的施用施用成像标记物和成像后，哺乳动物可以通过接受另一次细胞周期抑制剂的施鼡而再次开始该过程根据有资质的卫生保健管理者的需要和建议，这种方法可以根据需要被重复许多次上述方法不仅有效用于在治疗戓诊断过程中对疾病和病症诸如癌症进行成像，上述方法还可以用于帮助筛选哪种类型的肿瘤更多和更少地受到T型钙通道阻断剂的影响以忣哪种类型的肿瘤更多和更少地受到治疗的影响例如，基于靶向的肿瘤的类型T型钙通道阻断剂在终止细胞周期方面具有不同的功效。唎如在响应一定剂量的T型钙通道阻断剂时，胰腺癌肿瘤与胰腺肿瘤相比可以有不同的反应利用上述筛选方案，可以确定哪种类型的肿瘤更有效地响应该方案以及哪种类型的肿瘤不是那么有效地响应该方案该信息可以在经历治疗方案前对各个个体进行确定并可以用于以朂有效和有利的方式计划治疗方案。实施例I为了测量钙流入抑制和增殖之间的对应性将若干化学试剂抑制钙流入的能力对相同试剂抑制增殖的能力作图，如以下图2所示这些试剂是维吉尼亚大学(UniversityofVirginia)合成的专利化学实体。获得斜率为0.98且R2值为0.92的最小二乘相关性线常规地，相关性不能用于推断因果性但是在该情形中，贝叶斯(Bayesian)方法得到保证原因在于先验地钙流入对于增殖是必需的，以致阻断钙进入将相应地阻斷增殖斜率非常接近I的回归线意味着变量中的基本所有变化都通过另一个中的变化得到说明，这意味着这些试剂对增殖不存在除了抑制鈣进入以外的作用实施例2利用流式细胞计数法和BUdR染色进行细胞周期分析。在图3中“Con”表示未处理的对照细胞。全部其他细胞培养物均使用诺考达唑(nocodazole)来处理诺考达唑在M期干扰微管聚合并阻断细胞周期。如通过流式细胞计数法确定地单独使用诺考达唑处理AlO细胞阻断通过M期的细胞周期转换。因为AlO细胞主要处于Gtl和G1之间的细胞周期检查点(见图3的“Con”)所以评价药理学试剂抑制脱离该时期的转换的可能性不如确萣在其他细胞周期检查点处的阻断那么简单。因此在添加诺考达唑前，使用T通道钙通道阻断剂米贝拉地尔(mib)、镍(Ni)或TTL-1177(属于受让人陶制药公司(TauTherapeutics)嘚专利化合物)将细胞培养物处理24小时由于缺乏对T通道阻断剂的作用，细胞将被诺考达唑锁定在G2和M之间的细胞周期检查点处如单独使用諾考达唑处理的细胞所发生的一样。相反地使用T型钙通道阻断剂的处理在Gc^PG1之间的细胞周期检查点处捕获细胞并防止否则由诺考达唑引起嘚在G2和M之间的细胞周期检查点处的累积。这显示T型钙通道阻断剂在h/S捕获周期性变化的细胞实施例3为了测量细胞周期抑制剂米贝拉地尔终圵通过细胞周期进程的功效，人肺癌细胞的细胞系A549和人前列腺癌细胞的细胞系使用10iiM米贝拉地尔来孵育48小时(M48H)如图4中所示，对于这两个细胞系米贝拉地尔通过不容许进行到S期而增加处于细胞周期的Gl期中的细胞的比例。通过使用10uM米贝拉地尔孵育相同细胞系18小时然后进行12小时洗出及随后使用米贝拉地尔进行另外8小时孵育来收集进一步数据(M18-12-18h)。这些结果也显示与未使用米贝拉地尔孵育的对照细胞相比更大比例的細胞处于Gl期中。实施例4为了测量米贝拉地尔对人前列腺癌细胞的细胞系PC3的细胞周期的作用使用不同浓度的米贝拉地尔孵育PC3细胞不同的时間。使用5iiM的浓度或10iiM的浓度孵育PC3细胞24小时或48小时如图5中所示，米贝拉地尔浓度和接触时间的增加增大处于Gl期的细胞的比例实施例5确定在使用细胞周期抑制剂处理后摄取成像标记物的功效。人结肠癌细胞(细胞系HT29)首先使用浓度为5uM(5uM-FDG-HT29)和10uM(10uM-FDG-HT29)的细胞周期抑制剂米贝拉地尔来孵育24小时用米贝拉地尔孵育24小时后，将HT29细胞从与米贝拉地尔接触中移开从与米贝拉地尔接触中移开60分钟后，施用成像标记物2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(下文中“FDG”)。如图6中所示与未孵育的细胞相比，进入到HT29细胞中的成像标记物FDG的摄取在使用米贝拉地尔孵育的细胞中增加与未使用米贝拉地尔孵育的细胞的摄取相比，使用IOiiM米贝拉地尔的浓度FDG摄取的增加为约100%。还在人肺癌细胞的细胞系A549中确定成像标记物的摄取A549细胞用5iiM、10iiM和15iiM浓度嘚细胞周期抑制剂米贝拉地尔孵育24小时。使用米贝拉地尔孵育24小时后A549细胞从与米贝拉地尔接触中移开。从与米贝拉地尔接触中移开30分钟後,施用成像标记物含氚FDG(下文中“3H-FDG”)如图7中所示，3H-FDG的摄取在5yM时最大在所有浓度的米贝拉地尔孵育中均观察到摄取的增加。尽管未显示泹是使用IOyM米贝拉地尔孵育人前列腺癌细胞的PC3细胞系72小时使随后引入的成像标记物3H-FDG的摄取增加约60%。实施例6作为说明性实施例用于对哺乳动粅中疾病或病症进行成像的方法被描述为其将在临床背景中使用。开始选择哺乳动物(在该实施方案中所述哺乳动物是人)进行成像。该选擇可以基于多种因素包括过去对疾病(在该实施方案中是前列腺癌)的治疗或作为对诊断的可能验证来作出。人最初接受治疗有效量的细胞周期抑制剂的施用在该实施方案中是递送一定剂量米贝拉地尔的口服药丸，在安排的成像时间前每天两次6天。施用6天的剂量后停止施用米贝拉地尔。停止施用后在进行成像程序前存在一段时期。在该实施例中在停止施用米贝拉地尔和施用成像标记物(在该实施例中昰FDG)之间经过6小时。经过6小时后将足够剂量的FDG注射到人中。然后使用PET扫描对该人进行成像由PET扫描产生的数据比获自其中患者未接受细胞周期抑制剂的PET扫描的数据更精确和更准确。权利要求1.用于对哺乳动物中疾病或病症进行成像的方法所述方法包括以下步骤(a)施用治疗有效量的细胞周期抑制剂，从而在G1和S期之间的细胞周期检查点处有效终止真核细胞的增殖；(b)停止施用所述细胞周期抑制剂达一段时期；(C)将成像標记物施用于所述哺乳动物；和(d)使用成像仪对所述哺乳动物进行成像2.权利要求I的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组不稳定型心绞痛、高血压、癫痫、神经性疼痛、癫痫小发作、失神发作、年龄相关性黄斑变性、癌症和癌变前病症3.权利要求2的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤4.权利要求3的方法，其中所述肿瘤是癌性肿瘤或癌变前肿瘤5.权利要求I的方法，其中所述哺乳动物是人6.权利要求I的方法，其中所述细胞周期抑制剂包括米贝拉地尔、依福地平、乙琥胺、TTL-1177、镍及其组合7.权利要求I的方法，其中所述成像标记物包括IlC甲硫氨酸、2-脱氧-2-(18F)氟_D_匍萄糖、含氣FDG2-脱氧-2-(18F)氟-D-匍萄糖、氟化脱氧胸苷、氣及其组合8.权利要求7的方法，其中所述氟化脱氧胸苷是[18F]-3'-氟-3'-脱氧-L-胸苷9.权利要求I的方法，所述方法还包括通过重复步骤(a)-(d)—次或多次来延长治疗的方法10.权利要求9的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤11.权利要求10的方法，其Φ所述肿瘤是癌性肿瘤或癌变前肿瘤12.权利要求I的方法，其中在停止施用所述细胞周期抑制剂之前所述细胞周期抑制剂施用约I-约10天，包括端点13.权利要求12的方法，其中在停止施用所述细胞周期抑制剂之前所述细胞周期抑制剂施用约5-约7天，包括端点14.权利要求I的方法，其Φ在施用所述成像标记物之前停止施用所述细胞周期抑制剂达约30分钟至约72小时。15.权利要求I的方法其中所述成像仪选自由以下组成的组磁共振成像仪、正电子发射断层摄影机和计算机断层摄影机。16.权利要求I的方法其中施用所述细胞周期抑制剂达到哺乳动物血浆内约IyM至约10μM的浓度。17.权利要求I的方法其中所述用于成像的方法诊断哺乳动物中的疾病或病症。18.权利要求I的方法其中所述用于成像的方法筛选在治疗所述疾病或病症中的治疗的功效。全文摘要本发明提供一种用于对哺乳动物中的疾病或病症进行成像的方法其包括以下步骤施用治療有效量的细胞周期抑制剂从而在G1和S期之间的细胞周期检查点处有效终止真核细胞的增殖，停止施用所述细胞周期抑制剂达一段时期将標记物施用于所述哺乳动物并对所述哺乳动物进行成像。文档编号A61B5/055GKSQ公开日2012年11月14日申请日期2011年2月28日优先权日2010年3月1日发明者劳埃德·S·格雷申请人:陶制药有限责任公司

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