【摘要】：本研究对HIV-1gag、env和pol基因的序列变异特征进行分析,以了解研究人群的HIV-1亚型流行,gag、env和pol基因准种变异,gag基因抗原表位变异,env基因序列变异和pol基因耐药性突变等情况,进一步探索HIV-1的gag、env和pol基因变异特征,为HIV-1基因变异与流行和艾滋病疾病进展基础研究提供参考数据。 本研究采集60份山西省某县经过抗病毒治疗的既往献血者的HIV-1阳性全血样本,主要研究gag基因的p17-p24、env基因的V3～V5和pol基因的PR-RT区段。使用巢式PCR成功扩增并测序获得45份gag、39份env和47份pol基因PCR序列。将巢式PCR纯化产物连接T载体构建重组克隆,随机挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定并测序。获得相应样本的克隆序列：gag基因为827份、env基因为798份、pol基因为812份。 通过对45份gag基因PCR序列的系统进化树进行分析,发现除1份与07BC重组型参考株聚集以外,其他均与.RL42和B.TH.92TH014C_g等参考株聚集；再经过计算基因离散率和基因同源性,发现结果与进化树分析一致,说明本研究样本人群HIV-1感染亚型主要为B’亚型。分别计算各样本gag、env和pol基因克隆序列的基因离散率和熵值,并使用SPSS13.0软件进行统计学分析,发现这三段基因片段的准种变异程度各不相同。对三段基因均成功扩增的29份样本进行分析,发现同一样本内三段基因的准种变异有显著性差异(P=0.02；P=0.033)。再对两两基因进行比较,结果显示env和gag、pol之间准种变异存在显著性差异,gag和pol之间准种变异无显著性差异。通过计算ds/dn对选择压力进行分析,结果表明gag、pol基因均受到负向选择压力；env基因V3区主要受到正向选择压力,说明V3区受到为逃避中和抗体识别而驱动的选择压力。 根据已发现的我国常见HLAI类基因分布类型和已发表的HIV-1CTL抗原表位,我们选取了8个CTL抗原表位对本研究中gag基因抗原表位变异情况进行分析。发现共有4个表位发生突变,其中p17区段的3个表位中有8个突变位点,p24区段的1个表位中有1个突变位点,同时在克隆序列中发现p24区抗原表位的少数突变。结果说明p24区的抗原表位比p17区保守,并在准种中存在着p24区抗原表位的少数变异。 本研究中主要发现6种V3环顶端四肽形式：GPGR、GPGQ、GQGR、GPGA、 GLGR和GPGK,另外在克隆中发现4种低频率的四肽形式：GPGL、GPGG、RPGR和GPAR,说明V3环顶端四肽形式在准种中变异不大,提示我们该样本地区经过10多年的HIV-1流行,V3环顶端四肽形式比较稳定。使用网上工具Geno2pheno [co-receptor]对39份env基因PCR序列辅助受体使用情况进行预测,预测结果显示使用CCR5辅助受体为27份(69.23%),使用CXCR4辅助受体为12份(30.77%)。根据预测结果将env基因序列分为CCR5和CXCR4两组,对env基因N-糖基化位点进行分析,发现两组间有9个位点分布存在显著性差异：在R5组中N300位显著高于X4组,说明这个位点可能是R5毒株的特征性糖基化位点；R5组中显著高于X4组的位点有位于V4区的386、396、398和V5区的460、461位；X4组显著高于R5组的有位于C3区的362和V4区的398、413位。结果显示本研究中R5毒株和X4毒株的N-糖基化模式存在差异。另外,env基因中N-糖基化位点均有不同程度的丢失,其中与中和抗体2G12表位识别有关的位点丢失率均不高：N295(17.95%)、N332(2.56%)和N392(2.56%),说明该中和表位较为保守 通过使用斯坦福大学HIV耐药数据库对pol基因序列进行耐药性分析,发现PIs耐药性突变位点28个,其中在克隆序列中发现主要耐药性突变位点4个：N88D、L76V、N88S和150V；发现6份PCR序列表现出对1种或多种RTIs具有耐药性,并在31份(含前6份)样本的克隆序列中均发现RTIs耐药性突变。只在克隆序列中发现的PIs.NRTIs.NNRTIs耐药性突变位点,分别占其总数的89.29%、72.72%和50.00%,并且它们的发生频率均较低：PIs耐药性突变率在0.12～6.47%之间；NRTIs耐药性突变率在0.12～0.47%之间；NNRTIs耐药性突变率在0.12-1.86%之间。本研究中出现频率最高的NRTIs耐药性突变为M41L(1.98%)、T215Y(1.98%)、M184V(1.63%)和L210W(1.16%); (1.63%)、G190A(1.28%)、和K103E(0.35%)。耐药性分析结果显示该地区发现的耐药性突变主要对治疗方案AZT/DDI/NVP产生耐药性,部分样本人群已经对现行的治疗方案产生了耐药性(12.77%),并在体内存在着大量的低频率耐药性突变位点,提示有必要对上述抗病毒治疗人群开展耐药性检测。

【学位授予单位】：四川农业大学
【学位授予年份】：2012

virus，HIV-1)的结构蛋白gag基因、外膜糖蛋白gp120基因及gag-gp120嵌合基因克隆到含CaMV35S启动子控制下的植物表达载体中，构建了七种植物表达载体，pBI131SP1、pBI121P1、pBI121AP1、pBI121gag、pBI121gp120、pBI121gag-gp120和pBI131Sgp120，利用改进的冻融法将其导入农杆菌LBA4404和EHA105，构建了植物双元表达载体，为利用基因枪和农杆菌转化玉米、番茄提供了载体系统。以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料，诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织，以其Ⅱ型胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法和基因枪轰击法将FMDV的P1基因转化玉米，获得抗 

自 1 992年Mason等[1] 首次提出用植物生产可食性疫苗以来 ,利用转基因植物表达的疫苗和功能蛋白达 1 0 0种以上。番茄作为生物反应器生产口服疫苗 ,得到了人们的广泛关注 ,国内外对此进行了大量的研究工作 ,取得了一定的研究成果[2～ 4] 。艾滋病 (acquiredimmunodeficiencysyndrome ,AIDS)是当今危害人类健康和生命最严重的传染病之一 ,其病原体是人免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirus,HIV)。HIV 1是艾滋病的主要病原 ,其gag基因编码病毒的核心蛋白 ,含有诱导机体体液免疫和细胞免疫的主要抗原决定簇 ,能诱导机体产生中和抗体和抗病毒免疫保护 ,而gp1 2 0基因编码病毒的外膜蛋白 ,与CD4+ 分子有高度亲和性 ,在艾滋病的预防和治疗起着至关重要的辅助作用。1

艾滋病痴呆综合征(AIDS dementia complex,ADC)是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的并发症之一,常出现在HIV感染的晚期。主要表现为运动和认知功能障碍,如运动迟缓、共济失调,感情淡漠等〔1〕。高效抗逆转录病毒治疗(highly ac-tive anti-retroviral therapy,HAART)使艾滋病痴呆综合征的发病率有所下降,但尚不能完全预防或逆转艾滋病痴呆综合征的发生,并且随着HIV感染者的增多及感染者寿命的延长〔2〕,艾滋病痴呆综合征的患病率逐年上升〔3〕。迄今为止,艾滋病痴呆综合征的发病机制仍然不是很清楚,但可以肯定的是存在神经细胞损伤,而造成神经细胞损伤的因子有很多,如病毒蛋白、炎性因子等。为了解HIV包膜糖蛋白gp120在艾滋病痴呆综合征发生发展中的作用,对gp120在艾滋病痴呆综合征发病中的作用作一综述。1神经系统中gp120受体HIV病毒要侵入神经细胞,首先需要其包膜糖蛋白gp120... 

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种烈性家畜传染病,为了制备安全、有效的新型基因工程疫苗,人们积极探索FMDV转基因植物的研究,研究结果表明用植物表达系统生产安全有效的口蹄疫口服疫苗是完全可行的。本实验室已构建了FMDV P1全长基因的高效植物表达载体并用于转化马铃薯。本研究在此基础上,寻找影响口蹄疫基因在马铃薯中高效表达的主要因子,对抗性筛选标记和抑制剂进行浓度筛选试验,对不同的马铃薯品种材料确定适宜的预培养时间、农杆菌载体、农杆菌菌液浓度及侵染时间,建立了比较完善的遗传转化体系。通过农杆菌介导法与基因枪法对2 个马铃薯品种和3 种马铃薯外植体进行遗传转化,对获得的抗性苗应用PCR、PCR-Southern、Southern杂交、斑点杂交等技术进行检测,得到了转目的基因马铃薯阳性植株,表明已将FMDV P1 全长基因导入马铃薯中。对阳性植株进行SDS-PAGE 实验,初步推断FMDV P1 全长基因在马铃薯中进...  (本文共105页)  |

近20年来,艾滋病(AIDS)在全世界范围内广泛流行。由于艾滋病患者免疫功能下降导致机体抵抗力降低,艾滋病病人并发结核病(TB)成为最常见的机会性感染。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌,它在机体内的主要宿主细胞是巨噬细胞[1-3],巨噬细胞在结核分枝杆菌与宿主相互作用中具有重要作用,结核分枝杆菌的感染与巨噬细胞初期的应答反应密切相关。由于细菌能逃离活化巨噬细胞的抗微生物作用,结核分枝杆菌能在巨噬细胞内长期生长和繁殖[4]。巨噬细胞被活化后产生的NO与其细胞抗分枝杆菌活性密切相关。但是,巨噬细胞能够抵抗HIV,在细胞病变作用不会迅速死亡,成为HIV病毒持续复制的存贮器[5-7],使病毒扩散。gp120是HIV病毒的包膜蛋白,在HIV病毒侵入靶细胞时非特异性地激活宿主的免疫细胞,增强HIV对人体的危害。本文通过体外实验研究,通过比较卡介苗、gp120分别及共同感染人巨噬细胞,诱导巨噬细胞产生... 

第一部分:TEA和4-AP敏感型钾通道参与由gp120引起的海马神经元的凋亡虽然HIV病毒壳蛋白gp120对神经元的损伤作用在HIV相关性痴呆(HIV-associated demential,HAD)发展的过程中起到重要作用,但致其损伤的作用靶点仍未明确。因此,明确gp120引起中枢神经系统神经元损伤的作用靶点对于HAD的防治显得尤为重要。近期有报道称,钾通道可能是引起HAD的又一靶点,因为持续性的钾离子外流会引起细胞凋亡。因而,该实验中,通过运用全细胞膜片钳的实验方法,我们发现gp120能显著引起外向钾电流的增高,且呈明显的浓度依赖性。实验进一步表明,TEA和4-AP敏感型钾通道均参与gp120引起的钾电流增大,这一结果与MTT和TUNEL实验中,TEA和4-AP能有效阻断gp120引起海马神经元的毒性一致。以上结果表明:gp120引起TEA和4-AP敏感型钾电流的增大,促发钾离子的外流,最终导致神经元的凋亡。第二部分:4-...