您还可以使用以下方式登录
当前位置：&>&&>&&>& > 耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的替加环素MIC药敏试验和临床特点分析
耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的替加环素MIC药敏试验和临床特点分析
【摘要】 目的：应用微量肉汤稀释法（MIC）药敏试验测定耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率，并分析耐药菌的临床特点。方法：搜集2014年11月-2016年4月本院微生物室从不同病区各种临床标本分离的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌38株（CRKP），应用微量肉汤稀释法进行替加环素药敏试验，从患者年龄、性别、标本类型、原发病、抗生素使用情况等方面对比，分析临床特点与替加环素耐药的相关性。结果：在38株CRKP中筛选到6耐替加环素耐药菌，耐药率为15.8%。耐药性与患者年龄有关（P0.05）。结论：耐替加环素的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌已经出现，耐药株多见于老年患者。
　　【关键词】 肺炎克雷伯菌； 耐碳青霉烯； 替加环素 　　MIC Antimicrobial Susceptibility Test to Tigecycline and Clinical Analysis of Carbapenem Resistant Klebsiella Pneumoniae/ZHENG Ya-qing，CHEN Dong-jie，LI Hong-ru，et al.//Medical Innovation of China，）：028-031 　　【Abstract】 Objective：To study the drug resistance rate of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae to Tigecycline by using broth Microdilution Method（MIC）.Method：From November 2014 to April 2016 ward room microorganisms isolated from different clinical samples by carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae 38 strains （CRKP） were collected in our hospital，the application of micro broth dilution method of Tigecycline susceptibility test，the age and sex of the patients， specimen type， primary disease， antibiotic use and other aspects were compared，the clinical features and add ring correlation resistance were analysed.Result：In 38 strains of CRKP，the resistance to Tigecycline were 6 strains，and the drug resistance rate was about 15.8%.Drug resistance was associated with patient age（P0.05）.Conclusion：The carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae to Tigecycline has been found，and the resistant strains are more common in elderly patients. 　　【Key words】 Klebsiella pneumoniae； Carbapenem resistant； Tigecycline 　　First-author’s address：Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University，Fuzhou 350000，China 　　doi：10.3969/j.issn.17.16.008 　　替加?h素是新上市的甘氨酰环素类抗生素，是临床治疗耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）感染的首选药物[1]。但是对替加环素和碳青酶烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌（Tigecycline resistant Klebsiella pneumoniae，TRKP）感染病例有逐年上升趋势，且该耐药菌在院内传播和爆发的形势越来越严峻[2]。TRKP的出现可能使CRKP感染陷入无药可用的困境，严重威胁CRKP感染患者的预后[3]。因此，临床上监测CRKP的替加环素药敏情况，有助于为临床治疗该耐药菌感染提供重要的理论参考，可为早期有效治疗CRKP提供极为有效的帮助，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌株来源 搜集2014年11月-2016年4月本院微生物室从不同病区各种临床标本培养出的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯38株。标本类型包括：血液、痰、尿液、伤口分泌物、导管末端、肺泡灌洗液、胆汁、鼻腔分泌物、穿刺液、肝脓肿引流液、腹水、胸水等。标本2 h内送检，采用常规细菌分离培养方法，鉴定细菌，所有菌株均应用法国生物梅里埃公司的VlTEK2-compact全自动细菌分析仪进行细菌鉴定及药敏分析，测定最低抑菌浓度（MIC），质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603。 　　1.2 纳入与排除标准 （1）纳入标准：耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌：根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2016年版标准（CLSIM100-S26）[4]，厄他培南≤18 mm、亚胺培南和美罗培南的抑菌圈直径≤19 mm判断为耐药或VITEK-2药敏显示这三种抗生素中介/耐药，需进行手工法确认。美罗培南、亚胺培南或厄他培南三者中，至少对其中之一耐药的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。（2）排除标准：剔除重复标本，剔除药敏实验鉴定为非耐碳青霉烯类，即剔除对除厄他培南、亚胺培南和美罗培南三种之外的一种或多种抗生素耐药或全敏感的菌株。
　　1.3 主要仪器设备 VlTEK2-compect全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司），替加环素（Selleck公司），96孔板（Nunc公司），MH肉汤（上海嘉楚生物工程有限公司），VITEK2细菌鉴定卡（法国生物梅里埃公司）。 　　1.4 方法 微量肉汤稀释法药敏试验具体如下。 　　1.4.1 菌悬液的制备 （1）菌液培养：取冷冻纸片法保存的待测菌种接种于血平板培养基，置35 ℃温箱静止培养16～18 h；（2）配置标准浓度菌液：取血平板上肉眼可见的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌落1个，溶于3～4 mL麦氏标准管，比浊仪上调整至0.5麦氏浊度，此时细菌浓度相当于（1～2）×108 cfu/mL，制成待测菌液；（3）上样菌液稀释：将待测菌液在步骤（2）所得稀释倍数的基础上用MH肉汤再稀释1000倍，此时菌液浓度为（1～2）×105 cfu/mL即为待测菌悬液。注意：测定麦氏浊度所需菌液应在生物安全柜中无菌取样，剩余菌液还需实验，接种于血平板上检测待测菌纯度。 　　1.4.2 抗菌药物的制备 抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要?h远大于R值，至少160倍），取替加环素药粉（有效浓度>99%）12.7 mg，溶于5 mL MH肉汤中，配置成抗生素母液浓度2560 μg/mL，分装于无菌小管置-20 ℃备用。 　　1.4.3 微量肉汤稀释法MIC操作 （1）将待测抗菌药物用MH肉汤进行10倍稀释；（2）无菌96孔板第2～11列加入灭菌MH肉汤100 μL（一药一板）；（3）无菌96孔板第1列加入10倍稀释的药液200 μL，逐次倍比稀释至第11列（每孔液体终体积是100 μL）；（4）无菌96孔板的每一孔加入待测菌液100 μL，每孔液体终体积是200 μL（由于整板都是一种药物，所以96孔板的每一行可进行一种细菌的药敏试验，为了保证实验的可靠性，每株菌进行一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株细菌的药敏试验），此时96孔板上抗生素浓度从1到11孔分别是128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L；（5）无菌96孔板的第12列上4孔加入200 μL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照，第12列下4孔加入200 μL/孔菌液（四株菌的菌液）作为阳性对照；（6）药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置35 ℃温箱培养18～22 h观察结果，结果参照2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准。注意：无菌操作。 　　1.5 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，连续数值变量数据采用（mean±SD）表达，计量资料采用t检验（正态分布）或秩和检验（非正态分布），计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 替加环素微量肉汤稀释法药敏结果 38株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯对替加环素的微量肉汤稀释法药敏检测（MIC）结果根据EUTAST标准判断（替加环素MICs≤1 mg/L为敏感，2 mg/L为中介值，替加环素MICs>2 mg/L为耐药），获得6株替加环素耐药的TRKP，耐药率15.79%，这6株对碳青霉烯类抗生素及替加环素均耐药，余32株为非耐药株，对替加环素敏感，对碳青酶烯类抗生素仍耐药；替加环素MICs在1～2 mg/L浓度的敏感菌最多，为25株，占65.79%，见图1。 　　图1 替加环素微量肉汤稀释法药敏结果 　　2.2 一般情况 耐替加环素肺炎克雷伯菌组（TRKP组）患者年龄均≥65岁，非耐替加环素组（CRKP组）≥65岁占18.75%，原发病为肺部感染，送检标本为痰的占3例，其中4例在标本送检前有抗生素使用病史，见表1。 　　3 讨论 　　因对碳青酶烯类耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP）对头孢类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类抗生素也显示出高度耐药[5]，所以一旦出现碳青酶烯类抗生素耐药，能选择使用的抗生素便十分有限。替加环素于2012年上市，属于甘氨酰环类抗生素，通过与细菌30S核糖体强有力的结合，阻止细菌蛋白质合成而发挥抗菌作用，是耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌治疗的主要药物[6]。替加环素具有抗菌活力强、抗菌谱广、耐药率低的特点，因此被广泛应用于临床对抗重症感染[7]。若CRKP同时又对替加环素耐药，那么可能面临无药可用的危险境地，遗憾的是自2007年第一例替加环素耐药病例被报道以来，这样的菌株不断出现[8-11]。 　　3.1 耐替加环素肺炎克雷伯菌（TRKP）一般情况分析 本研究得到的6株耐替加环素的耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌均为>65岁的老年患者，标本来源3例为痰，1例为尿，1例为血液，还有1例为肺泡灌洗液；送检标本前有抗生素使用史的有4例；6例中原发病为肺部感染的有3例，均有抗生素使用史。参考P值，认为替加环素耐药与患者年龄有关，与抗生素使用史无关，而林佩贤等[12]认为，肺炎克雷伯菌的替加环素耐药与患者年龄及抗生素使用情况有关。因标本数较少，期待进一步增加例数，分析耐药菌的临床特点和相关危险因素。 　　3.2 替加环素的药敏结果 本院仪器法测定肺炎克雷伯对碳青酶烯类抗生素耐药时会进行米诺环素和/或替加环素的药敏测定，但是在38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）中仪器法仅2例阳性，王辉等[13]认为肺炎克雷伯菌的替加环素仪器法药敏试验不够准确，对替加环素的药敏试验尚无标准化试验操作方法，微量肉汤稀释法MIC是专家共识的推荐方法。本研究利用微量肉汤稀释法测定CRKP对替加环素的耐药性，得到6株耐药株，耐药率为15.79%，接近Roy等[14]试验的耐药率11.2%。与张晓玲等[15]进行的琼脂稀释法试验的耐药率不同，肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药多与外排泵机制有关[16-17]。 　　针对6株耐药株，如果期待寻找治疗的办法，可以尝试抗生素联合应用或加用外排泵抑制剂或竞争底物。叶荣夏[18]利用磷霉素联合替加环素可以提高MIC50/90的敏感率，赵金云等[19]在药敏试验体系中加入外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP），沈晓强等[20]加入外排泵抑制剂1-（1-萘甲基）哌嗪（NMP），认为都可以提高细菌对替加环素的药物敏感度，但He等[21]认为CCCP无效、NMP有效。这些研究多是体外细菌试验，例数不多，不能很好地体现应用于人体时的治疗效果，对人机体的影响也尚不清楚。所以临床应用还需要进一步探索。目前可行且重要的方法仍是针对致病菌选择合理抗生素使用，减少细菌耐药产生。
　　综上所述，本研究认为耐替加环素的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌已经出现，耐药株多见于老年患者。 　　参考文献 　　[1]钟雪，陈东科，许宏涛，等.替加环素研究新进展[J].中国抗生素杂志，）：870-875. 　　[2]陈子??，陈方慧.临床常见病原菌对替加环素耐药机制研究进展[J].中国现代应用药学，）：. 　　[3]方乐，胡江，陈敬银，等.年887株鲍曼不动杆菌的临床感染分布及耐药分析[J].现代预防医学，）：. 　　[4]张雅薇，王辉.2016年CLSIM100S（第26版）主要更新内容解读[J].中华检验医学杂志，）：165-169. 　　[5]宋珈.64例替加环素耐药肺炎克雷伯杆菌感染临床分析[D].杭州：浙江大学，2015. 　　[6]张翼霞，赵春江，刘文云等.替加环素对鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌体外抗菌活性检测的影响因素和方法学评估[J].中华检验医学杂志，）：604-609. 　　[7]张召，翟所迪，单爱莲.替加环素的药代动力学/药效学评价和剂量选择研究现状[J].中国临床药理学杂志，）：. 　　[8] Keeney D，Ruzin A，Bradford P A.RamA，a transcriptional regulator，and AcrAB ，an RND-type efflux pump，are associated with decreased susceptibility to tigecycline in Enterobacter cloacae[J].Microb Drug Resisist，）：1-6. 　　[9] Arya S C，Agarwal N.Emergence of tigecycline resisetance amongst multi-drug resistant gram negative isolates in a multi-disciplinaty hospital[J].J Infect，）：358-359. 　　[10] Hou P F，Chen X Y，Yan G F，et al.Study of the correlation of imipenem resistance with efflux pumps AdeABC，AdeIJK，AdeDE and AbeM in clinical isolates of acinetobacter baumannii[J].Chemotherapy，）：152-158. 　　[11]?⒑烨桑?苏建荣.多重耐药鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药机制研究[J].临床和试验医学杂志，）：. 　　[12]林佩贤，黄宝添，许斐斐，等.重症监护室多重耐药菌医院感染临床特点与耐药性分析[J].国际流行病学杂志，）：228-231. 　　[13]王辉，俞云松，王明贵，等.替加环素体外药敏试验操作规程专家共识[J].中华检验医学杂志，）：584-587. 　　[14] Roy S，Datta S，Viswanathan R，et al.Tigecycline susceptibility in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli causing neonatal septicaemia （2007-10） and role of an efflux pump in tigecycline non-susceptibility[J].J Antimicrobial Chemotherapy，）：. 　　[15]张晓玲，霍丽静，刘鹏，等.秦皇岛市替加环素对耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌体外抗菌活性研究[J].河北医药，）：767-769. 　　[16] Zhang X Y，Tan X Y，Li D L，et al.Outbreakandcontrol of hospital infection of Pandrug-resistant Klebsiella pneumonia in ICU[J].Clin J Nosocomiol，）：79-80. 　　[17]盛滋科，郭庆兰，王维霞，等.肺炎克雷伯对替加环素的敏感性和外排泵相关耐药机制研究[C].中华医学会第八次全国中青年检验医学学术会议. 　　[18]叶荣夏.磷霉素与替加环素对产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的联合药敏研究[D].杭州：浙江大学，2014. 　　[19]赵金云，许文芳，金法祥，等.acrAB外排泵对肺炎克雷伯菌耐环丙沙星作用的研究[J].中华医院感染学杂志，）：. 　　[20]沈晓强，陈琼，周华，等.耐药结节细胞分化超家族外排泵介导碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对替加环素耐药机制的研究[J].中华临床感染病杂志，）：387-392. 　　[21] He F，Fu Y，Chen Q，et al.Tigecycline susceptibility and the role of efflux pumps in tigecycline resistance in KPC-producing Klebsiella pneumoniae[J].PLoS One，）：e0 119 064. 　　（收稿日期：） （本文编辑：周亚杰）
欢迎转载：
相关推荐：抑菌试验_百度百科
清除历史记录关闭
声明：百科词条人人可编辑，词条创建和修改均免费，绝不存在官方及代理商付费代编，请勿上当受骗。
用于测定体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
抑菌试验常用方法
抑菌试验常量肉汤稀释法
A、抗菌药物贮存液制备
1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
B、用抗菌药物浓度范围
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。及在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。菌使用HTM肉汤，和其它使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用挑取形态相似待检3-5个，接种于4-5ml的（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如、淋病奈瑟菌和链球菌及耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的，并取一份接种物在非选择性平板上，以检查接种物纯度。
注：在临床微生物学检验中，麦氏常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5时，相当于1.5×108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。
E、附：0.5麦氏比浊管配制方法
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。
有效期为6个月。
F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐葡萄球菌和应持续孵育满24h。
H、结果判断与解释
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查的情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。
抑菌试验微量肉汤稀释法
A、抗菌药物和培养基制备
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
B、MIC板制备
1.2.2.MIC板制备 ，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试验，时，孵育时间为20~24h，试验葡萄球菌和对和的时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、结果判断
1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个（1孔或2倍）。
抑菌试验琼脂稀释法
稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
B、培养基制备
2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验时，使用溶解的马血）。
C、含药平板制备
2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
D、制备与接种
2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（耐药葡萄球菌、耐药孵育时间应满24h），观察结果。、细菌置5%二氧化碳、置微需氧环境中孵育。
E、结果判断
2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含或琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
抑菌试验纸片扩散法
纸片扩散法(K-B法)又称
K-B法药敏试验时配制有两种方法。
第一种是肉汤增菌法（对数生长法），是用接环挑取3-5个细菌入肉汤增菌管中进行增菌4-6小时，然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培养物进行稀释校正使其浓度达到0.5麦氏比浊标准（因为经过增菌培养其培养物浓度一般都高于此标准）。
第二种方法是直接菌落法：从孵育18-24小时的非上，挑取3-5菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和）和潜在的对耐药的葡萄球菌的推荐方法。
将菌制成菌悬液用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液 ,涂布整个M2H平板表面 ,反复 3 次 ,每次将平板旋转60 度 ,保证涂布均匀 ,35 ℃培养后菌落呈状态 ,否则影响药敏结果。
K-B 法指定用 M-H平板 ,应用直径90cm平皿 ,在水平的无菌台上倾倒 ,准确量取高压灭菌后的M2H琼脂液25ml ,使之琼脂板厚度为 4mm。否则厚度过高 ,使含药物纸片的药物半球形扩散的体积加大 ,导致假耐药;反之导致假敏感。
要求纸片直径 6.00～6.35mm每片吸水量约012 μl ,纸片的药物含量必须与 K 2B 法规定的
一致 ,用前必须做质量鉴定 ,质量合格方可使用。纸片的保存尤为重要 ,一般要求保存在有干燥剂的容器内 ,纸片取出后须放室温10min后方可打开 ,否则空气中的水份冷凝在纸片上易 ,使药物失效影响药敏试验结果。
抑菌试验E试验
E试验是指，其原理基本同扩散法，即浓度呈的抗菌药物从塑料试条中向中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。
A、培养基、菌液制备和接种
3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。
B、贴E试验条
3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。
C、孵育时间和温度
3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。
D、结果阅读
3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。
于爱莲主编．医学微生物学实验指导． 北京市：人民卫生出版社，2010.08：50-200
清除历史记录关闭何苗& 陈红斌& 刘衡
　　(大理学院云南省药用昆虫工程实验室& 云南大理& 671000)
　　【摘要】本文用改良的MTT 96孔板微量二倍稀释法测定大黄游离蒽醌对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用。
　　【关键词】MTT& 大黄& 痤疮丙酸杆菌& 抑菌
　　【中图分类号】R96&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文献标识码】A&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文章编号】（6-01
　　痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，也称痤疮杆菌，是造成青春痘的主要细菌。其是一种革兰染色阳性的兼性厌氧短杆菌，细胞内寄生，属于皮肤的正常菌群，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中。随着青少年的发育成熟，毛囊口出现角栓，皮脂腺分泌功能也明显增加，因皮脂含有较多脂肪酸等成分，适合其生长及繁殖，从而成为痤疮最主要的病因之一。本文旨于用一种改良的新方法测定大黄对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用。
　　1& 试剂与材料
　　1.1试验药物
　　大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素(江苏淮安市巍伟植化研究所)、大黄总游离蒽醌(自制)；乳糖酸红霉素(大连美罗大药厂)，克林霉素(北京四环科宝制药有限公司)，青霉素钠(华北制药有限公司)，氯化三苯四氮唑(TTC，上海试剂三厂)。
　　1.2试验菌株&
　　痤疮丙酸杆菌标准菌株(复旦大学医学院病原生物室)。
　　1.3仪器及试剂&
　　生化培养箱、96孔板、光学显微镜(Olympus)、可调式移液枪、硫乙醇酸盐培养基(卫生部上海生物制品研究所)。
　　1.4方法
　　1.4.1培养基及供试药液的制备
　　硫乙醇酸盐培养基：按说明书方法配制，调pH值为7左右。将培养基密封后经121℃高压灭菌30min，冷却后，置于冰箱中(4℃)保存备用。在上述培养基基础上添加1.5%的琼脂灭菌，自然冷却，待培养基温度降到45～50℃左右的时候，以无菌操作按10%加入7%无菌脱纤维兔血于培养基中，轻轻摇匀，置于冰箱中(4℃)保存备用。大黄游离蒽醌供试药液配制：分别称取一定量的游离蒽醌，以DMF作为溶剂，在超净台上用二倍稀释法将各药物配成0.1～6.4mg/mL浓度的供试药液，密封，常温贮存备用。阳性药物：称取乳糖酸红霉素、克林霉素、青霉素同法在超净台下取一定量的药物用无菌水配制药物溶液。
　　1.4.2菌悬液的制备
　　将痤疮丙酸杆菌菌株接种培养增菌，用液体石蜡隔绝空气，于37℃培养箱中培养，取活化18h的上述菌液适量，用培养基稀释，将浊度调整到0.5麦氏比浊标准(约为1.5&108CFU/mL)，再用培养基稀释，用血球计数板将悬液调整到1&107～5&107CFU/mL，作为痤疮丙酸杆菌悬液，备用。
　　1.4.3药敏试验&
　　将供试药液进行一定梯度的稀释，用移液枪将10&L不同浓度的供试药液分别加入96孔微量板中；阴性对照为DMF；空白对照为液体培养基。均再加入180&L的液体培养基，10&L菌悬液，每孔总体积为200&L，最后用10&L的液体石蜡隔绝空气，在规定的温度下在普通培养箱中培养18～24h，观察结果。
　　1.5最低抑菌浓度(MIC)的评定
　　由于丙酸杆菌属的细菌在代谢发酵过程中能产生大量有机酸[1]，一般使用甲基橙来判定丙酸杆菌是否生长。在本研究中，改用氯化三苯四氮唑(TTC)辅助观察96孔板中痤疮丙酸杆菌的生长情况&&TTC试验阳性结果(产生红色)，则说明药敏实验管的痤疮丙酸杆菌生长良好；阴性结果(无色)，则说明药敏试验管中痤疮丙酸杆菌的生长代谢受到抑制，即药敏试验管中的药物浓度达到MIC或MIC以上，比甲基橙更直观、准确。将96孔板在规定的温度下培养18～24h后，每孔加入0.25% TTC 5&L，继续培养2h。重复6次。用肉眼和倒置显微镜观察培养孔，呈现红色为有细菌生长，在阴性对照和空白对照的前提下，判断供试样品是否具有抗菌活性。记录结果。
　　2& 试验结果&
　　所有空白对照和阴性对照孔均呈现红色，说明药物溶剂1%DMF溶液无干扰，不影响试验结果。乳糖酸红霉素、克林霉素、青霉素对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.02&g/mL、0.01&g/mL及0.01&g/mL，均在CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准范围内[2]，说明该试验方法具有可靠性。
　　在大黄的五种游离蒽醌中，大黄素对痤疮丙酸杆菌的抑制作用最强，其MIC为8&g/mL，大黄酸和游离蒽醌的MIC为32&g/mL，芦荟大黄素的MIC为16&g/mL，大黄酚和大黄素甲醚在供试浓度范围内没有抑菌活性，见表1。
　　表1& 游离蒽醌作用下痤疮丙酸杆菌的生长情况
　　注：&-&表示细菌不生长，&+&表示细菌生长
　　3& 讨论
　　用氯化三苯四氮唑(TTC)判定MIC，原理为TTC可被活菌细胞内的琥珀酸脱氢酶等呼吸酶，还原成不溶性的红色甲赞颗粒，使活菌落呈现红色[3], 从而可以准确地鉴别菌体细胞活性。鉴于在常规操作下，中药天然产物实际已不能完全准确地反映样品的抑菌能力，本研究采用TTC对菌体染色，鉴别菌体细胞活性，以不能显色的指示菌范围来判读抑菌效果，保证了试验结果的准确性和可靠性。
　　本研究采用改良96孔板微量二倍稀释法并首次建立了一种新的兼性厌氧菌培养方法，用石蜡隔绝空气，比用常规厌氧罐培养方法更为简便和直观，仅需要常规培养设备，故具有一定的创新性和可推广性，但目前该方法的可靠性还有待于进一步的证实和研究。
　　参考文献
　　[1]陈劲春,王立仁,李一等.丙酸杆菌的分离与初步鉴定[J].北京化工大学学报,): 8-10.
　　[2] Clinical and Laboratory Standards Institute：Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing
　　[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科学技术出版社,1979.
您可能感兴趣的其他文章
&&站长推荐
&&期刊推荐
&&原创来稿文章
&&网络读者服务
转寄给朋友
朋友的昵称:
朋友的邮件地址:
您的邮件地址:
写信给编辑
您的邮件地址:}