TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系建立及其在大豆基因功能分析中的应用--《河北农业大学》2015年硕士论文
TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系建立及其在大豆基因功能分析中的应用
【摘要】：病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。为了将烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术应用于对大豆基因的功能研究,本试验建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并利用该体系对大豆中与大豆抗大豆花叶病毒(SMV)相关的胼胝质合酶基因(Gm Cal S7)和与大豆抗盐性相关的Na+-H+逆向转运蛋白基因(Gm NHX1/Gm NHX5)进行了功能分析。试验获得的主要结果如下:1.选用大豆八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因为标记基因,首先构建了该基因的沉默载体TRV:Gm PDS,向大豆叶片注射携带有TRV:Gm PDS的农杆菌,在注射后第25天,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中Gm PDS基因被有效沉默。2.向大豆叶片注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,发现先接种TRV对大豆接种SMV的抗性表现没有影响。3.构建了Gm CalS7基因的沉默载体TRV:Gm Cal S7,向大豆叶片注射携带有TRV:Gm Cal S7的农杆菌,以注射只携带TRV的农杆菌作对照,在注射后第25天:1)取第二轮复叶做半定量RT-PCR分析,注射TRV:Gm Cal S7的植株中Gm Cal S7被有效沉默。2)对转基因植株接种大豆花叶病毒(SMV)株系N3,在接种SMV后96h,在荧光显微镜下检测转基因植株的胼胝质。Gm Cal S7沉默植株的胼胝质较对照植株明显减少。3)转基因植株接种SMV株系N3的当位叶均能检测到SMV的外壳蛋白基因CP的表达,在Gm Cal S7沉默植株的未接种上位叶片中也能够检测到极微量CP,而对照组植株未检测到CP。结果表明,Gm Cal S7沉默后,胼胝质合成减少,N3病毒向上位叶传播。4.构建GmNHX1基因和GmNHX5基因的沉默载体TRV:GmNHX1和TRV:Gm NHX5,采用水培方法分别向大豆根部接种携带TRV:Gm NHX1或TRV:Gm NHX5的农杆菌,以接种TRV为对照,在接种病毒后的第7天:1)取第一位真叶做半定量RT-PCR分析,接种TRV:Gm NHX1或TRV:Gm NHX5的植株中Gm NHX1基因和Gm NHX5的表达量较对照明显降低,表明Gm NHX1和Gm NHX5基因被有效沉默。2)以200 mmol/L浓度的Na Cl对转基因植株进行盐处理,处理后1h,Gm NHX1或Gm NHX5沉默植株较对照明显萎蔫。本试验以TRV为载体,以大豆PDS为指示基因,建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明该体系可以用于对大豆基因的功能研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：河北农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S565.1【目录】：
摘要5-6Abstract6-101 引言10-132 试验材料13-15 2.1 植物材料13 2.2 毒源13 2.3 试验中使用的菌株13 2.4 试验中所使用的培养基以及营养液13-153 试验方法15-25 3.1 植物材料培养以及病毒接种方法15 3.2 引物设计15-17 3.3 VIGS载体构建17-22
3.3.1 健康大豆J7 叶片总RNA的提取17
3.3.2 cDNA的合成17-18
3.3.3 特异性扩增目的基因18
3.3.4 PCR产物双酶切18-19
3.3.5 酶切产物回收19
3.3.6 回收的PCR产物连接pTRV-RNA2 载体19-20
3.3.7 连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α20
3.3.8 提取质粒20-21
3.3.9 质粒双酶切验证及送测序21
3.3.10 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备21
3.3.11 阳性克隆质粒转化农杆菌GV3101 感受态细胞21-22 3.4 沉默大豆GmCalS7 基因再接种N3 病毒后观察胼胝质22-23
3.4.1 大豆叶片注射农杆菌准备22
3.4.2 大豆叶片接种TRV：GmPDS后表型观察及RNA提取22-23
3.4.3 大豆叶片接种TRV：GmCalS7 后半定量检测目的基因的表达23
3.4.4 大豆叶片第二轮复叶接种SMV株系N3 后对胼胝质进行荧光显微镜观察23 3.5 沉默大豆GmNHX1 基因，GmNHX5 基因后检测植株耐盐性23-254 试验结果25-37 4.1 指示基因VIGS载体的构建以及半定量检测25-27
4.1.1 大豆GmPDS基因的克隆与构建载体的验证25
4.1.2 指示基因沉默后的表型观察以及半定量检测25-27 4.2 大豆品种接种TRV病毒对SMV侵染的影响27-29 4.3 GmCalS7 基因VIGS载体的构建以及相关检测29-32
4.3.1 大豆GmCalS7 基因的克隆与构建载体的验证29-30
4.3.2 GmCalS7 基因沉默后的半定量检测30
4.3.3 转基因植株接种N3 病毒后胼胝质荧光显微镜观察30-31
4.3.4 转基因植株接种N3 病毒的当位叶以及上位叶CP检测31-32 4.4 GmNHX1 基因以及GmNHX5 基因VIGS载体的构建以及相关检测32-37
4.4.1 大豆GmNHX1 基因的克隆与构建载体的验证33
4.4.2 指示基因沉默后的表型观察以及半定量检测33-34
4.4.3 GmNHX1 基因沉默后半定量检测以及耐盐性观察34
4.4.4 大豆GmNHX5 基因的克隆与构建载体的验证34-35
4.4.5 GmNHX5 基因沉默后的半定量RT-PCR分析检测以及耐盐性观察35-375 讨论37-396 结论39-407 参考文献40-43作者简介43-44在读期间发表的学术论文44-45致谢45-46
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京公网安备75号TRV介导的马铃薯基因瞬时沉默体系建立及部分抗病相关基因功能初步鉴定--《华中农业大学》2010年硕士论文
TRV介导的马铃薯基因瞬时沉默体系建立及部分抗病相关基因功能初步鉴定
【摘要】：病毒诱导的基因沉默(VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默(PTGS)现象。随着后基因组学的到来,VIGS作为一种快速、高通量研究基因功能的方法,已在茄科等植物中应用。马铃薯中用于基因沉默的载体有PVX和TRV病毒载体,但在应用中存在一些困难,例如马铃薯基因型、材料状态以及环境条件都对基因沉默效果有较大影响。本研究以烟草脆裂病毒(TRV)为沉默载体,通过不同基因型筛选以及接种方法和环境条件的优化,建立了比较理想的马铃薯TRV病毒介导的VIGS沉默体系,为马铃薯晚疫病抗性相关基因的快速功能鉴定奠定了技术平台。取得的研究结果如下：
1.通过控制环境温度(20-24℃)和相对湿度(75%左右)在烟草中成功沉默了马铃薯PDS基因。基于烟草VIGS体系,本实验从131个马铃薯基因型中筛选出3个适宜TRV体系的比较理想的基因型,分别为AC285、AC079和AC029。筛选出的3个基因型的马铃薯植株接种TRV-PDS病毒载体后,对病毒的免疫现象不明显,症状比较温和,叶片在病毒浸染后,都出现了不同程度的白化症状,表明这3个马铃薯基因型可用于VIGS体系研究。
2.TRV载体最常用的接种方法是叶片注射法。本实验在马铃薯上首次尝试了茎部注射法,比较了叶片注射法和茎部注射法对马铃薯植株接种的效果,发现茎部注射法更利于马铃薯植株中基因的沉默。
3.温度和湿度是影响VIGS体系基因沉默的重要因素。实验选取了3个不同的温度5-9℃,20-24℃,28-30℃和2个不同的相对湿度30%和75%进行实验,发现温度在20-24℃,湿度为75%时马铃薯植株白化现象明显；温度20-24℃,湿度为30%时,植株2个月后无白化现象；而温度5-9℃,湿度分别为75%和30%时接种TRV-PDS病毒,2个月后植株都没出现白化症；温度为26-30℃,湿度为75%或30%时接种TRV-PDS病毒1个月后有白化症状出现,但是白化症状不会扩展,且白化叶片逐渐恢复绿色。
4.选取在培养基中分别培养20 d、30 d和40 d的试管苗移栽于营养钵土壤中,生长3个星期后进行TRV-PDS病毒载体接种,结果表明,培养20 d的试管苗接种1星期后,接种部位以上全部坏死；培养30 d的试管苗接种15 d左右开始出现白化症状且不断扩展；培养40 d的试管苗接种一个月后仅仅在几片嫩叶上出现白化症状,一周以后白化症状逐渐消失。
5.实验选取生长势基本一致的试管苗和实生苗分别移栽于营养钵土壤中,生长3个星期后接种TRV-PDS病毒载体,结果表明试管苗接种2个月后新生叶片还在继续白化。实生苗接种TRV-PDS病毒载体1个月后,新生叶片出现白化症状,但是2个月后,新生叶片不再白化,且原有白化症状逐渐消失。这些结果表明,试管苗比实生苗更易发生基因沉默现象,且维持时间比实生苗更持久。
6.用本研究建立的基因沉默体系,尝试对30个EST片段在马铃薯上进行沉默,沉默效果检测显示,有10个基因发生了不同程度的沉默。基因片段沉默效果好的叶片进行晚疫病菌接种,W4、W6和08-H02三个基因片段沉默后叶片病斑面积高于对照,而W2、W3、0-A04、05-E05、06-A01、05-F11和08-E10基因片段沉默叶片的病斑面积低于对照。因此,初步推测W4、W6和08-H02基因在马铃薯抗晚疫性中可能提高植株抗性,而W2、W3、10-A04、05-E05、06-A01、05-F11和08-E10基因可能降低植株抗性。
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：S532【目录】：
摘要6-8Abstract8-101 前言10-21 1.1 病毒诱导基因沉默现象的发现与VIGS的提出10-11 1.2 VIGS技术的原理和机制11-15
1.2.1 VIGS沉默机制11-13
1.2.2 VIGS的技术原理13-15 1.3 植物基因功能基因组VIGS技术常用病毒载体系统及其特点15-17
1.3.1 RNA病毒载体15-17
1.3.2 DNA病毒载体17
1.3.3 卫星病毒载体17 1.4 VIGS应用于植物功能基因研究的进展17-19
1.4.1 VIGS技术的优点和不足17-19
1.4.1.1 VIGS技术的优点17-18
1.4.1.2 VIGS技术的不足18-19
1.4.2 应用实例19 1.5 本课题的提出及研究意义19-212 材料与方法21-31 2.1 实验材料21-25
2.1.1 植物材料21-22
2.1.2 晚疫病原菌22
2.1.3 选取基因22-25
2.1.4 菌株和质粒及分子生物学相关试剂25 2.2 实验方法25-31
2.2.1 碱裂解法制备质粒DNA25-26
2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化26-27
2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备及转化27
2.2.4 大肠杆菌重组子的酶切和连接27-28
2.2.5 农杆菌阳性克隆的PCR鉴定28-29
2.2.6 农杆菌侵染马铃薯植株29
2.2.7 病毒、病原菌接种29-30
2.2.8 Trizol法小量提取马铃薯叶片的RNA30
2.2.9 反转录PCR反应(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)30-313 结果与分析31-41 3.1 烟草PDS基因沉默植株的表型及VIGS体系的建立31-32 3.2 马铃薯基因型的筛选32-33 3.3 基因沉默瞬时表达体系的优化33-36
3.3.1 接种方法对基因沉默效率的影响33-34
3.3.2 植株的生长状态对基因沉默效果的影响34
3.3.3 试管苗、实生苗材料对基因沉默的效率的影响34-35
3.3.4 温度和湿度对基因沉默效率的影响35-36 3.4 利用VIGS研究马铃薯部分基因功能36-41
3.4.1 病毒载体的构建36-38
3.4.1.1 大肠杆菌重组子的质粒提取、纯化及酶切鉴定36-37
3.4.1.2 重组病毒载体的农杆菌的PCR鉴定37-38
3.4.2 部分基因沉默叶片目的基因沉默效果分析38-39
3.4.3 基因沉默株系叶片晚疫病抗性分析39-414 讨论41-44 4.1 马铃薯不同基因型对VIGS的影响41 4.2 温度与湿度41-42 4.3 植株生长状态42 4.4 试管苗与实生苗42-43 4.5 接种方法43 4.6 基因沉默的效率43-44参考文献44-53附录53-58致谢58
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TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用
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TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立
【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系，为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus， TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段，并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中；向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌，注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察，并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现，在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d，再分别接种SMV株系N3和SC-8，以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d，上部未接种病毒的叶片出现了白化现象，通过半定量RT-PCR分析，发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上，向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV，SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3，与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致，对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测，发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8，以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系，并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。
Abstract：
Objective]Virus-induced gene silencing (VIGS) technology has been widely applied in the field of functional gene research in plants.Tobacco rattle virus-mediated gene silencing technology was used in the interaction between soybean and soybean mosaic virus (SMV) for gene function evaluation, and a TRV-mediated gene transient silence system in soybean was established.[Method]Soybean cv. Jidou 7 (J7) was used as material, and specifically amplified part of theGmPDS gene fragment from J7 leaves, and then was inserted into the plasmid pTRV: RNA2; TheAgrobacterium carried with TRV or TRV:GmPDS were injected into the first true leaves of J7. After that, the upper non-inoculated leaves were observed andGmPDS gene’s expression level was confirmed by semi-quantitative RT-PCR analysis. In order to investigate the effect of inoculation with TRV on the resistance of soybean to SMV infection, the first true leaves of soybean inoculated with TRV for 10 days , then were inoculated with SMV strain N3 or SC-8. The control treatments were conducted by inoculating N3 or SC-8 alone. At 5 days after inoculating SMV, the&phenotypes of upper uninoculated leaves were observed and SMV coat proteinCP was detected.[Result]At 25 days after injected withAgrobacterium suspension carrying TRV: GmPDS intothe first true leaves, the upper uninoculated leaves showed whitening phenotype and expression level ofGmPDSwas decreased significantly by semi-quantitative RT-PCR analysis. Based on this, soybean leaves injected withAgrobacterium suspension (carrying TRV) were then inoculated with SMV. J7 and SMV strains N3 and SC-8 were used to constitute incompatible and compatible combinations. Inoculated with TRV and then with SMV strains N3 or SC-8, the phenotype of upper uninoculated leaves were consistent with the upper leaves after inoculated with SMV alone. Leaves were taken for viral coat proteinCP test. It was found that when inoculated with N3 alone, or pre-inoculated with TRV and then inoculated with N3, the coat proteinCP was not detected on the upper leaves. If inoculated with SC-8 alone, or pre-inoculated with TRV and then inoculated with SC-8, the viral coat proteinCP was detected on the uninoculated upper leaves. These results showed that the TRV had no influence on the performance of soybean resistance to SMV. The similar results were got on susceptible cv. Nannong 1138-2.[Conclusion]The TRV-VIGS system in soybean was established in this experiment. The TRV has no influence on the performance of soybean resistance to SMV.
LIU Xiao-bin
LI Fu-kuan
WANG Dong-mei
作者单位：
河北农业大学生命科学学院,河北保定,071001
年，卷(期)：
Keywords：
在线出版日期：
基金项目：
国家自然科学基金
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