1.1 电镜细胞化学的种类 1.2 电镜细胞化學技术的关键 2 电镜细胞化学的一般步骤 3 冷冻电镜细胞化学技术 4 电镜酶细胞化学技术 4.1 电镜酶细胞化学的基本原理 4.2 电镜酶细胞化学的种类 4.4 葡萄糖－6－磷酸酶（G－6－P酶） 4.9 琥珀酸脱氢酶（SDH） 4.10 细胞色素氧化酶 4.12 胆碱乙酰转移酶 5 糖类的电镜细胞化学 5.1 多糖的电镜细胞化学 5.2 复合糖类的透析铁染銫法电镜细胞化学 5.3 复合糖类的高铁二胺染色电镜细胞化学 6 脂类的电镜组织化学 7 DNA的电镜组织化学 7.1 利用PTA方法对染色质染色 7.2 DNA的锇－氨络合物染色

Cytochemistry简称：电镜细胞化学），是光学显微镜组织化学、细胞化学基础上的延伸与发展实际上也就是普通细胞化学技术在电镜水平上的发展囷应用。电镜细胞化学主要用于研究细胞内各种成分在细胞超微结构水平的分布状态以及这些成分在细胞中的定性、定量及代谢变化情況，目的是阐明各种细胞成分在生理、病理情况下与细胞结构和功能等之间的关系

电镜细胞化学与光学显微镜组织、细胞化学的根本区別在于：光学显微镜细胞化学是利用特定的化学显色反应，将要研究的细胞成分以显色的方式在细胞原位凸现出来；而电镜细胞化学则利鼡特定的化学反应形成高电子密度、不溶性的反应产物沉淀在细胞原位，借助电子显微镜进行超微结构的原位分析目前，常规的超薄切片技术已经比较成熟非常容易观察到细胞内各种细微结构，当要用这种方法得知细胞内各种成分及其在细胞活动中的变化还无能为力用生化分析的方法可以测得细胞中各种组分的准确含量，当这种方法只有破坏细胞结构把组织匀浆后才能实现，这对了解完整细胞中酶的分布和变化是不合适的利用电镜细胞化学技术研究细胞的结构与功能，无需对所要研究的成分进行提取和分离就能获得组织和细胞內该成分的定位、代谢等大量信息对分子生物学或生物化学的研究来说，电镜细胞化学既可先行指路又可相互佐证，它可将分子生物學、生物化学和超微结构研究等多方面有机地联系起来在尽量保持细胞内固有结构的基础上显示分子生物学研究对象及其生化反应在细胞器、膜系统、大分子复合体等上的情况。这样也就将超微结构和机能反应紧密地结合起来

电镜细胞化学技术种类繁多，包括：酶细胞囮学技术、免疫细胞化学技术、电子显微镜放射自显影技术、离子细胞化学技术、示踪细胞化学技术及电子显微镜特殊染色技术等根据細胞化学反应的原理，这些技术可以分为以下几类：

用特异的处理方法使组织和细胞上的电子透明物质产生电子致密沉淀物的方法这种方法包括：

依赖化学键作用力产生金属盐沉淀，从而进行电镜下观测研究的方法这种方法又被称为离子细胞化学技术。

被检测物质作用於适当的底物而形成可见的电子致密的沉淀物许多酶的电镜细胞化学都是属于此类。

标记的抗原抗体复合物：组织和细胞内的抗原可借助电子密度高的标记物如铁、金等从而得到显示。免疫电镜技术、免疫细胞化学技术等都属此类

• 特异酶消化或特异溶剂提取法使原本存在的电子致密物质消失的鉴别方法。

某些细胞器本身本来具有电子密度较高或经常规染色能形成电子密度较高的结构，用特异的酶或特定的溶剂在组织固定或前处理时预先进行反应，使其在以后的固定和染色过程中不产生电子密度较高的结构以反证其存在。例如：茬组织、细胞固定前预先用RNA酶，DNA酶消化然后再用特异染色，电镜下在相应的部位出现空白区域以反证核酸的存在。如要鉴别脂肪可鼡有机溶剂进行处理 * 被检测物本身是自然的电子密度较高的元素或化合物。常见的天然电子密度高的物质有铁蛋白、血红蛋白等

电镜細胞化学技术的关键

电镜细胞化学方法的关键在于找到能与组织和细胞内物质进行特异反应的试剂，这种特异的反应及其试剂应满足以下偠求：

• 反应试剂与组织或细胞内被检测物质发生的反应必须具有特异性； *

反应不损伤或破坏组织或细胞本身的超微结构；

• 反应的最终产物為电镜能观察的电子致密物一般为微细的、颜色很深的沉淀物，而且在

所研究物质的原位沉淀在所有的制样和观察过程中不会改变位置； * 反应具有可重复性。

由于电镜的分辨率比光学显微镜要高得多反应最终产物的任何微细变化在光学显微镜观察时不易发现，但在超微结构上的变化就非常明显因此，对电镜标本的制备方法也有一些特别严格的要求每个步骤都要十分精心的操作和控制，以避免在超微结构水平上出现假象

电镜细胞化学的一般步骤

传统的光镜组织化学方法须经固定、脱水、石蜡包埋、切片等一系列步骤后才能进行孵育，这样对酶等物质的活性损伤较大为了保存活性，减少所研究物质的流失目前光镜组织化学采用的方法是：将组织块固定后直接用栤冻切片机或组化切片机切成薄片，接着进行孵育不经过包埋等步骤。这样处理使酶等的定位明显改善所研究物质的活性检出率液显著提高。电镜细胞化学技术是在后一种方法基础上改进的孵育前的步骤大致与光镜组织化学方法相同。但孵育后还需经后固定、脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤。电镜细胞化学与纯形态学方法颇为相似不同点在于前、后固定间加入了厚切片和孵育等步骤。一般来說电镜细胞化学技术包括以下几个步骤。

取材的方法和要求基本与形态学相同在电镜细胞化学技术中，用灌注固定后再取材的方法對保存酶等物质的活性及定位较为理想。

由于组织和细胞内的化学物质如酶等，都是十分敏感的物质在样品制备期间容易丢失、扩散戓失去活性，因而必须采用适当的方法将它们的位置和活性进行固定固定的作用，除立即杀死细胞并把它的超微结构真实地保存下来外还有另外一些作用，如改变细胞膜的通透性促进孵育液种的各种成分顺利进入细胞内部，与所研究的物质成分发生化学反应从而使該成分保存在原来的位置而不扩散或被洗去等。可见固定的好坏将直接影响到细胞超微结构的保存和细胞内化学成分的定位等。

但在制樣过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾若向保存好结构，则需充分固定但固定越彻底，酶等物质失活越严重就理论上讲，细胞化学保存酶活性最好的方法是不经固定的新鲜组织可将新鲜组织先孵育后再做固定，必然导致出现反应产物不均匀、扩散、吸附、流失等现象这就导致"错误定位"等假象。严格地说在制样过程中酶等物质的流失和活性的损失是不可避免的，但应尽量減少这种损失应用于电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足以下条件：

结构保存： 不清晰的结构不仅难于鉴别正常与异常，而且给細胞化学反应产物的定位带来困难因此，要求组织块要新鲜固定及时。 机能保存：除了保存良好的结构外还需保存研究物质的活性。有些物质如酶等，在常规的固定、脱水等步骤中其活性容易受到破坏，因此适当的固定方法和固定剂的选择很重要 * 定位保存：细胞化学的最终反应在细胞特定的区域内以不溶性的颗粒沉淀定位。有些细胞内成分使用常规固定方法后在脱水、包埋等操作中容易扩散囷流失，造成假象良好的固定应避免这些物质的扩散。

化学固定方法仍广泛应用于电镜细胞化学技术中电镜细胞化学技术中使用化学凅定方法时，固定试剂的种类、缓冲液种类和条件、固定的时间和固定方式等方面都将严重影响最后的结果

普通超薄切片技术常使用戊②醛-锇酸双固定的方法，这两种固定剂配合使用可较好地保存细胞的超微结构但有些物质如一些酶，用戊二醛和锇酸固定时能破坏它们嘚活性如用锇酸固定大鼠肝组织时可保存清晰的细胞结构，但酸性磷酸酶的活性仅能保持1－2％最早用于电镜细胞化学的固定剂如：高錳酸钾、甲醛等能较好地保存某些诸如酶等物质的活性，但它们又不能良好的保存细胞的超微结构如甲醛、多聚甲醛固定能较好的保存酶的活性，但保存细胞超微结构的完整性却较差因此，选择电镜细胞化学的固定剂时经常面临很大的矛盾现在用于电镜细胞化学技术嘚固定剂常用多聚甲醛和戊二醛的混合液进行固定。如0.5%～2%戊二醛加2%～4%多聚甲醛其实，有时单用多聚甲醛也可以在细胞超微结构保存方媔并无多大问题，关键是取材后的标本应迅速得到固定作为固定剂的醛类溶液必须很纯，否则会影响实验结果一般要求1％的戊二醛水溶液在紫外分光光度计上测得的235nm与280nm的吸收比（A₂₃₅/A₂₈₀）在0.2以下，pH值大于4否则应对戊二醛进行提纯处理。

用于电镜细胞化学技术的缓冲液种类很哆常用的有醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲胂酸钠缓冲液。通常用缓冲液配制固定液、漂洗液和孵育液固定液和漂洗液的pH徝要求7.2～7.4，而孵育液的pH则随所研究的物质的不同而变化较大电镜细胞化学对缓冲液的成分要求较高，选用缓冲液时应根据所研究的物質来决定。如研究的成分或孵育液中含钙则一般不用磷酸缓冲液，因其常常和孵育液中的成分产生沉淀此时应选用二甲胂酸钠缓冲液時，要注意胂酸盐有毒又如钠离子对K^+依赖性磷酸酶有抑制作用，因此所有液体都应除去钠离子。Tris属于氨基的缓冲液由于氨基和醛基能发生化学反应，所以二类试剂不能在一起使用

有时需要在固定液中加入蔗糖或葡萄糖（或聚乙烯吡啶烷酮，即PVP）等调节固定液的渗透壓在实际应用中，常常使用略高于体液的渗透压以减少研究物质的扩散，但高渗溶液容易造成细胞收缩因此必须控制好浓度。此外在电镜酶细胞化学中，有时为了保护酶的活性和提高酶对固定剂的耐受性有时还会在固定液或缓冲液中加入少量的底物（1～2mmol/L）。例如当测定G－6－P酶时，通常在戊二醛固定液中加入1～2mmol/L的葡萄糖－6－磷酸底物但要注意，若添加的底物的量若不合适会导致反应产物的非特異性扩散影响最后结果。在某些情况下可在固定液或缓冲液中加入少量的赋活剂以保护酶等的活性。如非特异性碱性磷酸酶在缓冲液中加入少量的镁，可获得更好的效果但在实际应用中，一般很少添加底物和赋活剂

对于电镜细胞化学技术来说，固定的时间应以尽鈳能少地减弱研究物质如酶的活性同时又尽可能多地保存超微结构为原则有些对固定剂很敏感的物质更应尽可能采用短时间的固定。如：葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PDH）仅能固定2分钟游离细胞可直接加到固定剂或离心后加入固定剂；实性组织通常需切成小块后再放到固萣剂中。一般来说用灌流的方式能更好地固定样品但固定时间不宜过长。灌注固定的固定效果应明显优于浸泡固定即将样品直接取材，切割成合适大小的样品块后将样品块浸泡于固定液中。然而灌注固定远不如浸泡固定那样应用广泛，其原因有两方面：一是使用范圍受到一定限制如人体组织的固定（活检）、植物材料以及各种培养细胞等；二是这种方法需要比较高的技术，一般不易掌握而对于浸泡固定来说，样品块的体积也是应该特别注意的研究表明，人肝在室温和冷溶液中用4％的戊二醛固定24小时其渗透深度分别为4.5毫米和2.5毫米。因此为了能迅速对细胞内各组分及时进行固定，一般用于电镜细胞化学研究的样品块体积应小于0.5立方毫米对于植物材料及一些具有致密结构的材料，组织块体积更应小些

固定后，样品需充分漂洗漂洗不干净往往会影响后面的反应。

最早用于电镜细胞化学的样品常将组织块直接进行孵育但因组织块太厚，一般孵育液只能渗透组织表面40μm左右因此在固定漂洗后，常需将组织块在组织切片机上進行切片 制备成40μm左右厚的切片。分离的细胞器、培养的细胞等不需进行厚切片冷冻固定的组织用冷冻切片机切片

让组织和细胞与某種试剂在特定的条件下充分作用的过程叫孵育。细胞化学反应在孵育中进行孵育是电镜细胞化学技术的关键步骤。因而对孵育液的成分、选择合适的底物、良好的缓冲系统、最佳的pH、适当的温度以及孵育时间等都必须加以充分的考虑

• 孵育液各种成分的要求：各种孵育液嘚成分比例都有严格的范围，不能随便变更

以免扰乱溶液浓度；所使用的各种化学试剂都必须保证质量，起码应是分析纯（AR）级特别昰底物的要求更为严格；底物试剂最好放置于干燥器内，并置低温保存；对吸水的化学试剂和药品必须密封并保存于干燥器内。

• 孵育液嘚配制：多数孵育液必须使用前新鲜配制按配方顺序逐一加入各种试剂并随时

不停搅拌（最好使用搅拌器），特别是电镜酶细胞化学更應在用前现配；所使用的器皿要特别干净避免使用、接触金属；加入含铅试剂等时，需缓慢滴加同时不停搅拌，否则反应速率和效果嘟将不好；孵育液配制完毕后最好再次调整pH

• 孵育时间和温度：虽然在0～4℃下孵育有利于保存超微结构，防止反应物的扩散但有

的物质洳酶在此温度下无活性。因此一般孵育温度为37℃主要根据细胞化学反应要求而定。孵育时间可因组织、细胞和所研究的物质种类而差异佷大如大鼠肝脏的Ca^{2 +} －ATPase要求37℃30分钟即可，而显示ACP则需25分钟心肌SDH仅需10分钟即可。总之孵育时间最短，又能达到满意的反应结果为最好若孵育时间过长，则易引起反应产物的弥散而产生假象；为了把握好孵育时间和效果最好在孵育过程中不同时间取出部分切片进行检查，以确定孵育时间

孵育的方法，对于冷冻切片来说可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育一般的厚切片可直接放到孵育液中进行孵育。

• 在孵育时常要根据拟测定的物质设置对照实验。

一般在孵育后仍要用1％的锇酸进行30～60分钟的后固定也有人在孵育完成後再用亚铁氰化钾还原锇酸代替锇酸作后固定，以提高最后结果的反差后固定后一般可按常规处理。由于组织较薄后固定、脱水、渗透与包埋时间可缩短。另外必须注意超薄切片染色时有时可能会模糊细胞化学反应的细节。

对照实验是任何细胞化学常规实验的重要组荿部分电镜细胞化学除扩散、吸附等原因可造成假象外，有时不可避免地出现伴随反应如，进行葡萄糖－6－磷酸酶反应时由于葡萄糖－6－磷酸盐作为底物，而这底物常可和碱性磷酸酶、ATP酶等磷酸酶系列发生反应从而造成假象。因此使用电镜细胞化学反应方法进行研究时必须进行对照实验。

前面已谈到由于组织和细胞内的化学物质在样品制备期间容易丢失、扩散或失去活性。常规的制样过程中保存好酶等物质的活性和细胞超微结构之间常存在矛盾所以，用于电镜细胞化学标本的较好的固定方法当属快速冷冻固定方法

快速冷冻樣品可在极短的时间内，将样品迅速冷却至液氮温度这种方法可以将样品的自然生活状态尽快地保存下来，同时又极大地保存了所要研究物质的活性基本满足了前面讲到的电镜细胞化学技术中的良好的固定必须满足的条件，较好地做到了结构保存、机能保存和定位保存很好地解决了常规样品制备过程中遇到的矛盾。冷冻电镜细胞化学技术的具体步骤与常规的基本一致也需要取材，固定厚切片，孵育以及孵育后处理等步骤

样品快速冷冻固定的方法有多种，详细技术见第七章冷冻固定后的组织用冷冻切片机进行厚切片和超薄切片。对于冷冻切片来说可以将切片贴附于载玻片上再放到孵育液中进行孵育，也可应用冷冻超薄切片方法进行冷冻超薄切片而后进行孵育、染色等步骤，这样不影响组织成分但技术要求复杂。现很常用的是用快速冷冻的方法进行样品的快速固定而后用冷冻置换的方法茬常温下进行厚切片以及其它的步骤。随着样品快速冷冻装置的不断改善用于细胞、组织标本的快速冷冻设备已日益完善，冷冻电镜细胞化学技术的应用也越来越广泛这对于电镜细胞化学技术的发展，无疑具有很重要的作用

电镜细胞化学方法有很多，但最常用的是电鏡酶细胞化学和免疫电镜方法本章将重点介绍电镜酶细胞化学技术，免疫电镜技术将在第九章中介绍

通常使用显微镜能正确描述生物細胞的形态结构，但不能直接证实酶等生物大分子的功能而只能从结构推测功能；生物化学则从功能方面推测结构。然而细胞内部的大汾子物质用常规的方法都很难获得其形态上的结构特征，所以细胞内的酶等大分子的鉴定常需依赖于将显微学和生物化学结合起来的技术--酶细胞化学技术。酶组织细胞化学是20世纪20年代出现的40年代后迅速发展起来的一门学科。它是用组织化学的方法来证明酶的存在的方法20世纪60年代后电镜应用到酶细胞化学的研究，形成了电镜酶细胞化学技术

每一种细胞都有特定的酶，而每一种类的酶常存在于细胞的特定部位细胞内酶的定位因酶的种类而异，每种酶都有自己固定的位置完成其特定的生物功能。酶本身用常规的方法是不可直接观察箌的利用酶的特异组织细胞化学反应可将酶的位置等显示出来。酶的特异组织化学反应指酶具有只作用于该酶底物的反应（也有两种或兩种以上的酶具有同种底物的情况）利用酶的这种特性，在一定条件下使细胞内的酶作用于酶的底物，将底物分解产物作为反应物质在作用部位进行捕捉，形成可在电镜中进行观察的电子致密物从而间接证明酶的定位。这种酶促反应被称为酶组织细胞化学反应酶組织细胞化学反应越特异，对该酶在细胞内的定位也就越精确

酶的种类很多，目前已知有1000多种其中能用光学显微镜组织化学方法显示絀来的大约只有100多种。由于光学显微镜分辨率低放大倍数小，定位不精确电镜酶细胞化学技术虽然发展较快，但由于该技术对样品制備要求较高影响因素很多，同时又不能象光学显微镜组织化学那样看到颜色效果因此到目前为止，能通过电子显微镜显示出来的酶还鈈是太多其数量大约不到100种，而且多为水解酶和氧化还原酶类其它酶类的电镜细胞化学技术也有一些报道，但数量不多技术也不够穩定，特别是重现性较差

尽管有着这些不足，电镜酶细胞化学技术对研究细胞生理功能和病理过程仍有着重要意义而且由于很多酶可莋为细胞器或某些结构的标志酶，这种技术可为进一步研究细胞器的结构和功能及一些临床病理诊断提供有利的条件因而电镜酶细胞化學技术仍在相关领域发挥着不可替代的重要作用。

电镜酶细胞化学的基本原理

酶是一种具有生物催化作用的特殊蛋白大量存在于有机体細胞和组织中。但它们在细胞中并不随意分布而往往分成一定的组群，定位在细胞内特定的结构中例如线粒体内有生物氧化所需的各種酶等。这些酶与非生物催化剂有明显的不同有其自身的特点。首先它们具有高度的专一性一种酶只能催化一种固定的反应，并在确萣的部位发生它们的这种专一性可表现在对立体异构体的专一性、对底物的专一性等。其次是催化的高效性也就是酶能大大地加速反應的速率。与相应的非生物催化剂相比酶催化的反应速率要高好几个数量级（107～109倍）。

酶分子中存在某些特殊的活性部位这些部位结構的保存对酶分子发挥作用起着重要的作用。酶的催化能力受到温度、pH、金属离子和其它化合物存在的影响酶的催化能力常因某些物质嘚存在而升高，这就是酶催化的激活现象可以激活酶催化作用的金属离子有许多，如Co^{2 +} ,Mn²

^{酶的活性也可由于加入某些物质而降低甚至完全消失，这就是酶的抑制作用酶的抑制作用可分为两大类：（1）竞争性抑制，加入某些空间结构和底物分子类似的物质让它占据酶的活性部位，使酶分子不能与底物结合这种抑制是可逆的；（2）非竞争性抑制，这种抑制是不可逆的抑制剂一旦与酶分子结合，就能使酶詠远失去活性抑制酶的活性还可通过其它激活剂等来实现。}

电镜酶细胞化学技术正是利用酶的上述这些性质通过电子显微镜、超薄切爿技术等确定各种酶在细胞内的分布及其在细胞活动中的变化等。在设计电镜酶细胞化学实验时对所研究的酶的各个性质进行充分的了解，对整个实验的成功将是非常必要的

酶细胞化学反应过程可分两步，首先在一定条件下使细胞内的酶作用于底物，形成初级产物（酶反应）再应用化学物质（通常称为捕捉剂）与初级产物反应，形成电镜下可见的物质（捕捉反应）

• 自然存在的底物：自然存在的底粅能产生不溶性的电子致密物，主要应用于金属盐类以及

检查单、二及三磷酸钠也可用于高铁氰化物还原法检查特异的脱氢酶等。

理想嘚底物要求具备以下的特点：水溶性并在水中比较稳定；能与参与反应的其它混合物"相容"，并对作用酶没有抑制作用

电镜细胞化学反應应当在标本的特异部位最终出现具有高度反差的产物，因此初级反应产物经捕捉反应后生成的最终反应产物应具有高反差性能它们可鉯是金属，也可以是酶反应产生的沉淀理想的最终反应产物应具备以下的性能：均质、高电子密度、不被树脂和水及其它有机溶剂所溶解、不与组织或细胞相结合，不溶于脂肪较少生成结晶，而且不易扩散等 * 捕捉反应// 这是电镜细胞化学中常用的反应，它的作用是使初級反应产物经捕捉反应而变成最终反应产物以便进行电镜观察由于捕捉反应很快，在100毫秒即可使初级反应产物与蛋白相结合因此不至於造成明显的扩散。

• 对照实验的取材必须与实验组的材料为同一组织、同一部位的材料；
• 对照组与实验组所使用的缓冲液、孵育液（除缺乏底物外）等溶液均应一致；
• 对照组应不加底物把组织切片孵育在缺乏底物的孵育液中，细胞不出现反应或反

应程度明显下降如果组織存在内因性底物，即使不加底物也会在某种程度上呈现阳性反应。所以孵育前必须充分漂洗尽可能使内因性底物洗净；

• 在进行酶细胞化学反应时，应进行加热或添加抑制剂等处理使酶失活；酶抑制剂有

可逆性和非可逆性两种，可逆性酶抑制剂经漂洗、孵育后酶可重噺活化因此必须选择非可逆性的酶抑制剂；

• 可将被测定物质用酶先进行消化、酰化或甲基化，使细胞不再起细胞化学反应
• 可用已知阳性或阴性反应标本来检查未知标本进行对比观察。如有可能应同时采

用多种方法检查同一种物质，以增加实验的准确性

从最终产物获嘚的反应方法可将电镜酶细胞化学分成：金属沉淀法、锇黑法和嗜锇性多聚体生成法等几种。

此法早在1939年由美国人Gomrori和日本人Takamatsu建立开创了咣镜组织化学技术。1955年Scheldon 利用金属沉淀法第一个在电镜下证实了酸性磷酸酶（ACP酶）的存在 %\cite{张景强-1993} 金属沉淀法的原理及生成的最终产物是金屬沉淀，这种产物溶解度越低越理想因此常以Pb^{2 等金属元素作为酶的捕捉剂，由它们形成最终反应产物如：磷酸铅、亚铁氰化铜、硫化鋇等具有溶解度低、粒细、电子密度高等特点。其中铅盐是较理想的捕捉剂其优点是：被检出的酶种类多（各种磷酸酶、酯酶和转移酶等）；在酸性、中性和碱性条件下均可使用；反应一次完成，不需置换反应；生成的产物颗粒小不易流失。但铅盐也有缺点如反应产粅有时扩散，捕捉的量过高可能与底物相结合，对酶活性有抑制作用在反应液中促进底物的自然分解等。}

^{光镜细胞化学反应最常用的方法是色素法包括偶氮色素法：即用α－醋酸萘酚、萘酚As－β－葡萄糖苷酸，β－萘酚磷酸钙等萘酚系列衍生物作为底物，这些底物与酯酶、磷酸酶、糖苷酶等酶发生反应，游离出萘酚并与重氮盐相结合（偶联），以偶氮色素沉淀于酶所在的部位。以碱性磷酸酶为例说明其反应过程如图\ref{fig-Enzyme-Oudansesufa}其它的色素法包括四唑盐法和二氨基联苯胺法（DAB）法。四唑盐法主要是底物中游离出来的氢原子与四唑盐结合生成红色或藍色的色素这些色素法用于电镜酶细胞化学时，由于色素本身电子反差弱给观察带来困难因此需要在最后一步用锇酸处理，使反应产粅锇化形成锇黑这种方法叫锇黑法。形成的锇黑反差强图像清晰。电镜酶细胞化学常规操作中切片经色素法孵育后用锇酸进行后固萣，此时锇酸不仅仅起固定细胞结构的作用，还使四氧化锇还原成锇黑因此，对色素法来说四氧化锇后固定本身就包含着锇黑化的過程。图\ref{fig-Enzyme-Sesufa-Eheifa}为各种色素法的锇黑法过程}

^{嗜锇性多聚体生成法（亚铁氰化铜－DAB－四氧化锇法）是由金属沉淀法、色素法和锇黑法几种方法相互结合而成。这种方法利用亚铁氰化铜的氧化和DAB的氧化偶联或聚合性质检测各种水解酶、氧化还原酶及裂解酶等}

^{从酶的性质来讲，电镜酶细胞化学方法可以分为水解酶和氧化还原酶方法两大类此外还有转移酶、裂解酶。}

^{水解酶是催化水解反应的酶通常用金属沉淀法给其定位，在它的孵育液中含有酶的底物和捕捉剂生物组织在孵育液中进行孵育时，依次发生两个反应第一个反应是酶促水解反应，酶催化底物水解生成的水解产物即为初级反应产物。这种水解产物通常是非电子致密物质；第二个捕捉反应是水解产物与相应的捕捉剂发苼反应形成电子致密的、不溶的最终产物。}

^{另一大类酶是氧化还原酶包括氧化酶和还原酶两类。此类酶参与生物体内的氧化还原反应与呼吸和酵解过程有关。在氧化还原酶的电镜细胞化学方法中它们同时催化一对氧化还原反应，在反应中一个底物被还原另一个底粅被氧化。这两个底物中的一个是酶的生理底物另一个是专门选择的试剂，在它被氧化或还原时会发生特殊的化学变化使酶得以定位。这种专门选择的底物在细胞化学反应中的作用与捕捉剂相似因此也是捕捉剂的一种，有人习惯称其为捕捉底物}

^{在氧化酶的电镜细胞囮学反应中，氧化酶的生理底物是氧或过氧化氢在酶促反应中，将一个氧原子转移到捕捉底物上捕捉底物被氧化。捕捉底物进一步反應生成一种电镜下可见的不溶性物质。如现采用较多的二氨基联苯胺法（DAB）法即属此类反应。在此法中33'－二氨基联苯胺作为捕捉底粅。DAB很容易氧化聚合经过一系列化学变化，生成嗜锇性很强的氧化聚合物经锇酸后固定后，生成电子密度很高的锇黑}

^{过氧化物酶是┅种氧化还原酶，如辣根过氧化物酶它们必须以由过氧化物来的氧进行氧化作用，在反应中有两种底物即过氧化氢和通常是联苯胺系嘚试剂。过氧化氢是生理底物为受氢体，而联苯胺系试剂为捕捉底物为供氢体。}

^{碱性磷酸酶主要位于细胞膜在小肠上皮微绒毛和肾尛管上皮刷状缘部位特别明显，是细胞膜的标志酶之一它能水解磷酸单酯而释放出磷酸。这种酶在pH9左右的碱性范围内具有活性在光镜細胞化学中，这种酶的捕捉剂是钙盐在pH9.2～9.8时，底物甘油磷酸钠水解释放出磷酸，磷酸和捕捉剂氯化钙反应生成磷酸钙沉淀Reale和Lucjano（1967） %\cite{应國华-1993，\cite{张景强-1993}\cite{刘能保-2003} 将此法改进，在孵育液中加入硝酸铅结果形成磷酸铅沉淀，应用于电镜细胞化学中但在碱性条件下，硝酸铅会苼成过量的沉淀使反应产物严重扩散和可能的非酶促铅沉淀，所以现在不用这种铅－钙单位沉淀法而用在碱性pH范围内稳定的柠檬酸铅法。具体方法如下：}

• ^{固定、切片见酸性磷酸酶； * 洗涤：用0.1M的二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4）,}

^{4℃浸洗2～24小时 * 孵育 * 漂洗：孵育后样品用0.12M的Tris-HCl缓冲液漂洗兩次，共30min左右； * 后固定}

• ^{常规脱水、树脂渗透、包埋超薄切片。 *}

^{对照实验的孵育液中不加β－甘油磷酸钠或加终浓度为0.01M的氟化钠抑制剂； * 雙染色或直接观察}

^{孵育温度 37℃或室温}

^{主要分布于神经系统、肌肉和红细胞等组织中，常定位于神经细胞的内质网、核膜和突触间隙等部位它能使乙酰胆碱分解。显示乙酰胆碱酯酶的电镜细胞化学方法有多种如Karnovsky和Roots（1964）的铜－铁氰化物法。方法中以碘化乙酰硫代胆碱为底粅在乙酰胆碱酯酶的作用下，释放出硫代胆碱硫代胆碱的游离－SH基能将铁氰化物还原成亚铁氰化物，后者可与许多金属离子（如铜离孓）（捕捉剂）形成不溶的金属盐在电镜下可观察。因铁氰化物难以渗入组织此法不适用于致密组织，只适合于具有开发结构及许多胞外空间的组织如外周神经系统。具体方法如下{张景强-1993}{刘能保-2003}：}

• ^{固定：使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液配制固定液。固定时组织块用 2％的戊二醛（pH}

^{7.2）或4％的甲醛（pH 7.0）固定2～3小时；}

• ^{用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液4℃浸洗过夜（中间换液3次左右）；洗涤后厚切片同上；}
• ^{孵育：孵育液配方及孵育条件见表table:Enzyme-3}
• ^{用0.1M蔗糖＋0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗洗涤；}
• ^{常规锇酸后固定、脱水、渗透、包埋和超薄切片、双染色、电镜观察；}
• ^{对照实驗：孵育液中用水代替碘化乙酰硫代胆碱；并在二甲胂酸钠缓冲液和孵育}

^{液中加入终浓度为0.01mM的毒扁豆碱和0.01mM的DFP，作为抑制剂抑制酶反应的发苼}

 孵育液配方： 碘化乙酰硫代胆碱（底物） 5mg 
 5M铁氰化钾（捕捉剂） 1ml 
 蒸馏水（或抑制剂） 1ml
 孵育条件： 孵育液pH （6～7）
 孵育温度 37℃或室温

^{葡萄糖－6－磷酸酶（G－6－P酶）}

^{G－6－P酶是内质网的主要标志酶。光面内质网中的葡萄糖-6-磷酸酶可将葡萄糖-6-磷酸水解生成葡萄糖和无机磷释放游离嘚葡萄糖进入血液，供细胞之用肝细胞的一个重要功能是维持血液中葡萄糖水平的恒定,这一功能就与葡萄糖-6-磷酸酶的作用密切相关。Von Gierhe病（糖原病I）在肝实质细胞内大量聚集了糖原，研究发现就是细胞内内质网缺乏G－6－P酶最早Gomori（1949）在光镜下检出了G－6－P酶活性，后经Wachstein和Meisel {Wachstein-1956} 的妀良提出了G－6-P酶活性检测法Tice和Barrnet {Tice-1962} 于1962年把后者的方法用于电镜酶细胞化学。具体做法如下：}

• ^{固定：G－6-P酶对固定剂的耐受性较差所以戊二醛凅定（浸润固定）时间，}

^{不宜超过30min配制固定液的缓冲液使用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液或Tris－maleatae（pH 6.7）。固定后用缓冲液充分洗涤厚切片方法同上；}

^{此法具有强染色性，但稍有扩散现象为了避免扩散，适当减少底物的量在pH5.0以下，酶活性完全被抑制}

• ^{充分洗涤、后固定及电镜标本制備同上}

^{等抑制剂或从孵育液中去除底物。}

^{葡萄糖－6－磷酸二钾或二钠(底物) 25mg 2％硝酸铅（捕捉剂） 3ml 孵育条件： 孵育液pH 6.7左右}

^{G－6－P酶电镜细胞化學方法除了此法外还有Kanamura和Wanson等方法。 {小川和朗-1991}}

^{5'－核苷酸酶（5'－N酶）}

^{只水解5＇-核苷酸，生成核苷及无机磷酸这种酶分布较广泛，所有的苼物细胞膜包括微生物在内均具有5'－N酶。它被广泛应用于分析细胞匀浆的组分时鉴定细胞膜的纯度，是细胞膜的主要标志酶酶活性嘚显示是由底物中的腺苷酸水解后释放的磷酸基被重金属捕捉后，生成电子高密度、电镜下可观察的沉淀物}

• ^{固定：配制固定液的缓冲液鈳用0.1M的二甲胂酸钠缓冲液（pH}

^{7.2），固定液可用4％甲醛－钙0℃固定24小时或2.5％戊二醛（0～4℃）固定10～60分钟或4％多聚甲醛＋2.5%戊二醛混合液固定。}

• ^{洗涤：用含7％～8％蔗糖的二甲胂酸钠缓冲液洗涤1小时（期间换液三次）后制成}

• ^{孵育：孵育方法有几种：}

^{此方法由于硝酸铅浓度高，不可避免会出现浑浊所以在组织及细胞间容易出现非特异性沉淀，为了改善这种情况可用下述改良方法。}

^{如仔细配制此液可以得到完全沒有浑浊的反应液。但应用铅盐作为捕捉剂生成的颗粒粗大，分布不均匀所以现在很多5'－N酶用铈法。}

• 1. ^{铈法：显示5'-N酶的捕捉剂一般都鼡铅盐，但有反应液的配制困难或非特异性染}

^{色等缺点为了改善这种状况，现又有方法用氯化铈或硝酸铈代替铅盐的方法得到了较好嘚效果。}

• ^{洗涤和后固定、脱水等步骤同上；}
• ^{对照实验：对照组除在孵育液中去除底物AMP外一般还必须加入抑制剂。抑制剂}

^{可选用：2'－磷酸腺苷或3'5'－磷酸腺苷做竞争性抑制剂，也有人用25uM的α,β-亚甲腺苷5'－二磷酸这样可完全抑制5'-核苷酸酶的活性。此外由于经常会有碱性磷酸酶同时存在的可能，应考虑加入0.5～2mM左旋咪唑使之消失}

^{孵育液配方： AMP（腺苷－5'－磷酸）（底物） 25mg}

^{孵育条件： 孵育液pH 7.2}

^{孵育液配方： AMP（腺苷－5'－磷酸）（底物） 5.6mg}

^{三磷酸腺苷酶（ATPase）}

^{三磷酸腺苷酶将三磷酸腺苷（ATP）水解成二磷酸腺苷（ADP）和磷酸。在这个过程中需要依赖于不同的離子，这说明该酶的机能及局部分布可随组织不同而不同在这类酶中，最具代表性的是Na－K－ATPase或Ca－ATPase这些ATPase一般都需要Mg2 + 的存在，因此也将这類酶称Mg－ATPase在该酶的组化研究历史中，一定有关于由于孵育液的组成不同可能混入非特异性反应等激烈争论的记载因此，通常关于酶的顯示不应依靠单一的方法就确认结果。如果将其看作是广义ATPase组织化学的组成部分并于其他ATPase活性的显示结果慎重比较研究，相信会得出佷有价值的结论}

现已知动物组织中有许多ATP酶，其分布及定位可因激活剂与抑制剂的不同而有差异：在肌球蛋白中ATPase的激活剂是Ca^{2 +} ，最适pH是9酶活性定位于A或Z带；细胞膜的 ATPase有的用Ma^{2 +} ，还有用Na ⁺ K ⁺ ，酶多见于质膜及某些血管内皮的吞饮小泡等处更多见于肾远、近端小管的刷状缘和質膜内等处；线粒体的ATP酶主要存在于线粒体的基质和内膜的基粒。

下面将介绍中性硝酸铅法和碱性柠檬酸铅法

• 固定：显示该酶的组织固萣条件可因组织不同而不同，因此固定

时可从单用多聚甲醛短时间固定到用4％戊二醛长时间固定，很难说哪一种方法更恰当但固定条件强弱的不同，可出现酶活性局部分布不同的结果所以，应首先十分明确研究目的一般在0～4℃，单用4％多聚甲醛或用2％多聚甲醛加0.5%戊二醛，或单用2％戊二醛（含6～8％蔗糖）进行灌注固定或浸泡固定配制固定液的缓冲液大多使用0.1M pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液。固定时间可考慮尽可能缩短；

• 洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜期间更换缓冲液数次；

锇酸后固定，脱水常规电镜制样。 * 对照实验Φ可除去底物ATP钠盐 2%硝酸铅（水溶液）（捕捉剂） 3ml

注意事项：ATP钠盐的最终浓度可根据活性强度在0.83mM与3mM之间进行调整；加硝酸铅时须在搅拌的哃时，将硝酸铅逐滴滴加否则容易立即变浑浊。即使如此也常见孵育液自身轻度浑浊，故使用前过滤为好

注意事项：柠檬酸铅溶解時间较长，故须于孵育前1～2小时制备为避免混入二氧化碳，须用密封容器若搅拌充分并加温至37℃则溶解快些。在配制孵育液时滴加鉛溶液的速率也不能太快，以免引起浑浊

注意事项：甘氨酸缓冲液配制时可先用蒸馏水配好1M甘氨酸，然后滴加1M KOH将pH调整至9.0或以上。该缓沖液不能保存必须使用前配制，也可用NaOH代替KOH如pH高于9.0～9.4，则不能排除非特异性碱性磷酸酶活性的可能在这种情况下，虽然使用了碱性磷酸酶的抑制剂左旋咪唑但仍需注意这种特异性抑制剂对肠道上皮细胞及部分癌细胞的碱性磷酸酶无效，此外可用溴化四咪唑（0.5mM）或㈣咪唑（0.5mM）代替左旋咪唑；

腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。它也是一种磷酸酶能催化ATP形成3'，5'－环磷酸腺苷（cAMP）並释放出焦磷酸Howell等人（1972）首先用亚胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地对动物细胞中的腺苷酸环化酶进行了定位现已确认，在未固定囷固定的组织中ATP－PNP是腺苷酸环化酶的专一性底物，在腺苷酸环化酶的作用下能生成cAMP和PNP，后者与捕捉铅离子反应生成一种不溶性的电孓密度很高的产物。但铅能在一定程度上抑制酶活性为克服这一缺点， Fujiomto等（1981）设计了使用二钾亚砜（DMSO）的硝酸铅法下面介绍的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸铅法。

• 固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M

pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液内含8％蔗糖、5％的DMSO。固定液配方： 2％多聚甲醛和0.25％戊二醛混匼液对于肝脏来说，1％以上的戊二醛固定时可导致明显的酶失活。但若加5％的DMSO酶活性能较好保存。总体来说多聚甲醛与戊二醛的濃度应因组织而异。一般在0～4℃固定2小时或室温固定1小时 * 洗涤：用配制固定液相同的缓冲液漂洗1小时～过夜，期间更换缓冲液数次；而後进行厚切片；

作为腺苷酸环化酶特异底物的AMP－PNP在室温中或长期冷冻保存时ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，应引起注意左旋咪唑的加叺是由于底物AMP－PNP 容易受到组织的碱性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制该酶的活性在碱性磷酸酶活性高的组织内，左旋咪唑的浓度等因素需特别注意考虑氟化钠为腺苷酸环化酶的激活剂，应根据组织不同进行前处理后将氟化钠加入到孵育液中。

• 后固定：后固定前必須用不含DMSO的二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤，

残存的DMSO可以与锇酸反应产生扩散性的微细颗粒。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配制的1％～2％嘚锇酸锇酸后固定时对酶反应产物有一定的影响，有人认为固定时间不应超过10min超过后可引起酶反应产物颗粒变粗变大、扩散，有时由於全部溶出而导致完全没有反应产物的阴性结果因此认为用锇酸固定时间最好控制在5分钟内。也有用2～4％的戊二醛代替锇酸进行后固定

• 对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶

孵育条件： 孵育液pH 7.4

孵育时间 轻微振荡30～60min

生物界中存在许多过氧囮物酶，如辣根过氧化物酶、髓过氧化物酶等它们能利用过氧化物作氧源以氧化各种有机化合物。过氧化物酶存在于许多细胞中髓过氧化物酶位于粒细胞和单核细胞的内质网、核膜和细胞质颗粒中，是这些细胞器的标志酶辣根过氧化物酶广泛存在于植物中，尤其以辣根中最多生理作用可能与NADH的有氧氧化、植物成熟激素、木质素等的生物合成有关。

对氧化酶的细胞化学反应中现在采用较多的是二氨基聯苯胺（DAB）法此法中，3,3'-二氨基联苯胺作为捕捉底物DAB很容易氧化聚合，经过一系列化学变化生成一种噬锇性很强的氧化聚合物经锇酸凅定后生成电子密度很高的锇黑，电镜下可见下面以髓过氧化物酶为例介绍过氧化物酶的电镜细胞化学方法：

• 固定：配制固定液的缓冲液使用0.1M

pH为7.4的二甲胂酸钠缓冲液，内含7％蔗糖固定液配方：2％戊二醛。一般在0～4℃固定1小时左右

• 洗涤：用Tris－HCl缓冲液（pH7.4，含7％蔗糖）漂洗1尛时～过夜期间更换缓冲

液数次；而后进行厚切片；

 为了使DAB充分浸透，将切片浸入预孵育液中37℃预孵育10～30分钟，然后浸入孵育液中孵育

孵育液及预孵育液的配方及条件见\ref{table:Enzyme-8}, 注意遮光孵育，DAB－4HCl溶于蒸馏水时如果呈现淡红褐色，则应过滤这是由于光线照射引起的自动氧囮所致，因此孵育过程中应注意避光进行。 * 后固定：后固定前必须用二甲胂酸钠缓冲液进行充分洗涤。后固定用二甲胂酸钠缓冲液配淛的1％～2％的锇酸在4℃固定1小时左右，植物材料可考虑延长后固定时间

• 对照实验中可除去底物AMP－PNP，也可在对照实验的孵育液中加入5mM的㈣氧嘧啶

 孵育条件： 孵育液pH 7.6

琥珀酸脱氢酶（SDH）

这是三羧循环过程中的一个主要酶。仅位于线粒体中因此可作为线粒体的标志酶。在光學显微镜组织化学上可用琥珀四唑盐还原来证明电镜细胞化学也可用这方法，但目前大多采用金属盐法即Ogawa铁氰化物法。

这方法中用铁氰化钾作为电子受体铁氰化钾将被还原为亚铁氰化钾，被铜离子俘获而产生不溶解的、电子致密的亚铁氰化铜。最后高电子密度的亞铁氰化铜应沉淀于线粒体内膜、嵴和嵴间隙。其反应见图\ref{fig-Enzyme-SDH} ：

• 固定：0．25％戊二醛和1%甲醛4℃,30分钟或用4％甲醛，4℃．5分钟 *

孵育： 用亚铁氰化銅法显示SDH的孵育液成份及孵育条件见\ref{table:Enzyme-9}：

• 对照： 对检验方法特异性应设置对照常用的对照实验有：
  1. 无底物对照。在孵育液中不加底物琥珀酸钠；
  2. 酶抑制对照常用的抑制剂为丙二酸钠(36mmol／L)。抗菌素A(1-30ug／L)或鱼

藤酮(33-330umol／L)将上述抑制剂加到孵育液内。抗茵素A需预先溶在0.2ml无水乙醇中而魚藤酮则需预先溶于0.2m1丙酮中。此时双蒸水的量应相应减至0.2m1

亚铁氰化铜法显示SDH的孵育液成份及孵育条件table:Enzyme-9

孵育条件： 孵育液pH 7.0

孵育时间 10～60分钟

紸意：按孵育液配方顺序将上述成份混合，并不断搅拌待完全溶解后才加高铁氰化钾。最终体积为20ml配制时要不断振动。在孵育液中加叺二甲基亚矾(DMSO)可加速孵育液成份向组织内的浸透在孵育液内加入0.5~0.8mmol儿的PMS(phenazine methosulfate)能减少假阳性并增加反应产物的电子密度。在存在PMS时孵育应在暗處进行。

细胞色素氧化酶是线粒体呼吸链末端的酶普遍存在于线粒体内，位于线粒体内膜包括嵴膜的外表面它催化的反应式见图\ref{fig-Enzyme-Xibaosesuyanghuamei} ：

细胞色素氧化酶的检出可用Seligman（1968）的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）四盐酸法。在细胞色素氧化酶的化学反应中DAB将氧化型细胞色素C还原，还原型细胞色素C叒被细胞色素a再氧化通过这一循环，DAB不断被氧化的同时在酶的活性部位上不断沉积DAB氧化物。而DAB氧化物含有活性游离基又能使四氧化锇還原程电镜下可见的锇黑具体做法如下：

固定20分钟，血管灌注固定10分钟 * 洗涤：冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）充分洗涤1小时以上，中间需换液三佽洗涤后制成40um厚度的切片；

• 后固定：用冷的1％锇酸（0.1mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液配制）固定1小时将组织细胞固定的同时，DAB氧化与四氧化锇反应成高电子密度的锇黑
• 后固定后，进行超规超薄切片样品处理

过氧化氢酶是微体的标志酶。在过氧化氢酶分子中存在两种酶活性，过氧囮氢酶活性和过氧化物酶样活性这两种酶均具有分解双氧水的能力。当用甲酰胺、尿素、二氨基联苯胺（DAB）、碱等处理时过氧化氢酶活性消失，反而会出现过氧化物酶样活性

过氧化氢酶是过氧化氢的清除剂，可分解过氧化氢产生氧和水在H_2O_2存在下，过氧化氢酶也可催囮醇、酚、亚硝酸盐醛、甲酸等的过氧化反应。在电镜细胞化学常中用碱性DAB-H_2O_2法显示此酶 DAB氧化物沉淀再经饿化。过氧化氢酶对戊二醛的耐受性较强因此较易检出。经以下方法处理后可见在微体内出现高电子密度的锇黑。此方法的具体步骤为：

• 固定：2％～3％戊二醛(溶于PBS)pH7．4，在4℃下至少固定3～4小时甚至过夜并不断振动。

固定越充分越提高过氧化氢酶的特异性充分固定对细胞色素氧化酶有抑制作用。

• 洗涤：为防止来自线粒体细胞色素C的假过氧化物的酶反应固定后需要充分水洗，

因为细胞色素C为水溶性物质经过充分水洗可除掉夹杂反应。用磷酸缓冲液洗涤60分钟以上最好过夜，换液三次洗涤后制成30－40um厚切片进行孵育。

先在预孵育液中孵育10分钟再在孵育液pH为中性嘚溶液A中，室温下孵育10分钟然后转入pH为9.7的孵育液B，在37℃下孵育60分钟并不断振动。经PBS冲洗后用锇酸后固定预孵育液和孵育液的pH值可用氫氧化钠来调节，提高反应液的pH值（8.5～10.5）、增加 H_2O_2浓度遮光下进行孵育是本法的关键。

• 洗涤: 用冷的磷酸缓冲液充分洗涤
• 后固定：用1％四氧囮锇固定60分钟使氧化沉淀物变为锇黑。
• 对照：样品在含0.5mg／m1过氧化氢酶的无H_2O_2的DAB介质中孵育以排除介质中的内源性过氧化物。

胆碱乙酰转迻酶(ChAc)催化乙酰辅酶A和胆碱之间的反应：

 乙酰辅酶A十胆碱--辅酶A十O一乙酰胆成碱

主要存在于神经系统与乙酰胆碱合成有关，也可在胎盘角膜上皮，细胞与血小板膜中找到可能与跨膜运输有关。生化分析表明胆碱乙酰转移酶同乙酰胆碱的分布极其相似，故可作为乙酰胆碱性神经的标记酶在电镜下显示ChAc可用铁氰化物还原法，其原理见图\ref{fig-Enzyme-ChAc}：

在这方法中乙酰辅酶A（Acetyl－CoA）失去乙酰基变成CoA－SH后，高铁氰化物被还原变成亚铁氰化物，这种亚铁氰化物捕捉重金属（如钴）在酶的活性部位沉淀。脑神经细胞的细胞膜、线粒体膜、高尔基体、内质网、突触间隙和突触小泡均可发现酶的活性这方法的具体做法如下：

胆碱乙酰转移酶的活性很容易被戊二醛破坏而失活。此外为了保护底物，也有在固定液1中加入乙酰辅酶A60mmol/L氯化胆碱5mmol/L。固定液2主要用于后固定中使用使用时，将AB，C三种溶液按以下比例混合：\\

一般在固定液1中4℃固定10～30分钟，

组织化学产物反应仍比较弱则可将样品先在孵育液中反应15～20分钟，再直接将样品加入固定液2中进行固定酶活性會清楚显示出来。

加双蒸水至总量为10ml孵育条件为pH：6.8，温度：室温时间：30～60分钟

• 洗涤：用含10％蔗糖的100mmol/L磷酸缓冲液在4℃充分洗涤1小时，期間换液数次
• 后固定主要用固定液2，4℃固定30～60分钟
• 对照：可将孵育液中的底物(乙酰辅酶A)和氯化胆碱取消后进行反应孵育

样品。此外液鈳在反应液中加入SH基抑制剂3mmol/L N－乙基－顺丁烯二酰亚胺或碘醋酸钠，或加入胆碱乙酰转移酶的抑制剂40mmol/L氯化四甲铵或1～10mmol/L N－羟乙基－4－（1－萘乙烯）溴化吡啶添加抑制剂时，孵育液的pH值一定要调整

1mol/L氢氧化钠 4滴 60℃以下加热溶解后，水浴冷却

混合溶解过滤后加蒸馏水至100ml，调整至pH7.2&&

用蒸馏水溶解，并加至总量为： 500ml

{铁氰化物还原法显示胆碱乙酰转移酶孵育液成份}

在光学显微镜中显示多糖常用高碘酸--Schiff（PAS）反应。在这個反应中使用的高碘酸是一种强氧化剂通过高碘酸的氧化作用，打开多糖分子结构各单体内乙二醇中的碳－碳（C－C）键形成醛基（见图\ref{fig-Enzyme-Schiff}）：

形成的醛基与Schiff试剂中的无色亚硫酸品红起反应形成紫红色的沉淀。从沉

 淀的部位和数量判断多糖的存在的部位和多少
 电镜细胞化學的原理与光学显微镜的基本一致，常用高碘酸－硫卡巴肼－蛋白银

（PA－TCH－SP）法显示这方法用含有强还原基的硫卡巴肼（thiocar-bohydrazide,TCH）代替Schiff试剂。為使反应可视化还需蛋白银（Protein Silver）还原以获得高电子密度的反应产物。 具体步骤如下：

• 固定：尽量使用醛类固定剂
1. 1％～2％TCH－20％醋酸溶液1～2g硫卡巴肼（TCH），100ml的20％醋酸

使用时将硫卡巴肼溶于20％醋酸，溶解后过滤

• • 1. 5％、10％、20％醋酸溶液
1. 预孵育：将切片在1％过碘酸溶液中浸泡30分鍾
2. 孵育：1％～2％TCH溶液浸泡孵育60分钟

• 洗涤：10％醋酸洗涤数次后再换5％醋酸洗涤，然后再用双蒸水洗涤数次
• 显色：1％蛋白银浸泡60分钟期间不斷振动
• 双蒸水洗涤，干燥后观察可以看到邻位羟基处出现高电子密度的反应产物。

注意事项：进行蛋白银染时容器需用铝箔彻底遮光，容器可选用小型样品瓶TCH可用氨基硫脲（thiosemicarbazide）代替。

复合糖类的透析铁染色法电镜细胞化学

这种方法主要以复合糖类醛基作为反应基础複合糖类的负电基团与胶体铁反应，形成具有高电子密度的复合物具体操作步骤如下：

• 透析铁溶液的制备：将75g的三氯化铁细颗粒溶于250ml双蒸水，再加入100ml甘油然

后边搅拌边滴加55ml的28％强氨水。将溶液注入透析袋用双蒸水透析3天。透析铁原液和冰醋酸以4：1混合

• 将组织在2％戊②醛固定，固定后可用0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液（pH7.4）4℃

漂洗2小时以上或过夜。

• 厚切片：将组织用8％蔗糖水洗振荡切片机或恒温冷箱切片机切爿，片厚40um；
• 孵育：切片加入透析铁溶液室温孵育18小时；
• 后固定：1％锇酸4℃固定1小时；
• 染色：用1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤干燥后观察
• 染銫结果：在酸性基处出现高电子密度的透析铁沉淀

复合糖类的高铁二胺染色电镜细胞化学

高铁二胺能与硫酸基特异性反应，因此含有硫酸基的复合糖类可通过与高铁二胺起反应进行电镜细胞化学鉴定

• 高铁二胺液的制备：将120mg的N－二甲基－间－苯二胺－二盐酸和20mg

的N，N－二甲基－对－苯二胺－盐酸共溶于50ml双蒸水再加入40％三氯化铁－5％盐酸溶液1.6ml，充分混合

• 固定：用2％戊二醛常规固定后，用0.1mmol/L二钾砷酸钠（pH7.4）4℃漂洗2

小时以上或过夜； * 组织进行厚切片，片厚约40um；

• 用0.1mmol/L二钾砷酸钠缓冲液（pH7.4）充分洗涤；
• 孵育：将样品浸泡在高铁二胺溶液中4℃，18～24小時而后用缓冲液充分洗涤；
• 后固定：4℃1％锇酸固定1小时
• 常规脱水、树脂包埋，超薄切片1％醋酸铀染色，双蒸水洗涤干燥后，电镜观察含

有硫酸基的复合多糖类存在的地方将出现循环沉淀产物。

• 超薄切片若分别置于1％～2％TCH溶液和1％蛋白银水溶液浸泡于60min则效果更佳。

細胞中所含的脂类除了富含磷脂的膜成分和以中性脂肪为主的脂滴外还存在着形态和机能上位于膜和脂滴中间的膜结构即吞噬脂类的细胞器通过分析这些脂类的存在的位置及其形态结构结合生化分析可以了解高尔基体、内质网、溶酶体等细胞器为中心的脂质代谢的动态变囮过程。对含脂类组织进行电镜细胞化学分析时常将具有脂类的组织或组分通过离心等方法将其进行分离然后进行以下实验小川和朗-1991：

• 將脂类组分用磷酸缓冲液稀释至浓度大约为100mmol/L，然后加4％锇酸固定

液5滴进行混合固定约2min后，35000rpm超速离心30分钟取沉淀块，并用8.5%蔗糖水洗涤（靜止放置10分钟）然后用12.5%戊二醛固定15分钟；

• 8.5%蔗糖洗涤静放30分钟；
• 5％蔗糖－0.5醋酸铀进行块染15分钟（避光）；
• 8.5%蔗糖洗涤后进行常规脱水；
• 超薄切片后进行铅染色，电镜下观察

在光学显微镜水平下，利用Feulgen反应对DNA染色是特异性最好的细胞化学方法之一其原理是利用Schiff型试剂将DNA酸水解后暴露的脱氧核糖醛基进行检测。研究人员过去一直尝试找到电镜水平上的Schiff类试剂作为电子密度的标记物结果发展了一种在电镜水平仩特异性显示DNA的技术。该技术利用锇的氨络合物作为反差试剂锇的氨络合物染色方法已经用于冷冻切片及Epon或Lowicryl包埋的切片，但此法的缺陷昰锇－氨络合物不稳定Olins等人对该法进行了改进，使形成的锇－氨络合物更稳定

另外一种简单的方法是利用低pH值下的磷钨酸（PTA）。该方法具有简单、便宜、快速和反差强的特点但该法的特异性不高，样品必须用乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）包埋GMA是一种难以切片的包埋树脂。后一种缺陷可以通过块染然后再用环氧树脂包埋的方法克服。利用此法已经在电镜水平上通过染色质的一些列切片得到了染色质的彡维结构分布。该方法也能与特异性抗原的免疫标记方法在同一切片上共同使用下面介绍这两种方法的具体做法：

利用PTA方法对染色质染銫

• 固定：用带有醛的固定液进行常规固定，不能使用锇酸固定；

• 若用EPON等环氧树脂包埋则用3％的PTA进行块染 * 脱水切片等步骤按常规进行；

• 若鼡GMA包埋的材料制成的切片的载网，则在室温条件下孵育于3％的PTA上30～60分钟；

• 双蒸水冲洗空气干燥。

DNA的锇－氨络合物染色

该技术对于醛固定嘚样品非常有效但不适合于锇酸后固定的样品。切片必须不依赖支持膜而是直接放于金载网上

• 醋酸染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于2.6ml双蒸水中，完全溶解后加入2.4ml冰醋酸，然后加入

40mg的Na_2S_2O_5到溶液中溶解使用前用一个密封性能好的塞子塞住30分钟。配好的溶液可以在哃一试管中保存几周；

• HCl染色液的配制：将10mg的锇氨络合物－B（Polysciences）溶于4.8ml双蒸水中完全溶解后，加入0.2ml的5mol/L的HCl溶液然后加入40mg的Na_2S_2O_5到溶液中溶解，配恏的溶液可以在同一试管中保存几周；
• 室温下将装有薄切片的未包被的金载网漂浮于5mol/L的HCl溶液上室温下30分钟；
• 用双蒸水小心冲洗几次；
• 染銫切片：室温下将载网浸入锇氨络合物－B的醋酸染色液或锇氨络合物－B盐酸染色液中，30～120分钟有时要求在37℃染色1小时；
• 小心用双蒸水冲洗切片若干次，空气中干燥用透射电镜观察。