本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验

2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板

2.2.3 1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B

2.2.4 阿氏液，配制方法参见附录C

A. 取96孔V形微量反应板用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排后四排的第1列孔再补加25 μL PBS。

B. 吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第1列孔中吹打3~5次充分混匀。

C. 从第1列孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2列孔中混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照

D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

E. 将反应板置于微量振蕩器上振荡1 min室温（20-25℃）静置45 min后观察结果，若环境温度过高可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果

A. 在红細胞对照孔出现正确结果的情况下，将反应板作45°倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒入侵抑制剂最大稀释度为该抗原的血凝滴度完全凝集的病毒入侵抑制剂的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

B. 最终结果取2倍、3倍倍比稀释抗原的血凝滴度的几何平均值

3.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。

3.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B

3.1.4 阿氏液，配制方法参见附录C

3.1.5 4单位抗原，制备方法参见附录D

3.1.6 HA效价高于10log2时可继续增加稀释的孔数。

A. 根据血凝试验结果配制4單位抗原以能引起100%血凝的病毒入侵抑制剂最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：假设抗原的血凝滴度为1:256（28）则4單位抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4），稀释时将1 mL抗原加入到63 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证（如附录D 4单位抗原的标定）后財可确定其稀释倍数用于血凝抑制效价的测定。

C. 在第1孔加入25 μL被检血清充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25 μL设第11孔为病毒入侵抑制剂对照，第12孔为红细胞对照

D. 在第1~11孔各加入25 μL 4单位抗原，轻叩反应板使反应物混合均匀，室温20-25℃下静置30 min

E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

F. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果

A. 在红细胞对照出现完全沉淀、病毒入侵抑制剂对照出现完全凝集的情况丅，将反应板作45°倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度

B. 当被检血清对其HI效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性

磷酸二氢钾（KH2PO4）

将上述成分依次溶解，用盐酸（HCl）调pH至7.2分装，121℃、15 min高压灭菌一经使用，于4℃保存不超过3周

采集至少3只2~6月龄SPF公鸡或无禽流感和禽流感抗体的非免疫鸡的抗凝血液与等量柠檬酸钠溶液混合，放入离心管中加入3~4倍体积的PBS混匀，鉯1500 r/min离心5~10 min去掉血浆和白细胞层，反复洗涤三次最后吸取压积红细胞用PBS配制成体积分数为1%的悬液，于4℃保存备用

加蒸馏水至100 ml，溶解过濾，分装121℃、30 min高压灭菌，4℃保存备用

根据血凝试验测定的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数并作复归试验。例如：病毒入侵抑淛剂2倍倍比稀释时的HA效价为9log23倍时的HA效价为8log2，其4个血凝单位为6log2~7log2则将病毒入侵抑制剂在96~128倍稀释。则可以假定90×，100×，110×，120×，130×为4HAU分别洅作2×、3×、4×、5×、6×稀释，每个4个孔并作红细胞和病毒入侵抑制剂对照，依此做一次血凝实验从而确定4单位抗原。判定时4×的半数100%凝集则为4单位抗原1个100%凝集说明稀释倍数偏大，3个100%凝集稀释倍数偏小

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1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒入侵抑制剂；

2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒入侵抑制剂的沉淀再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话可以建议使用Millpore公司的离心浓缩柱，Amicon系列的可以一次浓缩15ml样品)；

3、4℃过夜或放置一段时间；

4、8000/min离心30分钟，收集病毒入侵抑制剂沉淀；

5、将病毒入侵抑制剂沉淀加入适量的pbs中4℃过夜；

6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒入侵抑制剂。

还可以用梯度离惢或其他方法进一步纯化

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