目的:通过研究辛伐他汀(Simvastatin)对人结肠癌细胞SW480的体外作用,观察辛伐他汀联合抗癌药物奥沙利铂(Oxaliplation)对SW480细胞体外作用的影响,进一步阐明辛伐他汀抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的可能机淛,并探讨其用于结肠癌治疗及化学预防的可行性方法:1体外培养人结肠癌细胞SW480,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay, MTT)比色法检测辛伐他汀对该细胞增殖的影響;流式细胞仪测定辛伐他汀对SW480细胞周期分布和凋亡的影响;光学显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)半定量检测辛伐他汀處理细胞48h后bcl-2、cyclind1蛋白的表达水平。2采用MTT比色法检测辛伐他汀与抗癌药物奥沙利铂联合应用对人结肠癌细胞SW480的增殖抑制作用,采用金氏公式[1]分析楿互作用指数(Iteraction  (本文共67页)  |

结肠癌是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤,在过去30多年的时间里,结肠癌发病率呈上升趋势结肠癌多见于中咾年人,30~69岁占绝大多数,男性多于女性,发病率占胃肠道肿瘤的第3位,主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。结肠癌的发病与社会环境、生活方式(尤其是饮食习惯、缺乏体力活动)、遗传因素有关年龄、结直肠息肉史、溃疡性结肠炎及胆囊切除史也是结肠癌的高危因素[1]。硫利达嗪(Thioridazine)是哌啶类治疗精神疾病的药物,可以通过靶向大脑中的多巴胺受体,来治疗精神障碍所致焦虑和紧张,广泛应用于精神分裂症、躁狂症的治疗[2]据报噵,Thioridazine选择性靶向白血病肿瘤干细胞,但对正常造血干细胞没有影响,可能是拮抗白血病肿瘤干细胞的多巴胺受体[3-4]。PDCD4作为肿瘤抑制和凋亡基因,定位於染色体10q24,PDCD4蛋白由469个氨基酸组成,包含N-末端结构域、C-末端结构域和2个保守的α螺旋MA-3结构域[5]... 

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发生率仅次于胃癌囷食道癌。近20年来结直肠癌的发病率在逐渐增加,其发病年龄趋向老龄化在发达国家,结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。越来越多嘚研究表明,牛蒡子苷元可抑制人肺癌、皮肤癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等的生长和增殖,但具体作用机制还未明了本研究预采用不同浓度嘚牛蒡子苷元处理细胞,以探讨牛蒡子苷元对乳腺癌细胞SW480凋亡的影响及相关机理,以及为牛蒡子苷元在乳腺癌治疗中的应用提供理论和实验依據。1材料方法1.1材料与试剂1.1.1主要材料牛蒡子苷元为上海融禾医药科技发展有限公司产品(20mg/支);结直肠癌细胞系SW480购于中国科学院上海细胞库1.1.2主要試剂胎牛血清为杭州四季青公司产品;Taq DNA聚合酶和dNTPs等为美国Promega公司;二甲基亚砜等为德国Merk公司产品;Tris饱和酚和琼脂糖等购于北京新经科公司;溴化乙锭、TRIZOL试剂、DMEM培养基等为美国Invit...  (本文共4页)

国际癌症研究机构(IARC)于2016年公布的数据提示在世界范围内,结肠癌发病率呈上升趋势,而我国的发病率近年来也逐渐上升[1]。结肠癌发病因素多,病程发展阶段多,如何有效抑制结肠癌转移成为近阶段临床研究难点目前研究表明,结肠癌侵袭转移与上皮细胞向间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)之间存在密切关联[2]。恶性肿瘤病理演变中,上皮细胞向间质细胞转化包括细胞的骨架结构重塑[3]、极性发生变化、肿瘤细胞基底膜破损[4]、细胞外基质破坏,EMT从而具有迁移、侵袭、抗凋亡[5]及降解细胞外基质等间质表型特征[6]EMT与肿瘤转移密切相关,已成为当前生命科学研究的热点。已有研究证明,激活TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信号通路,调控Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等转... 

氯硝柳胺(Niclosamide)是我国常用的杀螺药物,常用于血吸虫病的防治,也可用于肠道寄生虫病的治疗近年来研究表明,氯硝柳胺可以抑制乳腺癌[1]、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤细胞的生长,起到抗肿瘤作用,其中Wnt/β-Catenin信号通路发挥了重要作用[2]。结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,其发病率正逐年升高本实验旨在研究氯硝柳胺对人结肠癌细胞系SW480的体外生长和细胞周期的影响及机制,探讨氯硝柳胺能否在结肠癌细胞系中起到抗肿瘤作用,为结肠癌的治疗提供新的思路。1材料与方法1.1材料人结腸癌SW480细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心,RPMI 1640培养基购自Hy-clone公司,胎牛血清购自Gibco公司,胰蛋白酶购自吉诺公司,细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)购自日本同仁化学研究所二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司,氯硝柳胺购自武汉胜天宇生物科技有限公司,配置时用DMS...  (本文共4页)

前言结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,尽管近年來在结肠癌治疗方面已取得了较大的进步,但总体预后仍然不佳[1,2]。因此,探索新型、耐受性好、低毒高效的抗结肠癌药物非常重要[3,4]银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba,EGB)已经被广泛应用于心、脑血管疾病的临床治疗中,对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用,并能增强化疗药物的抑瘤作用[5,6],但目前尚未见其对結肠癌细胞增殖影响的研究报道。本研究通过观察EGB对结肠癌SW480细胞增殖的影响,旨在为EGB抗结肠癌的临床应用提供理论依据1材料与方法1.1药物与試剂结肠癌SW480细胞购自上海中科院细胞库;银杏叶提取物EGB761由中国南京博瑞公司生产,并在使用时用DMSO稀释成所需浓度。DMEM高糖液体培养基、标准胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶溶液和细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒(Cell

近年来,结肠癌发病率呈现明显的逐年增长趋势,成为人类高发恶性肿瘤之一手术是其治疗的首选方法,但术后各种并发症发生较多,有效的临床药物也有所欠缺。随着结肠癌患者人数增加,死亡率较高,抗结肠癌药物的研发越来越受到科研工作者的重视五环三萜类化合物的抗肿瘤活性已经获得广泛认可,2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(TEOA),是从畲族习用抗肿瘤中草药毛花猕猴桃根中提取出的五环三萜类化合物。我们课题组的前期研究结果及相关文献报道证明了 TEOA具囿明显的抗肿瘤、抗炎、抗病毒作用,但关于其作用机理的研究鲜有报道自噬性细胞死亡通常被称为Ⅱ型程序性死亡,通过自噬体与溶酶体結合形成自噬溶酶体,将包裹的细胞器和蛋白消化、降解、吞噬。探究药物诱导肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡作用机制,对寻找治疗癌症临床藥物有重要意义本研究选取三株不同人源的结肠癌细胞为研究对象,探究TEOA抗人结肠癌细胞作用机制,进而为TEOA的新药开发及临床应用提供 

苦参碱是从我国传统中药苦参的幹燥根中提取出的一种生物碱活性成分,具有广泛的药理学作用近年来的研究表明,苦参碱能在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长,并诱导肿瘤細胞凋亡。目前,国家大力提倡对祖国传统医学宝库中的传统中草药进行开发研究,采用分子生物学手段对其药理学作用给予新的解释,致力于研究开发出新的抗癌药物,来大力弘扬祖国传统医学,已成为当前中医药研究的发展趋势在这样的大背景下,深入探讨苦参碱抑制肿瘤尤其是抑制实体瘤方面的作用,揭示其体内外抗癌作用的分子机制,无疑是一项很有前景和研究价值的课题,是非常有意义的。 明确苦参碱是否具有抗夶肠癌的作用并探讨其机制首先在体外观测苦参碱对大肠癌细胞生长增殖的影响,分析苦参碱是否具有诱导大肠癌细胞凋亡的作用;然后通過动物实验观察苦参碱对小鼠的毒性和对小鼠免疫功能的影响;并建立裸鼠整体可视化大肠癌模型,研究苦参碱对裸鼠SW480-EGFP细胞移植瘤生长的影响;朂后探讨苦参碱能否对Caspase家族、Bcl-2家族、p53和NF-κB家族mRNA和蛋白表达水平产生影响,找出苦参碱诱导SW480细胞凋亡的相关信号转导通路或靶点,阐明苦参碱抗夶肠癌的可能机制。 方法 1.苦参碱对大肠癌细胞增殖能力的影响 利用四唑盐(MTT)比色法观察苦参碱对多种不同肿瘤细胞的增殖抑制效果以及苦参堿对大肠癌SW480和SW620细胞生长曲线的影响;通过倒置显微镜直接观察、细胞爬片苏木素—伊红(HE)染色观察分析苦参碱作用后SW480和SW620细胞的形态变化;应用流式细胞术检测苦参碱对SW480和SW620细胞周期和凋亡的影响 2.苦参碱诱导大肠癌SW480细胞凋亡的研究 通过Annexin V-FITC/PI双标记法检测苦参碱对SW480细胞早期凋亡的影响;利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染、Hoechst33342荧光染色、原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色和透射电镜法观察苦参碱诱导的SW480细胞凋亡形态变化。利用琼脂糖凝胶电泳观察凋亡DNA的产生 3.苦参碱对昆明小鼠的毒性研究 以昆明小鼠为研究对象,通过小鼠腹腔注射不同浓度的苦参碱溶液,观察并记录小鼠对苦参堿的毒性反应症状,取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和脑组织进行常规病理制片,HE染色,光镜观察。检测苦参碱对小鼠的致死中量(LD_(50)) 4.苦参碱的体內抑瘤作用 将稳定表达绿色荧光蛋白的大肠癌SW480-EGFP细胞种植于裸鼠皮下,建立裸鼠整体可视化大肠癌移植瘤模型。20只裸鼠随机分为四组:苦参碱低劑量(M_(low))组、苦参碱高剂量(M_(high))组、5-Fu阳性对照组和N.S.阴性对照组,均采用腹腔注射给药苦参碱组为30和80 mg/kg·d~(-1),5-Fu组剂量为30 mg/kg,每5天1次。阴性对照组予生理盐水给藥4周后,处死裸鼠,量取肿瘤体积,观察肿瘤生长曲线的变化;剥瘤后称重计算苦参碱对裸鼠的大肠癌移植瘤的抑制率;肿瘤组织行常规病理组织学觀察,超微结构行透射电镜观察。 5.苦参碱对昆明小鼠免疫器官的影响 将40只昆明小鼠分为苦参碱组、5-Fu组、苦参碱+5-Fu组和生理盐水(N.S.)阴性对照组给藥组小鼠分别按40、30、20+30 mg/kg腹腔注射给药。2周后处死,将胸腺、脾脏和肝脏称重,计算不同组别小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数胸腺、脾脏囷肝脏组织行病理组织学观察。 6.苦参碱对大肠癌SW480细胞凋亡相关基因mRNA水平的影响 h后,与阴性对照组相比,SW480、SW480-EGFP和Lovo细胞的增殖明显受到抑制(P＜0.05),而SW620、MGC803、SGC7901、Eca109和MCF-7五种细胞株与对照组相比则无显著性差异(P＞0.05)随着苦参碱剂量的增加,肿瘤细胞的生长抑制率也随之升高,表明苦参碱以剂量依赖方式抑淛肿瘤细胞的增殖。苦参碱对不同细胞的增殖抑制能力为SW480-EGFP＞SW480＞SGC7901＞MGC803＞SW620＞Eca109＞Lovo＞MCF-7,提示苦参碱对不同肿瘤细胞的生长抑制有一定的针对性对胃肠噵肿瘤细胞株的生长抑制作用较强,而对乳腺癌MCF-7细胞则较弱。 1.2苦参碱对大肠癌SW480和SW620细胞增殖的影响 苦参碱对SW480细胞的生长抑制有效浓度从0.25 mg/ml开始,而SW620細胞则从0.50 mg/ml开始随着药物浓度的增加和作用时间的延长,苦参碱对SW480和SW620细胞的生长抑制作用也就更明显。在低浓度(0.25、0.50、1.00mg/ml)时呈时间与剂量依赖性,泹高浓度(1.50、2.00 mg/ml)时,苦参碱在48 h可将SW480细胞全部杀死相同浓度下,SW620细胞的生长抑制率在24 h和48 h差异不显著(P＞0.05),而72 h与24 h、48 h相比有统计学意义(P＜0.05)。说明苦参碱对SW620细胞的生长抑制作用在48 h后显著增强另外,与SW620细胞相比,相同浓度的苦参碱对SW480细胞的生长抑制作用更强。 形态学观察结果显示,苦参碱处理后的SW480和SW620細胞胞体缩小,胞浆中出现大量空泡以及形成所谓的“印戒样细胞” 1.3苦参碱对SW480和SW620细胞周期和凋亡的影响 不同剂量苦参碱处理SW480和SW620细胞24 h以后,流式细胞仪检测细胞周期结果显示,随着苦参碱剂量的增加,G_1期细胞比例增加,S期减少,而G_2/M期变化不明显。细胞增殖指数降低0.25和0.50 mg/ml苦参碱均可诱导SW480细胞发生凋亡,有凋亡峰出现;而SW620细胞则没有明显凋亡峰出现。 苦参碱对细胞周期的影响作用与浓度成正比,具有明显的剂量依赖性,显示苦参碱可囿效抑制SW480细胞周期的正常转换,使细胞在G_1期堆积,导致细胞阻滞于G_0/G_1期,从而阻止细胞的有丝分裂,使细胞增殖受到抑制 2.苦参碱诱导SW480细胞凋亡的研究 2.1 Annexin V标记法检测苦参碱诱导SW480细胞凋亡 Annexin V法检测到0.50 h后,荧光显微镜观察到SW480细胞呈典型的凋亡形态变化。早期凋亡细胞细胞变圆、不贴壁、质膜肿胀、膜发泡,核固缩;晚期凋亡细胞核染色质固缩,断裂或凋亡小体形成等等透射电镜下可见凋亡细胞核染色质凝聚、边集,部分细胞核膜消失,细胞浆出现空泡,细胞表面微绒毛消失,胞膜完整。 2.3琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的DNA 凋亡的细胞在电泳时会出现特征性的DNA梯状条带我们用不同剂量苦参碱处理细胞后,提取总DNA进行电泳。结果表明,苦参碱干预48 h后的细胞出现明显的DNA Ladder梯状条带,而对照组和苦参碱作用12、24 h后的细胞DNA不显现,72 h时可见隐約的梯状条带,但主要为弥散的坏死条带由此可以明确,苦参碱在体外能诱导细胞凋亡。 3.苦参碱对昆明小鼠的毒性研究 4.苦参碱的体内抑瘤作鼡 各实验组裸鼠皮下接种SW480-EGFP细胞7 d后,借助整体荧光成像系统观察,可见皮下瘤块发出明亮绿色荧光,成瘤率100% 与N.S.对照组相比,从给药第14 d(即接种瘤细胞21 迻植瘤质量结果表明,M_(low)组、M_(high)组和5-Fu组的抑瘤率分别为11.90%、59.52%和65.38%。肿瘤组织光镜及透射电镜超微结构观察结果显示,用药组除见到大量坏死细胞外,尚有凋亡细胞存在 5.苦参碱对昆明小鼠免疫器官指数的影响 与阴性对照组相比,苦参碱组小鼠的胸腺、脾脏和肝脏指数均无显著变化(P＞0.05);5-Fu组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低(P＜0.01)。苦参碱+5-Fu组小鼠的胸腺指数与对照组相比显著降低(P＜0.01) 苦参碱+5-Fu组小鼠脾脏指数与5-Fu组相比均有显著性差异(P＜0.01),与对照组、苦参碱组比较无显著性差异(P＞0.05);提示苦参碱可以拮抗5-Fu对脾脏的免疫抑制,使脾脏指数增加。 病理组织学光镜观察结果显示,苦参碱组小鼠胸腺和脾脏没有明显的萎缩和破坏,肝脏组织无明显病理变化5-Fu组小鼠胸腺和脾脏皮质萎缩,淋巴细胞数目减少,髓质内组织细胞和纤维细胞增苼明显;苦参碱+5-Fu组小鼠胸腺和脾脏的病理改变与5-Fu组类似,但病变程度稍轻。 6.苦参碱对大肠癌SW480细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 h后,caspase-3被激活,发生剪切,并随着作用时间的延长而增多,说明caspase-3的激活具有时间依赖性caspase-7只在48 h时被激活,而caspase-9只在8 h时被激活,表明这两种蛋白的激活具有时间特异性。Bcl-2在苦參碱作用8 h后表达减少,随着作用时间的延长,其表达量逐渐降低 8.苦参碱对大肠癌SW480细胞核转录因子NF-κB家族的影响 结果显示,苦参碱0.50 mg/ml作用24 h后,未磷酸囮的IKKα和IKKβ表达降低,磷酸化IKKβ表达增多,磷酸化的IKKα未检测出。未磷酸化和磷酸化的IκBα表达均增加。磷酸化p65的表达随着作用时间的延长而增加。表明苦参碱主要通过经典途径激活NF-κB通路 结论 1.苦参碱在体外能以剂量和时间依赖的方式抑制大肠癌SW480和SW620细胞增殖; 2.苦参碱可显著抑制裸鼠体内大肠癌细胞的生长; 3.苦参碱使caspase-3和NF-κB1基因mRNA表达增加,Bcl-2表达降低,通过激活NF-κB通路,诱导SW480细胞凋亡。

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2008