基因表达与调控_甜梦文库
基因表达与调控
1.信号肽：SD 序列（核糖体结合位点） 合位点或 SD 序列.原核生物起始密码上游的一段保守序列可与 16S rRNA 的 3’ 端序列配对，称为核糖体结2. 信号肽：某些分泌型蛋白质、膜蛋白和一些细胞器膜上的蛋白质等在核糖体上合成后，其 N端通常含有约15个疏水性氨基酸组成 的肽段，称为信号肽，其作用是使合成该肽的核糖体与内质网上的受体结合。使生长中的肽链穿过内质网膜，进入内质网的内腔。 3 反式作用因子 (trans-acting factor)能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件 8～12 bp 核心序列上， 参与调控靶基因转录效率的一 组蛋白质。①通用转录因子：普遍存在的转录因子。②组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性有很大关系。③诱导性反式作 用因子：活性能被特异的诱导因子所诱导。 4.操纵子: 操纵子 operon:多个功能相关的结构基因成簇串联排列，与上游共同的调控区和下游转录终止信号组成的基因表达单位。 基因打靶：基因同源重组技术称为基因打靶(gene targeting），是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在 生物活体内研究此基因的功能。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，基因打靶技术将广泛应用于基因功能研 究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。 基因治疗：将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。基因治疗分体细胞(somatic cell) 基因治疗(1)只限于某一体细胞的基因的改变(2)只限于某个体的当代；生殖细胞(germline)基因治疗: (1)对缺陷的生殖细胞进行矫正 (2)当代及子代 基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息，经过转录、翻译等一系列过程，合成具有特定的生物学功能和生物学效应 的 RNA 或蛋白质的全过程。特点：时间特异性（发育阶段特异性）和空间特异性（组织细胞特异性） 。基因表达的方式：a 基本（组 成性）表达如管家基因 b 诱导和阻遏表达(诱导、阻遏表达和协调表达) 逆转录：逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，又称反转录。 基因组：一个细胞或病毒的全部遗传信息； 一套完整的单倍体的遗传物质的总合；含有一种生物的一整套遗 传信息的遗传物质 管家基因:是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因 与核糖体蛋白基因等。 核酸杂交:核酸杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测 DNA 或 RNA 分子的特定序列（靶序列） 。经典的核酸杂交方法是将 DNA 或 RNA 先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链 DNA 或 RNA 探针用放射性或非放射性标记，在膜上杂交时， 探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针. 经典的核算杂交方 法主要包括：DNA 印迹杂交（Southern blot）RNA 印迹杂交(Northern blot)以及斑点杂交和原位杂交： 1、 DNA 印迹杂交（DNA blot hybridization）――有两种核酸印迹法： 将 DNA 或 RNA 溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上（斑点或狭线印迹） 经琼脂糖凝胶电泳将片段的 DNA 或 RNA 转移到膜上（Southern 和 Northern 印迹法） 。DNA 在电泳前先用限制性内切酶消化。 2、 RNA 印迹杂交（RNA blot hybridization） ： RNA 印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总 RNA 或 mRNA 特定靶序列的技术。 3、 斑点杂交:将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏 氟乙烯（PVDF）与 DNA 结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用手工点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针 显色。可用于 DNA 或 RNA 分析。 4、 原位杂交 在保持细胞形态条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。可用于 DNA 或 RNA 分析。荧光原位杂交（FISH）进行染色体 DNA 分析可 用于生物学研究的许多领域以及临床细胞遗传学研究。其主要优点是不仅可以在细胞分裂的中期，而且可在分裂间期核中诊断染色体 的变化。 简答： 1.DNA 复制的特点及要点 2.G-蛋白相关的细胞信号通路及意义 3.蛋白质组的概念及有什么研究意义？4.DNA 损伤的分类，体 内有几种修复系统？ 冈崎片段: 1968 年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到 DNA 复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为 冈崎片段。 多克隆位点（multiple cloning site, MCS） ，是包含多个（最多 20 个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的 DNA 序列。也称 为多位点接头（polylinker） ，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。MCS 中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们 在一个特定的载体质粒中只出现一次。 micro RNA 分子伴侣:87 年 Lasky 首先提出了分子伴侣（molecular chaperones）的概念。他将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装 的核质素（ nucleoplasmin ）称为分子伴侣。 D一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份‖。热休克蛋白就是一大类. 二、简答 蛋白质四级结构 真核转录调控点：1、转录起始水平。这一环节是调控的最主要环节，由对基因转录活性的调控来完成，包括基因的空间结构、折叠状态、DNA 上的调 控序列、与调控因子的相互作用等。 a. 活化染色质：在真核生物体内，RNApol 与启动子的结合受染色质结构的限制，需通过染色质重塑来活化转录。常态下，组蛋白可使 DNA 链形成核小体结构而抑制其转录，转录因子若与转录区结合则基因具有转录活性。因而基础水平的转录是限制性的，核小 体的解散是必要前提，组蛋白与转录因子之间的竞争结果可以决定是否转录。组蛋白的抑制能力可因其乙酰化而降低。另外，由于端 粒位置效应或中心粒的缘故，抑或是收到一些蛋白的调控，真核生物细胞可能出现 10%的异染色质，异染色质空间上压缩紧密，不利 于转录。 b. 活化基因： 2、转录后水平。真核生物 mRNA 前体须经过 5’-加帽、3’-加尾以及拼接过程、内部碱基修饰才能成为成熟度的 mRNA，加帽位点与 加尾位点、拼接点的选择就成了调控的手段。 a. 5’-加帽：几乎所有的真核生物和病毒 mRNA 的 5’端都具有帽子结构，其作用为保护 mRNA 免遭 5’外切酶降解、为 mRNA 的核输 率。实验证实，对于通过滑动搜索起始的转录过程来说，mRNA 的翻译活性依赖出提供转运信号和提高翻译模板的稳定性和翻译效 于 5’端的帽子结构。 b.3’-加尾：3’UTR 序列及结构调节 mRNA 稳定性和寿命表观遗传学:就是不改变基因的序列，通过对基因的修饰来调控基因的表达。基因表达的表观遗传学调控，就是通过各种表观遗传的修 饰方式来对基因进行调控。目前，已知的表观遗传现象有：DNA 甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting）， 母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和 RNA 编辑（RNA editing）等 组学概念及举例: 分子生物学中， 组学(Omics)主要包括基因组学 （Genomics） ， 蛋白组学 （Proteinomics） ， 代谢组学 （Metabolomics） ， 转录组学(transcriptomics） ，脂类组学（lipidomics） ， 免疫组学（Immunomics） ，糖组学（glycomics ）和 RNA 组学(RNomics)学等。 例如 Genomics（基因组学）是构成生物体所有基因的组合，这门学科就是研究这些基因以及这些基因间的关系。 蛋白组学:“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水 平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生， 细胞代谢等过程的整体而全面的认识. 一、酵母双杂交系统 是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白 结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之 则两者之间没有相互作用。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的 DNA 序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若 含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量 及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性 等优点。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄 膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂 类、DNA 和 RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。 提出了一种定量测量 FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱 消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量 FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于 GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。 蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变， 微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这 些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 六、免疫共沉淀技术其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于 Pansobin 珠上的金黄色葡萄球菌蛋 白 A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白―兴趣蛋白―抗兴趣蛋白抗体 ―SPA\|Pansobin”，因为 SPA\|Pansobin 比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又 被分开。然后经 Western blotting 法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴 趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可 能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不 到结果，方法本身具有冒险性。 三、问答 蛋白质的修饰定义，类型及功能 1.氨基端和羧基端的修饰 在原核生物中几乎所有蛋白质都是从 N-甲酰蛋氨酸开始，真核生物从蛋氨酸开始。甲酰基经酶水介而除去，蛋氨酸或者氨基端的 一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水介除去。包括除去信号肽序列。因此，成熟的蛋白质分子 N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。同时， 某些蛋白质分子氨基端要进行乙酰化在羧基端也要进行修饰。 2.共价修饰 许多的蛋白质可以进行不同的类型化学基团的共价修饰，修饰后可以表现为激活状态，也可以表现为失活状态。 （1）磷酸化：磷酸化多发生在多肽链丝氨酸，苏氨酸的羟基上，偶尔也发生在酪氨酸残基上，这种磷酸化的过程受细胞内一种蛋 白激酶催化，磷酸化后的蛋白质可以增加或降低它们的活性，例如：促进糖原分解的磷酸化酶，无活性的磷酸化酶 b 经磷酸化以后， 变居有活性的磷酸化酶 a。而有活性的糖原合成酶 I 经磷酸化以后变成无活性的糖原合成酶 D，共同调节糖元的合成与分介。 （2） 糖基化： 质膜蛋白质和许多分泌性蛋白质都具有糖链， 这些寡糖链结合在丝氨酸或苏氨酸的羟基上， 例如红细胞膜上的 ABO 血型决定簇。也可以与天门冬酰胺连接 （3）羟基化：胶原蛋白前 α 链上的脯氨酸和赖氨酸残基在内质网中受羟化酶、分子氧和维生素 C 作用产生羟脯氨酸和羟赖氨酸， 如果此过程受障碍胶原纤维不能进行交联，极大地降低了它的张力强度。 （4）二硫键的形成：mRNA 上没有胱氨酸的密码子，多肽链中的二硫键，是在肽链合成后，通过二个半胱氨酸的疏基氧化而形 成的，二硫键的形成对于许多酶和蛋白质的活性是必需的。 3.亚基的聚合：有许多蛋白质是由二个以上亚基构成的，这就需这些多肽链通过非共价键聚合成多聚体才能表现生物活性。例如成人 血红蛋白由两条 α 链，两条 β 链及四分子血红素所组成，大致过程如下：α 链在多聚核糖体合成后自行释下，并与尚未从多聚核糖体 上释下的 β 链相连，然后一并从多聚核糖体上脱下来，变成 α、β 二聚体。此二聚体再与线粒体内生成的两个血红素结合，最后形成一 个由四条肽链和四个血红素构成的有功能的血红蛋白分子。 4.水解断链：一般真核细胞中一个基因对应一个 mRNA，一个 mRNA 对应一条多肽链，但也有少数的情况，即一种翻译后的多肽链经 水解后产生几种不同的蛋白质或多肽。例如哺乳动物的鸦片样促黑皮激素原初翻译产物为 265 个氨基酸，它在脑下垂体前叶细胞中， POMC 初切割成为 N-端片断和 C 端片段的 β-促脂解激素。然后 N 端片段又被切割成较小的 N 端片断和工 9 肽的促肾上腺皮质激素。 而在脑下垂体中叶细胞中， β-促脂解激素再次被切割产生 β-内啡肽； ACTH 也被切割产生 13 肽的促黑激素 （α-melanotropin） （图 18-21） 模式生物学就是利用模式生物来研究生物学问题的学科。由于生物进化的保守性，在某一种生物内的生物过程很可能在高等生物（例 如人）中也是类似甚至完全一样的。因此研究人员可以利用一些技术上更容易操作的生物来研究高等生物的生物学问题。 最常见的模式生物有：逆转录病毒，大肠杆菌, 酵母，果蝇，斑马鱼，小鼠（mouse）等 非受体酪氨酸磷酸酶在乳腺恶性肿瘤中升高，请设计实验探讨此酶在恶变、转移中的作用结合自身，分子生物学在医学中的应用 生命科学的发展过程：整体、细胞、分子 分子生物学：从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴学科。是生命科学中发展最快并且与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域。 分子医学（molecular medicine） ：由于分子生物学渗透进入生物学和医学的每一分支领域，全面推动了生命科学和医学的发展，如疾 病的发病机理研究、疾病的诊断和治疗，使医学进入了一个崭新的时代。 基因工程和蛋白质工程：外源 DNA 与载体在体外进行连接，或在基因水平上进行有目的的定向诱变。 分子生物学的主要研究内容：生物大分子的结构、功能，生物大分子之间的相互作用及其与疾病发生、发展的关系。主要包含三个方 面的内容： （一）核酸分子生物学 （二）蛋白质分子生物学 （三）细胞信号转导机制研究 核酸的分子生物学：主要研究核酸的结构与功能。核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此形成了分子遗传学。 5．DNA 序列分析技术 人类基因组计划（human genome project, HGP） ：美国科学家、诺贝尔奖获得者 Dulbecco R 于 1986 年在美国《Science》杂志上发表 的短文中率先提出，并认为这是加快癌症研究进程的一条有效途径。主要的目标是绘制遗传连锁图、物理图、转录图，并完成人类基因组全部核苷酸序列测定。测出人体细胞中 24 条染色体上全部 30 亿对核苷酸的序列，把所有人类基因都明确定位在染色体上，破译 人类的全部遗传信息。 HGP 是人类自然科学史上与曼哈顿原子弹计划和阿波罗登月计划相媲美的伟大科学工程。 小分子 RNA： 1993 年， Lee 等发现线虫(C. elegans) lin-4 基因编码的小分子 RNA， 其长度为 22～61 个核苷酸， 能与 lin-14 mRNA 的 3′ 非翻译区（UTR）反义互补结合,阻断 lin-14 的翻译，降低线虫早期发育阶段 lin-14 蛋白的水平。这是继核酶以后，内源性 RNA 参与基 因调节的又一证据。 ? ? RNA 干扰（RNAi）是一种由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链 RNA 有同源序列的 mRNA 被降解，从而 抑制了该基因的表达。 RNA 干扰过程主要有 2 个步骤： （1）长双链 RNA (dsRNA)被细胞内 Dicer 切成 21～25 个碱基对的短双链 RNA，称为小干扰 性 RNA (siRNA)。 （2）siRNA 与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体― RISC， RISC 可识别与 siRNA 有同源序列的 mRNA， 并在特异的位点将该 mRNA 切断或者抑制蛋白质翻译。 人类对疾病的认识： 1.从机体表型来认识疾病,即根据现象和检查所获知的症状与体征。 2.从组织细胞的病理、生理变化来分析和诊断疾病。 使人类积累了十分丰富的医学资料，但都不能从本质上真正认识疾病发生的根本原因，更不能从根本上治愈疾病和阐明疾病的发 病机制 基因诊断：在 DNA 水平或 RNA 水平,应用核酸分子杂交技术、限制性内切酶长度多态性（RFLP）连锁分析、PCR 技术、DNA 序列 分析技术以及近年发展起来的 DNA 芯片技术等,对人类疾病进行诊断 狭义基因治疗：目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作 用。广义基因治疗：通过基因转移技术，使目的基因在细胞内得到表达，封闭、剪切致病基因的 mRNA，或自杀基因产物催化药物前 体转化为细胞毒性物质，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗疾病的目的 中心法则 The Central Dogma：是指遗传信息从 DNA 传递给 RNA，再从 RNA 传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。 也可以从 DNA 传递给 DNA，即完成 DNA 的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的 RNA 自我复制能 以 RNA 为模板逆转录成 DNA 的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。 Telomere：是线状染色体末端的 DNA 重复序列。染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。 核定位信号 nuclear localization signal, NLS：是一种形式的信号肽, 可位于多肽序列的任何部分。一般含有 4～8 个氨基酸, 且没有专一 性, 作用是帮助亲核蛋白进入细胞核。入核信号与导肽的区别在于: ①由含水的核孔通道来鉴别; ②入核信号是蛋白质的永久性部分, 在引导入核过程中,并不被切除, 可以反复使用, 有利于细胞分裂后核蛋白重新入核。 .Splicesome 剪接体：进行 hnRNA 剪接时形成的多组分复合物, 主要是有小分子的核 RNA 和蛋白质组成 Protein Motif 1.一个基因有哪些结构组成？ 2.基因、基因组、染色体的关系？ 4.内含子的生物学意义？ 5.什么是蛋白质泛素化？其生物学意义是什 么？ 泛素是一类低分量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。一些特殊的酶将细胞内的蛋 白质分类,从中选出靶蛋白分子。这些酶包括泛素激活酶，结合酶、连结酶和降解酶等系列的修饰过程。它在蛋白质的定位、代谢、功 能、调节和降解中都起着十分重要的作用。参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、 炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。在肿瘤、心血管等疾病发病中起着十分重要作用。它是近年来生物化学研究的一个重大成果， 亦是研究、开发新药物的新靶点。 6.蛋白质纯化的方法？蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将 组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法:这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法:这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不 宜采用此法。4. 超声波法 :使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 :如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提:通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的 pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据 欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等） ，使膜结构破 坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得:选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异 进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法:不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2. 盐析法:不 同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并 能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法:中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的 溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不 稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化:用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定 纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较 高纯度的蛋白质样品。 7.MicroRNA 是什么？它如何发挥作用？ MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表 达调控。到目前为止， 在动植物以及病毒中已经发现有 4361 个 miRNA 分子(Release 910 , October 2006) 。大多数 miRNA 基因 以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中 miRNA 和 siRNA 之间的关系：从表面上说，一个是非编码的单链小分子 RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不 影响转录本的稳定性；另一个是针对编码区的双链小分子 RNA，每个转录本都可能有很多个 siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后 调控基因表达。由于每个 mRNA 模版可能产生很多个 siRNAs，要给每个 siRNA 定一个基因的名字就很困难。miRNA 是进化进程中 高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容 易造成混乱。 8.什么是全基因组关联研究？其目的是什么？ 全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）是指在全基因组层面上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与 疾病的关联研究，是通过对大规模的群体 DNA 样本进行全基因组高密度遗传标记（如 SNP 或 CNV 等）分型，从而寻找与复杂疾病 相关的遗传因素的研究方法，全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基因。 三．问答题： 1.不同种类的细胞其基因组相同，为什么表达蛋白质的种类和浓度不同？ 2.用分子生物学知识，谈谈疾病发生机制？ 3.有一块肿瘤标本和其周围组织，设计一个实验证明细胞中蛋白质的作用？ 4.目前，基因靶点研究已成为新药开发的用药部分，结合目前药物靶点在新药开发中的应用，谈谈你的建议和观点？ 转录酶：依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 DNA dependent RNA polymerase 1 基因与基因组 1 基因:编码 RNA 或一条多肽链的 DNA 片段，包括：编码序列：外显子; 插入序列,内含子,侧翼序列 含有调控序列. 2 结构基因: 基因中编码 RNA 或蛋白质的 DNA 序列。原核生物的结构基因是连续的;真核生物结构基因 由外显子（编码序列)和内含 子（非编码序列)两部分组成，编码序列不连续，称为断裂基因 3GT-AG 法则: 真核基因中 RNA 剪接内含子的识别信号 5′端以 GT 开始， 3′端以 AG 结束。 4 转录调控序列: 结构基因编码区两侧的一段不被翻译的 DNA 片段(侧翼序列)，参与转录调控。 5 原核生物基因的调控序列: 启动子\终止子\操纵元件 6 真核生物基因的调控序列:顺式作用元件 cis-acting element 能影响基因表达，但不编码 RNA 和蛋白质的 DNA 序列 7 反式作用因子 trans-acting factor 能识别和结合特定的顺式作用元件,并影响基因转录的一类蛋白质或 RNA 8 启动子和上游启动子元件:TATA 盒: 位于-25～-30bp，TATAAAA/TATATAT, 与 TFII 结合，启动基因转录。 CAAT 盒（CAAT Box） 位于-70～-80bp，GG C/ T CAATCT, 与 CTF 结合，决定启动子转录效率。 GC 盒（GC Box）:位于-35bp ，GGCGG，与转录因子 SP1 结合，促进转录的过程。 9 增强子（enhancer）与转录因子特异性结合，增强转录活性，在基因任意位置都有效、无方向性。 10 Poly(A)加尾信号: 含有 II 类启动子的基因，基因末端保守的 AATAAA 顺序及下游 GT 或 T 富含区,被多聚腺苷酸化特异因子识别， 在 mRNA 3′端加约 200 个 A。 11 开放阅读框：open reading frame ，ORF 非翻译区：untranslated regions ，UTR DDRP12 多顺反子 mRNA (polycistronic mRNA): 原核生物的一个 mRNA 分子带有几个结构基因的遗传信息，利用共同的启动 子及终止信号，组成操纵子的基因表达 控单元。 13 单顺反子 mRNA 真核生物的一个编码基因转录生成一个 mRNA 小结： 储存有功能的蛋白质多肽链或 RNA 序列信息， 以及表达这些信息所必需的 全 部核苷酸序列所构成的遗传单位。2. 顺式作用元件主要有启动子和上游 加尾信号。 启动子元件、增强子、沉默子、反应元件、Poly(A)1 基因组：一个细胞或病毒的全部遗传信息； 一套完整的单倍体的遗传物质的总合；含有一种生物的一整套遗 传信息的遗传物质； 2 C 值（C-value） ：单倍体基因组中的全部 DNA 量(bp) 一、病毒基因组 （一）基本结构 DNA 病毒：多数为双链(ds)、环状或线性 （二）RNA 病毒基因组 类型 1.单股正链 RNA 病毒：单股正链 RNA、不分节段， 5′端有甲基化帽， （SARS 冠状病毒） 2.单股负链 RNA 病毒：单股负链 RNA、8 节段，均编码蛋白质， 5′端由相同的 13 个核苷酸组成，3′端有 12 个保守的核 苷酸序列。禽流感病毒(H5N1) 3.双链 RNA 病毒：正负双链 RNA，10－12 节段、每段编码一个蛋白质（呼肠孤病毒、轮状病毒、噬菌体Φ 6） 4.逆转录病毒(retrovirus：单股正链 RNA，有三个基本的结构基因：gag、pol（逆转录酶） 、env，5′端有甲基化帽，3′端有 poly(A)， 另有多个基因表达调控位点。 （ 白血病病毒、肉瘤病毒、人类免疫缺陷病毒） （三）DNA 病毒基因组 3′端有 poly(A)结构。 RNA 病毒：多数为单链(ss)、线性类型1.线性双链 DNA 病毒：基因组：线性双链 DNA，编码两大类蛋白 早期蛋白（E） 、晚期蛋白（L） 反向末端重复序列 inverted terminal repeat， ITR） ： AT 丰富区保守序列： ATAATATACC； GC 丰富区保守序列： GGGCGG,TGACGT 在病毒复制过程有重要作用 2.双链环状 DNA 病毒 基因组：双链环状 DNA，可分为早期区（E） 、晚期区（L） 、上游调节区（upstream regulatory region, URR） 调节转录与复制 3.单链环状 DNA 病毒: 基因重叠;5387 编码 2500 AA 4. 开环部分双链 DNA 病毒 二、原核生物基因组 以大肠杆菌（Escherichia coli）为例 类核（nucleoid） ：细菌染色体在细胞内形成的一个致密区域, （一）由一条环状双链 DNA 分子组成，通常只有一个 DNA 复制起点。 (二) 结构基因大多组成操纵子 操纵子 operon:多个功能相关的结构基因成簇串联排列，与上游共同的调控区和下游转录终止信号组成的基因表达单位。 （三）其它结构特点 1.基因密度非常高，编码区在基因组中所占比例大；2 结构基因没有内含子，多为单拷贝，rRNA 基因为多拷贝；3 重复序列很少， 重复片段为转座子；4.有编码同工酶的同基因：分支酸别构酶\ 乙酰乳酸合酶 变化很大(25%-75%) （四）非编码区主要是调控序列：复制起始区（OriC）复制终止区（TerC）; 转 录起动区\转录终止区 终止子：GC 丰富区、AT 丰富区 强终止子：有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为 poly(T)结构，转录 终止无需ρ 因子。 （五）具有转座现象 5.不同的原核生物基因组的 GC 含量（GC content） 噬菌体 phiX174病毒基因组的结构特点1. 不同病毒基因组可以是不同结构的核酸； 2. 除逆转录病毒外，为单倍体基因组；3. 病毒基因组有的是连续的，有的分节段； 4. 有的基因有内含子；5. 病毒基因组大部分为编码序列； 6. 有基因重叠现象； 7. 功能相关基因转录为多顺反子mRNA。 38乙型肝炎病毒（HBV）转座，或称移位（transposition） ： (2) 转座子（transposon，Tn） (3) Mu 噬菌体（Mu） 2.转座因子的遗传效应转座因子在基因组不同位置间的移动。 小于 2000bp，只有转座相关基因1.转座因子的类别 (1)插入序列（insertion sequence,Is）2-20kb，常带有抗性基因等其它基因转座是转座因子复制出一个新拷贝转移到基因组新的位置 切离是转座因子从原来位置上切除并转移到基因组新的位置 转座的结果使靶点序列倍增 促使染色体畸变 可形成共合体转座子可以使供体和受体复制子融合，形成共合体，解离后释放出两个复制子，每一个都带有一个转座子。 引起插入突变 携带标志基因使受体增添新基因 （六）质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的，具有自主复制能力的环状双链 DNA 分子；大小为 2-3 kb。 ? 质粒的特性:在宿主细胞内可自主复制；细胞分裂时恒定地传给子代；所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；质粒可 以转移。 三 : 染色体 DNA\线粒体 DNA（一）染色体 DNA 的组成 1. 单一序列 DNA（unique sequence DNA ）: 单拷贝 DNA(single copy DNA) 单一序列在人类基因组中大于 50％。结构基因主要存在于单一序列中。 2. 高度重复序列 DNA （highly repetitive DNA） : 卫星 DNA（satellite DNA） 、反向重复序列 （1） 卫星 DNA： 存在于非编码区的串联重复序列， 在基因组中约占 5％。 a. 大卫星（macro-satellite）DNA： 可变数目串联重复序列（variable 重复单位 5-10 bp，其在人群中多态性不显著。 b. 小卫星（minisatellite） DNA： 重复单位 9-24 bp，呈高度多态性。 number of tandem repeat,VNTR） ：核心序列 GGGCAGGAXG； 染色体复制，末端保护。 端粒 DNA： （TTAGGG）n，2-20 kb，c. 微卫星 DNA (macro-satellite DNA) ：短串联重复 重复单位 2-6bp，常见为(AC)n 和(TG)n；重复次数 10-60 次，总长度小于 150bp；高度多态性，可作遗传标记。 （2）反向重复序列：两个顺序列相同的拷贝在 DNA 链上呈反向排列。基因组中约占 5％，常见于基因调控区。 回文结构 3.中度重复序列: 重复次数 10-105，约占基因组的 35％：tRNA、rRNA 组蛋白、免疫球蛋白 可能与基因调控相关序列 Alu 家族： 重复单位约 300bp， 由两个 130bp 重复序列及 31bp 间隔序列组成；重复 30-50 万次，散在分布； 灵长类特有。 有 AluⅠ酶切位点（AG/CT）而得名。 （二）基因组序列多态性 1.单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）两个同源 DNA 序列中同一碱基位置含有不同核苷酸。 2. 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism） 用一种限制性内切酶消化不同个体的同一段 DNA 时，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产生长度不同的 DNA 片段。 (三) 多基因家族（multigene family） ：是指一组有类似功能，核苷酸序列又有同源性的基因。 1.基因超家族（supergene family） ；多基因家族及单基因组成，成员间有不同程度的同源，但它们的功能不一定相同。 2.核酸序列相同： 多拷贝基因形成的基因簇，rRNA、tRNA、组蛋白基因家族 3.核酸序列高度同源：生长激素（GH）与绒毛膜生长催乳激素（CS） 氨基酸序列比对 4.编码产物的功能或功能区相同 (四)假基因（pseudogene,Ψ ） ： 与有功能的基因相似，不表达基因产物的基因。珠蛋白基因簇中的假基因 真核基因组的结构特点： 1.每一种真核生物都有一定的染色体数目；2. 远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；3. 真核生 物基因转录产物为单顺反子；4. 有大量重复序列;5. 真核基因为断裂基因;6. 非编码序列多于编码序列;7. 功能相关基因构成各种 基因家族。 一、 DNA 的二级结构： 》双螺旋结构要点 1. 两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋 (double helix)。螺旋直径 2nm，表面有大沟和小沟。2. 磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含 10 个碱基对 (bp)，螺距为 3.4nm。 碱基平面与 纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行 3. 两条链通过碱基间的氢键相连，A 对 T 有两个氢键，C 对 G 有三个氢键，这种 A-T、C-G 配对的规律，称为碱基互补规则。 4. 维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。 三）DNA 双螺旋结构的多样性：A 型 DNA、B 型 DNA、Z 型 DNA 二、DNA 的超螺旋结构及其在染色质中的组装 超螺旋结构(superhelix 或 supercoil) DNA 双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 supercoil)盘绕方向与 DNA 双螺旋方向相反 意义 DNA 超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于 DNA 复制和 RNA 转录过程具有关键作用。 真核生物染色体由 DNA 和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。 核小体的组成 :DNA：约 200bp 信息基础。 基因从结构上定义，是指 DNA 分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。 二、RNA 的结构与功能 1.信使 RNA 的结构与功能 * mRNA 成熟过程:传递 DNA 遗传信息的 RNA 称为信使 RNA（mRNA） 。 细胞核内初合成的 mRNA 前体是不均一核 RNA（hnRNA） ，经剪接生成成熟的 mRNA。去掉内含子（intron）转录后产物，留下 外显子（extron）转录后产物，重新连在一起。 mRNA 结构特点 (1 ）大多数真核 mRNA 的 5? 末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的 C? 2 也是甲基化，形成帽子结构： m7GpppNm-。 (2)大多数真核 mRNA 的 3? 末端有一个多聚腺苷酸 (polyA)结构，称为多聚 A 尾。 帽子结构和多聚 A 尾的功能：mRNA 核内向胞质的转位 mRNA 的稳定性维系翻译起始的调控 mRNA 的功能：mRNA 的功能是把核内 DNA 的碱基顺序（即遗传信息）按照碱基互补原则，抄录并转移到细胞质，决定蛋白质 合成过程中的氨基酸排列顺序。 mRNA 通过三个核苷酸联成的密码子编码氨基酸。 核酸酶:rRNA 前体的自我剪接是由内含子催化的，其本质是 RNA。具有酶的催化活力的 RNA 就称为核酶，核酶的发现改变了酶 都是蛋白质的传统概念。 2、转运 RNA 的结构与功能 tRNA 的一级结构特点: 含稀有碱基较多; 3?末端为 ― CCA-OH; 5? 末端大多数为 G; 由 70~90 个核苷酸组成 tRNA 分子中含有较多的稀有碱基：DHU、ψ 和 mG、 mA 等 所有的 tRNA 均是线性多核苷酸链，局部片断由于碱基互补而形成局部双螺旋区，而非互补区则形成环状结构。整个 tRNA 的二 级结构呈现三叶草结构 tRNA 中的 3 个环分别是 DHU 环、TψC 环和反密码环 ? ? tRNA 的功能: 其功能是携带蛋白质合成所需的氨基酸， 并按 mRNA 上的密码顺序 “ tRNA 的三级结构的稳定力是核苷酸之间的各种氢键。 3、核蛋白体 RNA 的结构与功能 * rRNA 的结构:rRNA 与蛋白质结合形成的核蛋白是细胞内蛋白质合成的场所。 rRNA 分子大小不均一，真核细胞的 rRNA 有 4 种，其沉降系数分别为 28S、58S、5S 和 18S。大约与 70 种蛋白质结合而存在于 的核蛋白体的大小亚基中 rRNA 的二级结构为茎环样结构。 rRNA 的功能 :参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。 4、其他小分子 RNA 及 RNA 组学 snmRNAs : 除了上述三种 RNA 外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子 RNA ，统称为非 mRNA 小 RNA (small non-messenger RNAs，snmRNAs)。 对号入座” 地将其转运到 mRNA 分子。 tRNA 的三级结构:tRNA 的三级结构 均呈倒 L 字母形，其 3’末端含 CAA-OH 的氨基酸臂位于一端，反密码环位于另一端。 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4 DNA 的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的 正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与 DNA 双螺旋方同相同;负超螺旋(negativesnmRNAs 的种类:核内小 RNA (snRNA);核仁小 RNA (snoRNA);胞质小 RNA (scRNA);催化性小 RNA;小片段干扰 RNA (siRNA) RNA 组学 (RNomics) 是研究细胞中 snmRNAs 的种类、 结构和功能的科学。 同一生物体内不同种类的细胞、 同一细胞在不同时间、 不同状态下 snmRNAs 的表达具有时间和空间特异性。 RNA 的结构和功能 1．mRNA 模板、hnRNA 2．tRNA 复制： 稀有碱基、茎环结构、反密码环 3．rRNA 核糖体、多核糖体3. 基因组复制(replication)： 以母链 DNA 为模板合成子链 DNA 的过程。半保留复制 DNA 复制的特征：双向复制、半不连续复制、方向性和高保真性 半保留复制的概念：DNA 生物合成时，母链 DNA 解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。 子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的 DNA 都和亲代 DNA 碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。 半保留复制的意义 （1）按半保留复制方式，子代 DNA 与亲代 DNA 的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 （ 2） 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。 二、双向复制 原核生物： ? 基因组是环状 DNA ? 只有一个复制起始点 在原核生物双向复制中，DNA 被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为 ? 形。 复制时，DNA 从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。 复制叉：复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的 Y 字形的结构称为复制叉(replication fork) 。 真核生物： ? 染色体 DNA 有多个复制起始点。 ? 两个起始点之间的 DNA 片段称为复制子(replicon)。 ? 复制子是独立 完成复制的功能单位。 冈崎片段： ? 1968 年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到 DNA 复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎 片段。 ? ? ? ? 原核生物:
个核苷酸 ? 真核生物: 100~200 个核苷酸 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。一、原核生物的 DNA 生物合成 （一）复制的起始 ? 需要解决两个问题：1. DNA 解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供 3?-OH 末端;形成引发体。 含有解螺旋酶、DnaC 蛋白、引物酶和 DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体 DNA 解成单链：由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB 结合到单链上使其稳定。 （二）复制的延长复制的延长指在 DNA-pol 催化下，dNTP 以 dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二 酯键的不断生成。 （三）复制的终止原核生物基因是环状 DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 二、真核生物的 DNA 生物合成 （一）复制的起始 ? 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 ? 复制的起始需要 DNA-polα（引物酶活性）和 polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。 ?酵母 DNA 复制起始点为 11bp 富含 AT 的核心序列。 ?复制起始包括打开复制叉、形成引发体和合成 RNA 引物。 （二）复制的延长 ? （三）复制的终止和端粒酶DNA 复制与核小体装配同步进行。 染色体 DNA 呈线状，复制在末端停止。 复制终止包括：槠巍⒏粗谱又涞牧印 真核生物端粒的形成：端粒酶是一种 RNA-蛋白质复合体，它可以其 RNA 为模板，通过逆转录过程对末端 DNA 链进行延长。端粒酶的组成:端粒酶 RNA (human telomerase RNA, hTR) 一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录 (reverse transcription)端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 逆转录和其他复制方式端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)在逆转录酶的催化下，以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，又称反转录。 二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA 同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了 20 世纪初已注意到的病毒致癌理论 D 环复制(D-loop replication) 是线粒体 DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 的复制形式。 由 DNA 聚合酶-g 催化。 两条链的复制起点的位置不同。 4. DNA 损伤（突变）与修复 突变 (mutation)： 是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是 DNA 分子上碱基的改变。 DNA 损伤 (DNA damage)： 泛指一切 DNA 结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和 DNA 链的断裂 一、突变的意义 （一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 二、引发突变的因素 自发性: 自然错配率约为 10-9～10-10 左右。物理因素: 如 UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。 生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。 三、突变的分子改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement)DNA 分子上的碱基错配称点突变 (point mutation) 1. 转换:发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 2. 颠换:发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 二）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从 DNA 大分子上消失。 缺失或插入都可导致框移突变 。 框移突变:是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 三）重排:DNA 分子内较大片段的交换，称为重组或重排。 四、DNA 损伤的修复 修复(repairing) :是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) ：是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由 DNA-polⅠ和连接酶完成。 切除修复对多种 DNA 损伤起修复作用： ? 碱基脱落形成的无碱基位点; ? 单链断裂; ? 碱基错配; ? 嘧啶二聚体; ? ? 碱基烷基化 ? 链间交联 庞大的化学附加物;着色性干皮病(xeroderma pigmentosis， XP) 是切除修复缺陷性的遗传病。 XP 病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低， 不能修复紫外线照射引起的 DNA 损伤，因此易发生皮肤癌。 重组修复(recombination repairing) SOS 修复：当 DNA 损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。? ? ? ?在 E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过 SOS 修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而 DNA 保留的错误 较多，导致较广泛、长期的突变。5基因表达（Gene expression） 一转录与翻译转 录（RNA 的生物合成）1.基因表达(gene expression)：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息，经过转录、翻译等一系列过程，合成具有特定的生物学 功能和生物学效应的 RNA 或蛋白质的全过程。特点：时间特异性（发育阶段特异性）和空间特异性（组织细胞特异性） 。基因表达的 方式：a 基本（组成性）表达如管家基因 b 诱导和阻遏表达(诱导、阻遏表达和协调表达) 2.转录：生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程。也就是把 DNA 的碱基序列抄录成 RNA 的碱基序列。 复制与转录的异同点 相同点： 复制 以 DNA 作模板 需 4 种 NTP 碱基配对 合成方向 5’?3’ 依赖 DNA 的聚合酶 多聚核苷酸大分子 tRNA、rRNA 2.参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 、模板: DNA、酶: RNA 聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol)、其他蛋白质因子 （1）转录模板 结构基因：能转录出 mRNA 然后指导蛋白质生成的部分。 模板链：可作为模板转录成 RNA 的一股链。也称作有意义链或 Watson 链。 编码链：coding strand 相对于模板链的另一股链。也称为反义链或 Crick 链。 （2）RNA 聚合酶 转录酶：依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 DNA dependent RNA polymerase 原核生物的 RNA 聚合酶：大肠杆菌的 RNA 聚合酶：?2??’? 其中 ?2??’称为核心酶：只有转录功能 ? +?2??’=全酶 受利福平或利福霉素（结核菌药物）的特异性抑制。 亚基 ? ? ?’ ? 功能 决定转录的特异性 在转录的全过程起作用 酶与 DNA 模板结合的主要 成分 辨别转录起始点 真核生物的 RNA 聚合酶 I 转录产物 45s-rRNA II hnRNA mRNA,miRNA III 5s-rRNA, tRNA,snRNA,5SrRN A 亚基数 13 10 14 ? 亚基：辨别转录起始点 DDRP DDDP 半保留式子代 DDRP mRNA、 双链复制 dNTP A=T 不同点: 转录 模板链 NTP A=U,T=A定位核仁核质核质原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列 RNA 聚合酶结合模板 DNA 的部位，称为启动子(promoter)。 模板与酶的辨认结合 （1） 启动区的保守序列: 原核生物有两个元件 A -35bp 的辨认位点：5’-TTGACAB-10bp 的 Pribnow 盒: 5’-TATAATPu? 3.真核生物有多个元件(如-30 的 Hogness 或 TATA 盒)。 原核生物的转录过程 转录起始需解决两个问题： A RNA 聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 B DNA 双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。 DNA 双链解开 C. 在 RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始(1)转录起始过程 A RNA 聚合酶全酶(?2????)与模板结合 .B 复合物 （2）转录延长 A ? 亚基脱落，RNACpol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着 DNA 模板前移； B. 在核心酶作用下，以 G=C、A=U、T=A 碱基配对原则 NTP 不断聚合，RNA 链不断延长。5’---3’ 。 转录完成部分的 DNA 重新形成双链。较长的 RNA 链上有核糖体结合，说明在某些情况下，转录的同时，翻译已经开始进行 了。 （3）转录的终止：是 RNA 聚合酶在模板上的某一位置停顿，RNA 链从转录复合物上脱离出来。 分为依赖 Rho 因子的转录终止和不依赖 Rho 因子的转录终止 A、依赖 Rho 因子的转录终止:合成的 RNA 具有 Rho 因子 结合序列，依赖 Rho 因子的结合而终止。 B. 非依赖 Rho 因子的转录终止:DNA 模板上靠近终止处，回文特征的 GC 和 AT 富含区终止序列， RNA 转录物具有形成茎-环 的发夹结构，使 DNA-RNA 杂化链很不稳定，RNA 新链从模板上脱落，转录的终止。 4. 真核生物的转录过程 (1) 真核生物的转录起始：真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样 化，转录起始时，RNA-pol 不直接结合模板，其起始过程比原核生物复 杂。 形成闭合转录复合体： 形成开放转录复合体 A. 转录起始前的上游区段 :顺式作用元件(cis-acting element) B 转录因子: 能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质，现已 发现数百种， 统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中， 直接或间接结合 RNA 聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 C. 转录起始前复合物:真核生物 RNA-pol 不与 DNA 分子直接结合，而需依 靠众多的转录因子 D. 模板理论(piecing theory) :一个真核生物基因的转录需要 3 至 5 个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一 性的复合物，再与 RNA 聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 （2）转录延长（随着转录泡的移动得以延长） RNA 链合成延伸过程，双链 DNA 不断被打开，完成 RNA 合成后又恢复的现象，使得 DNA 分子在电镜下呈泡状结构，称转 录泡，由：局部解链的 DNA 模板、RNA 聚合酶及新生成的 RNA 构成。 A. 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 B C RNA-pol 前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。(3)转录终止：受 DNA 模板上终止信号的控制（真核生物转录终止了解较少） A 真核生物转录终止的特点:真核生物 mRNA 带有聚腺苷酸尾巴的结构，这是转录之后加上的。 B 在模板链读码框架的 3’端之后，常有一组共同序列 AATAAA，再下游还有相当多的 GT 序列，这些序列称为转录终止的修 饰点。 转录与复制的相似之处: A 都以 DNA 为模板 B 需要核苷酸作原料，从 5’到 3’延长；生成磷酸二酯键以连接核苷酸 E 产物都是很长的多核苷酸 真核生物的转录后修饰 转录后的修饰:转录生成的 RNA，称为初级转录产物。无论在真核生物或原核生物中，初级转录产物都经过一定程度的修饰加工，才 C 都遵从碱基配对规律 D 都需要依赖 DNA 的聚合酶能表现其功能。 一、真核生物 mRNA 的转录后加工 （一）首、尾的修饰 1 2 5?端形成 帽子结构(m7GpppGp ―) 转录产物的第一个核苷酸 pppG 水解成 5’-ppG 或 5’-pG 与另一个三磷酸鸟苷生成三 3?端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)：真核生物 mRNA 中 poly A 的出现是不依赖于 DNA 模板的。 加入 poly A 之前，先由核酸外切酶切去 3’末端一些过剩的核苷酸，然后加入 polyA。3’端修饰也是在细胞核中， 在剪接之前进行的。Poly A 的有无与长短，是维持 mRNA 作为翻译模板的活性，以及增加 mRNA 本身的稳定性。 （二）mRNA 的剪接 1. hnRNA 和 snRNA 核内的初级 mRNA 称为杂化核 RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)snRNA (small nuclear RNA)磷酸双鸟苷，第二个鸟嘌呤被甲基化加帽出现在 hnRNA 中，说明可能在细胞核中完成，并在剪接之前。DNA 模板与 hnRNA 是完全配对的，而成熟的 mRNA 与 hnRNA 或 DNA 杂交都只是部分配对。因此真核生物的基因有断裂性 断裂基因(splite gene)：真核生物的结构基因，由若干个编码区被非编码区相互间隔开，但又连续镶嵌而成，因此真核生物的 基因称为断裂基因。外显子代表了基因上编码氨基酸的核苷酸序列。 内含子表示相应的非编码序列，隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。原核生物结构基因是连续的编码序列， 不是断裂基因。 外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟 RNA 的核酸序列。 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为 4 类。 I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA 基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是 mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数 mRNA 基因有此类内含子； IV：是 tRNA 基因及其初级转录产物中的内含子， 剪接过程需酶及 ATP。―― 除去 hnRNA 中的内含子，将外显子连接。 5. mRNA 的编辑(mRNA editing) ? RNA 编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工 (differential RNA processing)。 内含子的功能：有利于物种的进化选择；调节功能 ? tRNA 的转录后加工：初级产物中有 5’端的 16 个碱基和反密码子后的 14 个碱基需要去除。核酶：RNA 本身具有催化活性，此种由 RNA 发挥催化作用的酶，称为核酶。最简单的核酶呈槌头结构。 基因表达的第一步：RNA 聚合酶以 DNA 为模板合成各种初级产物，RNA 前体经复杂的转录后加工修饰过程，成为细胞合成蛋白 质所需模板、场所、原料搬运工具及调控分子 二 翻 译1.翻译（translation） ：mRNA 分子中的遗传信息转变为蛋白质的氨基酸排列顺序 2 蛋白质的生物合成体系 原料：① 20 种氨基酸 A 模板――mRNA （1）遗传密码（genetic code） 密码子（codon） ：mRNA 从 5@端→3@端，每 3 个核苷酸组成一组，代表相应的氨基酸或翻译起始、终止信号，统称 为遗传密码。其中的单个密码字，称为密码子 （2）遗传密码的特点： 通用性、 方向性：(5@端→3@端)、 连续性（mRNA 链上碱基的插入或缺失可导致移码） 、 不重叠性 （3）起始密码：5@端第一个 AUG 表示起动信号，并代表甲酰蛋氨酸(细菌)或蛋氨酸(高等动物) （4）终止密码：UAA、UAG 或 UGA（不编码氨基酸） 简并性(degenerate)：一个以上密码子体现一个氨基酸遗传信息（Trp 和 Met 除外，仅有 1 个密码子 ） 。其原因是由于密码子与 反密码子之间存在不稳定配对（摆动性或摇摆性） 摇摆性（wobble） ： mRNA 密码子的第三个核苷酸（3@端）与 tRNA 反密码子第一个核苷酸（5@端）配对时，有时不遵守严 ② 模板：mRNA ③场所：核蛋白体 ④ 氨基酸的D搬运工具‖：tRNA ⑥ 能量：ATP、GTP ⑦ 无机离子 ⑤ 酶与蛋白质因子：启动、延长、终止因子格的碱基配对原则，除 A-U、G-C 外，还可有其它配对方式。 I 是最常见的摆动现象 B 氨基酸的搬运工具――tRNA ? ? ? ? ? 常为 I C 多肽链的&装配机&――核蛋白体 (1) 组成：蛋白质＋rRNA (2)功能区 真核核蛋白体（40S+60S=80S）; 原核核蛋白体（30S+50S=70S） 受位（A 位） ： 位于大、小亚基结合处，结合 AA-tRNA 给位（P 位） ：主要位于大亚基，结合肽酰-tRNA 和起始 Met-tRNA 转肽酶、GTP 酶：位于大亚基 (3)多核蛋白体：1 个 mRNA 和多个核蛋白体的聚合物，体现了蛋白质合成的高速、高效性 3 蛋白质生物合成过程：氨基酸活化、起始复合物生成、肽链延长、终止 (1)氨基酸的活化与转运 A 氨基酰 tRNA 合成酶：高度特异识别氨基酸、tRNA ；校对活性 B 能量：1 个 ATP（2 个高能键） (2) 核蛋白体循环（ribosomal cycle） ： 起始、延长、 终止 A、起始复合物的生成: 起始因子: 3 种 IF（原核） ：IF1、IF2、IF3 fMet-tRNAfmet （原核） 10 多种 eIF（真核） ：eIF2 是合成调控的关键物质 Met-tRNAmet （真核） 能量：GTP（真核体系还需 ATP） 起始 AA-tRNA : 起始复合物组成：大、小亚基、mRNA、起始因子、起始 AA-Trna 起始复合物形成过程：核蛋白体的拆离、mRNA 就位、起始 tRNA 结合、大亚基结合 小亚基先与 mRNA 结合（原核） 小亚基先与起始 AA-tRNA 结合（真核） B 肽链延长 延长因子 EFT：真核为 EFT1 与 T2，原核为 EFTu、Ts 与 EFG 能量：GTP 过程 : 进位：EFTu、Ts 或 T1、GTP；进入 A 位;成肽：转肽酶；P 位酰基与 A 位氨基反应;转位、脱落、移位：EFG（转位酶） 或 T2、GTP ；由 A 位移至 P 位，A 位留空 方向：N 端→C 端（肽链） ；5′端→3′端（mRNA） C 终止 :（1）释放因子 RF：3 种（原核）或 1 种（真核） 2）能量：GTP （3）转肽酶活性转变：转肽酶→酯酶（水解酶 ） 4 真核与原核蛋白合成的不同点 (1) 转 录 与 翻 译 不 偶 联 (5)合成的调控更为复杂 5 蛋白质合成的调节 (1) 蛋白质合成抑制剂：抗生素、干扰素、毒素 (2)干扰素（interferon，IF） ：抗病毒 降解模板 RNA： 干扰素与双链 RNA （病毒） 共同活化 2’,5’-A 合成酶， 促使多聚 2’,5’-A 生成； 2’,5’-A 活化核酸内切酶， 使 mRNA 降解 磷酸化起始因子 eIF2，抑制蛋白合成的起始 (2) 合 成 体 系 复 杂 (3) 合 成 起 始 一种 tRNA 可携带一种氨基酸；而一种氨基酸可由数种 tRNA 携带 氨基酸臂……与氨基酸结合 DHU 环………与氨酰-tRNA 合成酶结合 反密码环……识别密码子 TψC 环…….与核蛋白体结合 反密码子的第一位核苷酸（5@端） (1)、tRNA 的功能区(2) 反密码子（anticodon）tRNA 反密码环中间的 3 个核苷酸，可与 mRNA 密码子配对AA-tRNA 不同 (4) 通常需进行翻译后加工(3) 毒素：抑制真核生物 白喉毒素：共价修饰（ADP 核糖化）延长因子 EFT2，抑制肽链延长 6. 翻译后加工 一、肽链合成后的加工 1、去除 N-甲酰基（原核）或 N-蛋氨酸（真核） 5、亚基聚合 6、辅基结合 7. 分泌蛋白质的合成 ？ 靶向输送(protein targeting)：将合成后的蛋白质定向运送到行使功能的目标区域 一、信号肽 1、作用：使核蛋白体与内质网上的受体结合；肽链进入内质网腔后运至靶器官，由信号肽酶切除信号肽。 2、结构：约 15～40AA 构成；分三个区： N 端为亲水区含碱性氨基酸, 提供正电荷。 疏水区含中性或疏水性氨基酸。 加工区是信号肽酶切割信号肽的部位 二、其它 参与转运的分子 1、信号肽识别粒子 SRP（Signal recognition particles） ：由 6 种蛋白质与 7S-RNA 组成复合体。 与合成的分泌蛋白中的信号肽结合。 与内质网上的受体结合。 2、7S-RNA:305bp,提供 SRP 形成的结构骨架。 3、对接蛋白 Dp（docking protein） ：Dp 是 SRP 的受体，与 SRP 共同催化转运携有肽链的核蛋白体到内质网上。 三、分泌蛋白的转运过程 1、信号肽与 SRP 结合，SRP 与 Dp 结合，核蛋白体与内质网膜结合。 SRP 的结合使肽链合成减速或暂停。 当 SRP 与其受体结合时,释放信号肽,翻译又恢复进行. 2、信号肽被信号肽酶切割掉，蛋白质分泌到内质网腔。 8.蛋白质合成与医学的关系 一、分子病(molecular diseases) 由于基因缺陷，导致蛋白质合成异常，最终引起机体某些结构与功能障碍，产生疾病，称分子病。\ 1、误义突变（missense mutation） ：某一氨基酸的密码突变为另一氨基酸的密码的现象 2、移码突变（frame-shift） ：插入或缺失 1 个或 2 个核苷酸后，导致插入点后的所有密码子发生改变 1、镰刀状红细胞贫血 ? 血红蛋白 β 链 N 端第六个氨基酸残基由 Glu 变为 Val ? 珠蛋白结构基因中第六个密码子由 CTT 变为 CAT 6 基因表达的调控 1.基因表达调控的概念：机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的 功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。调控因子：蛋白质 ( 主要 )小分子 RNA ( 某些环节 )；调控水平：基 因组、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平 2 操纵子(operon) :一个多顺反子转录单位与其调控序列即构成操纵子 3 基因表达调控的规律：(1)时空特异性、(2)诱导表达和阻遏表达是调控的普遍方式、(3)受顺式作用原件与反式作用因子共同调节、(4) 蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质相互作用是分子基础、 (5)多层次的复杂调控 4 原核生物基因表达调控主要在转录水平，其次是翻译水平。 特点：(1) 只有一种 RNA 聚合酶 (2)基因表达以操纵子为基本单位.(3))转录和翻译偶联进行；(4) mRNA 翻译起始部位有特殊的碱基 序列―SD 序列。共有序列为 AGGAGG (5)原核生物基因表达调控主要在转录水平，即对 RNA 合成的调控。通常有两种方式： a 起 始调控，即启动子调控 b 终止调控(衰减子调控) 5 原核生物基因表达调控的机制 (1)转录起始的调控 A б 因子与转录起始的调控: ①б 因子确保 RNA 聚合酶与特异启动子序列稳定结合，而不是与其它位点结合。不同的σ 因子决定 RNA 聚合酶对一个或一套启动子序列的特异性识别和结合能力. ② 启动子序列:共有序列决定启动子序列的转录活性强弱。某些特异 因子（蛋白质）决定 RNA 聚合酶对一个或一套启动子序列的特异性识别和结合能力 2、二硫键形成：生成胱氨酸 3、水解修剪4、氨基酸侧链修饰：羟化（生成羟脯氨酸、羟赖氨酸） 、乙酰化、磷酸化、甲基化与羟甲基化、加糖、加脂，等转录起始的负调控(乳糖操纵子是原核生物基因转录负调控的最典型模式 ) 乳糖操纵元件的表达调控 1,阻遏蛋白的负性调控 单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。 葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏 当有乳糖存在时,乳糖与 R 结合,使 R 四聚体解聚成单体,失去与 O 的亲和力,与 O\解离,基因转录开放.大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存 时,1ac 操纵元处于阻遏状态.i 基因在自身的启动子 Pi 控制下,产生阻遏蛋白 R.R 以四聚体形式与操纵子 o 结合,阻碍 RNA 聚合酶与启动 子 P 的结合,阻止基因的转录起始. 2,CAP 的正性调控 cAMP 含量与葡萄糖的分解代谢有关,当细菌利用葡萄糖分解供给能量时,cAMP 生成少而分解多,cAMP 含量低;相反,当环境中无葡萄糖 可供利用时,cAMP 含量就升高.cAMP 与 CRP 结合变为 CAP,并以二聚体的方式与特定的 DNA 序列结合. 由于 P1ac 是弱启动子,单纯因乳糖的存在发生去阻遏使 1ac 操纵元转录开放,还不能使细胞很好利用乳糖,必须同时有 CAP 来加强转录活 性,细菌才能合成足够的酶来利用乳糖.1ac 操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在,又需要没有葡萄糖可供利用,通过 CAP 的正调控作用, 细菌才能充分利用乳糖. 3.转录起始的正调控（阿拉伯糖操纵子是正调控的典型例子） cAMP:环一磷酸腺苷 CAP：分解代谢基因激活蛋白质(catabolite gene activator protein，CAP) cAMP 与葡萄糖相关性： 葡萄糖↑，cAMP↓ 葡萄糖↓，cAMP↑ 4．转录起始的复合调控 在大肠杆菌的许多操纵子中，基因的转录不是由单一因子调控的，而是通过负调控因子和正调控因子进行复合调控。糖代谢有关的操 纵子，如 lac 操纵子 （二）转录终止的调控 转录终止调控方式分两大类：A.依赖ρ 因子的终止调控 B.不依赖ρ 因子的终止调控 CAP 的活性依赖 cAMP， 形成 cAMP-CAP 复合物，促进多种操纵子转录起始。色氨酸丰富时，核蛋白体顺利沿引导序列移动直达最后一个密码子 UGA，合成完整的引导肽。RNA 聚合酶停止在衰减子部位。 色氨酸缺乏时，核蛋白体终止在 1 区 Trp 密码子部位，RNA 聚合酶通过衰减子区域而继续转录。 例：色氨酸操纵子的表达调控 (三) 翻译水平的调控 1.反义 RNA 的调控作用 能与特定 mRNA 互补结合的 RNA 片段。①与 mRNA 5@端非翻译区包括 SD 序列相结合，直接抑制翻译。②与 mRNA 5@端编 码区起始密码子 AUG 结合，抑制 mRNA 翻译起始。③与 mRNA 的非编码区互补结合，使 mRNA 构象改变，影响其与核糖体结合， 间接抑制了 mRNA 的翻译。 2. RNA 稳定性与调控的关系 3.蛋白质合成的自身调控 第二节 真核生物基因表达的调控 特点 1. 细胞的全能性 2. 基因表达的时间性和空间性 3. 转录和翻译分开进行 4. 子 mRNA (monocistronic mRNA) 一、真核生物基因表达调控的机制 （一）基因组 DNA 水平的调控 1.染色质丢失： 不可逆调控。如一些低等生物（如线虫）体细胞发育过程中发生染色质丢失 2.基因扩增：当细胞对某种基因产物需要量剧增，单纯靠调节其表达活性不足以满足需要，只有增加这种基因的拷贝数。 3.基因重排：指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。 4.基因的甲基化修饰 DNA 上特定的 CpG 序列处的胞嘧啶发生甲基化修饰（5mC） 。甲基化程度与基因的表达一般呈反比关系。甲基化程度愈高，基因 的表达则降低。去甲基化，基因的表达增加。 5.染色质结构对基因表达的调控作用：常染色质疏松的活性染色质是基因转录前在染色质水平上独特的调控机制。 初级转录产物要经过转录后加工修饰： 初级转录产物 mRNA 稳定性与其序列和结构有关。 一般在起始和终止阶段受到调节 调控分子: RNA、蛋白质;作用：直接或间接决定翻译起始位点能否为核蛋白体所利用。为核不均一 RNA（heterogeneous nuclear RNA , hnRNA）5. 部分基因多拷贝 6. 不存在操纵子结构， 真核生物的 mRNA 是单顺反（二）转录水平的调控（以 RNA 聚合酶Ⅱ为例） 1.转录起始复合物的形成 2.顺式作用元件 (cis-acting element)指某些能影响基因表达但不编码蛋白质和 RNA 的 DNA 序列，按照功能分为启动子、增强子、负调 控元件（沉默子等） (1)启动子(promoter)： 决定 RNA 聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件 RNA 聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。①核心启动子 TATA 盒： 上游-25 ~ -30 bp 处。②上游启动子元件：上游-30 ~ -110 bp 处，包括 GC 盒（GGGCGG）和 CAAT 盒（GCCAAT） (2)增强子(enhancer) 指位于启动子上游或下游并通过启动子增强目标基因转录效率的 DNA 序列，增强子本身不具备启动子活性。位 置距离及作用方向不固定；决定基因表达的时空特异性 (3)其他元件 沉默子（silencer） ：指在真核基因内能抑制基因转录的 DNA 序列,与反式作用因子相互结合而起作用。不受距离和方向的限制，并可 对异源基因的表达起作用。 加尾信号 3.反式作用因子 (trans-acting factor)能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件 8～12 bp 核心序列上， 参与调控靶基因转录效率的一 组蛋白质。①通用转录因子：普遍存在的转录因子。②组织特异性转录因子。与基因表达的组织特异性有很大关系。③诱导性反式作 用因子：活性能被特异的诱导因子所诱导。 (2) 转录调节因子结构： A DNA 识别结合域：锌指（zinc finger）结构、同源结构域（homeodomain，HD） ：同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列， 称为同源结构域。所含的至少二个 α 螺旋中形成“转折” ，第三个 α 螺旋与 DNA 大沟相互作用，是同源盒蛋白与 DNA 结合的主要力 量、碱性-亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋 B 转录活化结构域:反式作用因子必须具备的结构基础 酸性 α-螺旋（acidicα-helix domain） 含有较多的负电荷。能非特异性地与起始复合物相互作用发挥转录活化功能（如 TBP)。富含谷氨 酰胺的结构域（glutamine-rich domain）最强的转录活化域之一（如 SP1)。富含脯氨酸结构域（proline-rich domain） 4.转录水平的调控机制 (１)反式作用因子的活性调节 真核基因转录起始的调节，首先表现为反式作用因子的功能调节，即特定的反式作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。 （2）反式作用因子的激活方式: ①表达式调节②共价修饰③配体结合④蛋白质与蛋白质相互作用; 反式作用因子作用方式: 1) （looping） 2) 扭曲(twisting) 3）滑动(sliding) 4）Oozing （3）反式作用因子的组合式调控 (三)转录后水平的调控 1. 加帽加尾：5?端形成 帽子结构(m7GpppGp )，3?端加多聚腺苷酸尾(poly A tail) 意义：保护转录体 mRNA 不受外切酶降解，增强 mRNA 的稳定性，同时有利于 mRNA 从细胞核向胞质的转运，通过帽结合蛋白介导，促进 mRNA 与核糖体的结合。2. mRNA 前体的 选择性剪接：真核细胞基因表达所转录出的 mRNA 前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的 mRNA,这一过程即为剪接。意义:在高等生物细胞的高度异质性中起重要作用。由于剪接的多样化，一个基因在转录后通过 mRNA 前 体剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。 （四）翻译水平的调控 1.翻译起始的调控 （1）阻遏蛋白的控制 （2）翻译起始因子调节蛋白质合成的速度 （3）5′AUG 调节翻译的效率（4）5′端非编码区长度影响翻译起 始效率及准确性 2. mRNA 稳定性:调节蛋白质合成的水平 3. 小分子 RNA 可调控翻译的效率 (五)翻译后水平的调控 1. 新生肽链的水解 2. 肽链氨基酸的共价修饰 3.信号肽的靶向运输 蛋白质合成 3. 蛋白质合成机制 (1)起始 需要核糖体大小亚基、mRNA、起始 tRNA、3 种起始因子（IF）和 GTP。IF1 和 IF3 与 30S 亚基结合，接着 IF2 和 GTP 与小 亚基结合，由核糖体结合点附着在 mRNA 上，起始 tRNA 与 AUG 配对释放 IF3，形成 30S 起始复合体。大亚基与之结合，形成 成环70S 起始复合物 (2 )延伸 ① 氨酰 tRNA 的转运。EF-Tu 与 GTP 复合物帮助 氨酰 tRNA 进入核糖体的 A 位点，在 EF-Ts 和 GTP 的作用下， EF-Tu-GDP 可被再利用（EF-Tu-EF-Ts 交换循环） ；② 肽键形成。50S 亚基的肽酰转移酶催化两个氨基酸形成肽键；③ 移位 。移 位酶（EF-G）与 GTP 复合体与核糖体结合，P 位上的 tRNA 解离，肽酰 tRNA 从 A 位移到 P 位，mRNA 相对核糖体移动一个密 码子。如此循环 (3)终止 释放因子 RF 识别终止密码（UAA、UAG、UGA） ，肽酰转移酶将肽链转至水，释放 mRNA，并与核糖体解离。3 真核生物蛋白质合成起始起始eIF 3 和 4C 促使 40S 亚基结合到三元复合体（起始 tRNA、eIF2 和 GTP） 。同时 mRNA 与 eIF4B 和 4F 作用解旋，40S 亚基复合体与 mRNA 复合体结合，利用 ATP 能量扫描 mRNA 以寻找 AUG 起始密码。60S 亚基结合并水解 GTP 形成 80S 起始复合体 。 eIF2-GDP 复合体在 eIF2B 的作用下进入下一轮。病毒可促进 eIF2 的磷酸化来抑制蛋白质合成延伸 与原核相似 终止 单一释放因子 eRF 识别 3 个终止密码4 翻译调控与翻译后加工翻译调控原核有：反义 RNA 结合抑制翻译；茎环结构抑制外切核酸酶攻击；翻译产物结合到 mRNA 上阻止翻译；真核：3’ 非编码区多个 AUUUA-3/ 单元限制翻译；蛋白质结合到 mRNA 上阻止翻译多蛋白 翻译的一条多肽链被切割为多个成熟蛋白质，这条多肽链为多蛋白蛋白质定位和修饰 SRP 识别有信号肽的新生多肽链的核糖体，结合到内质网外的 SRP 受体或停靠蛋白上，使核糖体附着在核糖体受体蛋白上，核糖体继续翻译，新生肽被运进内质网腔内，进行糖基化修饰。新生肽常见的加工是切割和化学修饰 基因表达（gene expression）是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质， 进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但对于 rRNA、tRNA 编码基因来说，基因表达就是转录生成 RNA 的过程。 8 细胞信号转导 细胞间信息物质:是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称，又称作第一信使。蛋白质和肽类（如生长因子、细胞 因子、胰岛素等） * 氨基酸及其衍生物（如甘氨酸、甲状腺素、肾上腺素等） * 脂酸衍生物（如前列腺素）2+* 类固醇激素（如糖皮质激素、性激素等）2+* 气体（如一氧化氮、一氧化碳）等细胞内信息分子：化学本质第二信使在细胞内传递信息的小分子物质，如：无机离子：如 Ca Ca 、脂类衍生物DAG、核苷酸IP3、核苷酸cAMP、cGMP、信号蛋白分子：如Ras、Raf 等。 酶分子：AC GC PLC调节蛋白：G蛋白、接头蛋白（SH2结构域(Scr homology 2 domain):原癌基因scr编码的2结构域同源的结构域。此结构域能与 酪氨酸残基磷酸化的多肽链结合。 SH3结构域: 能与富含脯氨酸的肽段结合。 PH结构域、PBT结构域）、蛋白质和肽类： 肽类激素、细胞因子等 氨基酸衍生物： 儿茶酚胺类激素等 脂酸衍生物： 前列腺素等第三信使负责细胞核内外信息传递的物质，又称为核信使 信号转导相关分子由三部分组成：胞外信号分子、膜受体、包内 信号分子 1 膜表面信号分子需要细胞接触传递信号：蛋白糖蛋白、脂 化学信号分子作为游离分子 2.受体结合胞外信号分子向包内传递信息物质 细胞间 通过膜受体 　 作用通过胞内 受体作用－类固醇激素、甲状腺素、VD等 细胞内：cAMP、cGMP、IP3 、DG、C a2+2 受体是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂；能与受体 呈特异性结合的生物活性分子则称配体(ligand)。 二、受体 膜受体是存在于细胞质膜上的受体，绝大部分是镶嵌糖蛋白 1. 环状受体 ―― 配体依赖性离子通道神经递质与这类受体结合后，可使离子通道打开或关闭，从而改变膜的通透性。 2. G 蛋白偶联受体又称七个跨膜?螺旋受体/蛇型受体(serpentine G蛋白鸟苷酸结合蛋白（guanylate binding protein）的简称。 是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由?、?、? 三个亚基组成。 G蛋白由三个亚基组成： G?：有GTP或GDP结合位点、GTP酶活性、ADP核糖基化位点及受体和效应器结合位点等。G?与G? 结合紧密。 receptor)3. 单个跨膜?螺旋受体 A 酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）受体型（催化型受体）与配体结合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰岛 素受体? 表皮生长因子受体。 TPK受体的下游分子常含有 SH2结构域(Scr homology 2 domain):原癌基因scr编码的2结构域同源的结构域。此结构域能与酪氨酸残基磷酸化的多肽链结合。 SH3结构域: 能与富含脯氨酸的肽段结合。PH结构域(pleckstrin homology domain) 能识别具有磷酸化的丝氨酸和苏氨酸的短肽，并与之结合； 能与G蛋白的βγ复合物结合； 还能与带电的磷脂结合。B 非酪氨酸蛋白激酶受体型: 与配体结合后，可与酪氨酸蛋白激酶偶联而表现出酶活性，如生长激素受体、干扰素受体。 C 转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）受体 自身磷酸化(autophosphorylation) 当配体与单跨膜螺旋受体结合后，催化型受体大多数发生二聚化，二聚体的酪氨酸蛋白激酶被激活，彼此使对方的某些酪氨酸 残基磷酸化，这一过程称为自身磷酸化。该型受体与细胞的增殖、分化、分裂及癌变有关。 （二）胞内受体(intracellular receptor) 位于细胞浆和细胞核中的受体，全部为DNA结合蛋白。 胞内受体通常为反式作用因子，当与相应配体结合后，能与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。 能与胞内受体结合的信息物质有类固醇激素、甲状腺素、维生素D3和维甲酸等。 高度可变区：位于N端，具有转录激活功能 DNA结合区：位于中部，含有锌指结构 铰链区：含有核定位信号 激素结合区：位于C端，结合配体或热休克蛋白，含有核定位信号，使受体二聚化，激活转录 二、受体作用的特点1. 高度专一性 2高度亲和力 3. 可饱和性. 4可逆性5. 特定的作用模式 三、受体活性的调节 1. 磷酸化与脱磷酸化作用 2. 膜磷脂的代谢的影响 3. 酶促水解作用 4. Ｇ蛋白的调节信号分子传递信息发的方式p99：改变小分子浓度与包内定位；上游分子通过变构激活下游分子； 信号转导体的形成可促进信号转导 三、信息的转导途径 （一）、胞内受体介导的信息传递 核内受体 胞浆内受体 配体：类固醇激素、甲状腺激素（二、离子通道型受体） （三）膜受体介导的信息转导 G蛋白和小分子信使是G蛋白偶联受体介导的信 号途径的主要特征 G 蛋白循环：G 蛋白偶联型受体的信号转导途径 中的第一个信号传递分子是 G 蛋白，其活化过程称为 G 蛋白循环。1.cAMP - 蛋白激酶Ａ途径 该信号途径涉及的反应链可表示为： 激素→G蛋白耦联受体→G蛋白→腺苷酸环化酶 →cAMP→依赖cAMP的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因 转录。cAMP的作用机理：激活cAMP依赖性蛋白激酶（PKA） PKA的作用：⑴ 实现其调节功能。 (2) 对基因表达的调节作用（二）Ca2+－依赖性蛋白激酶途径对代谢的调节作用：通过对效应蛋白的磷酸化作用，受cAMP调控的基因中， 在其转录调控区有一共同的DNA序列(TGACGTCA)， 称为cAMP应答元件(cAMP response element , CRE)。可与cAMP应答元件结合蛋白 (cAMP response element bound protein,CREB) 相互作用而调节此基 因的转录。（3）调节细胞极性 2Ca －依赖性蛋白激酶途径（磷脂酰肌醇途径） IP3 ：与内质网和肌浆网上的受体结合，促使细胞内Ca 释放 DAG：在磷脂酰丝氨酸和Ca 协同下激活PKC PKC的生理功能 ① 调节代谢2+ 2+ 2+1. Ca2+－ 磷脂依赖性蛋白激酶途径PIP2 配体 受体 G蛋白 PLC IP3 DAG Ca2＋ PKC内质网生物学效应酶或功能蛋白磷酸化活化的PKC引起一系列靶蛋白的丝 、苏氨酸残基磷酸化。 靶蛋白包括： 质膜受体、膜蛋白和多种酶。 ② 调节基因表达2+2. Ca2+－钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径激素受体PKC 对基因的活化分为早期反应和晚期反应。 3 Ca －钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径 钙调蛋白(calmodulin , CaM) 为钙结合蛋白，由一条肽链组成，有四个Ca2+结合位点。与Ca2+结合后可 激活CaM激酶，再磷酸化多种功能蛋白质的丝、苏氨基酸残基。 钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶或钙调蛋白激酶（英文： Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases or CaM kinases ）是一种丝氨 酸／苏氨酸特性的蛋白激酶，被钙／钙调蛋白复合物所调节 （四）蛋白激酶偶联受体介导的信号转导主要涉及蛋白质的相互作用 1.蛋白激酶偶联受体介导的信号的共同模式 （1）胞外信号分子与受体结合（2）第一个蛋白激酶被激活（3）蛋白蛋 白质相互作用或蛋白激酶磷酸化修饰激活下游信号分子、传递信号（4）蛋白 激酶通过磷酸化修饰激活代谢过程的关键酶、反式作用因子 2蛋白激酶偶联受体介导的信号转导途径 1.MAPK途径（ 受体型TPK-Ras-MAPK途径） （1）表皮生长因子与受体结合后（2）可以使受体发生二聚体化，从而G蛋白PLCIP 3Ca 2+CaMCaM激酶酶或功能蛋白磷酸化生物学效应改变了受体的构象，使其中的蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化，（3）磷酸化的受体便形成了与含SH2 结构域的蛋白分子Grb2结合的位点，导致Grb2与受体的结合。Grb2中有两个SH3结构域，（4）Grb2活化SOS，（5）SOS则进一步 活化Ras，激活的Ras作用于MAPK激活系统，导致ERK的激活。（6）最后ERK转移到细胞核内，导致某些转录因子的活性改变从而 改变基因的表达状态及细胞的增殖与分化过程。 表皮生长因子与其受体－表皮生长因子受体结合后可引发一系列细胞内变化，最终使细胞发生分化或增殖。表皮生长因子受体是 一种受体酪氨酸蛋白激酶， 而受体酪氨酸蛋白激酶→Ras→MAPK级联途径是表皮生长因子刺激信号传递到细胞核内的最主要途径。 它 由以下成员组成：表皮生长因子受体→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟嘌呤核苷酸释放因子(如SOS)→Ras蛋白 →MAPKKK(如Raf1)→MAPKK→MAPK→转录因子等 2.JAk-STAT途径2. JAKs-STAT途径配体 非催化性受体JAKs STAT 基因的转录它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶 JAK和转录因子STAT。(1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2 （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞 膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段 具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活 化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸 激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷 酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3 以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、 JH6和JH7是受体结合区域. (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription ） STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六 个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及 C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心 序列“GTFLLRFSS”。 传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨 酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成 “停泊位点”（docking site），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK催化结合在受体上的STAT 蛋白发生磷酸化修饰， 活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞 核内与靶基因结合，调控基因的转录 3 Smads 途径* JAKs (Janus kinases) * 信号转导子和转录激动子 (signal transductors and activators of transcription ，STAT)4.PI3/PKB途径五、细胞信号转导的复杂性与多样性 1. 一条信息途径成员可参与激活或抑制另一条信息途径 2. 两种不同的信息途径可共同作用于同一种效应蛋白或同 一基因调控区而协同发挥作用 3. 一种信息分可作用于几条信息传递途径 9 细胞增殖与分化1.细胞增殖：是生长的主要因素：体积、数量、胞外基质增加三种方式 2. 细胞周期的调节依赖于结构上相关的异二聚体蛋白激酶整个家族来完成。 由调节亚单位 （细胞周期蛋白， cyclin） 和催化亚单位 （细 胞周期蛋白依赖性激酶，cyclin-dependent kinases, CDKS）两部分组成。调节亚单位，称为,其浓度在细胞周期的不同时期有升 高和降低；催化亚单位称为。CDKS单独存在时不表现激酶活性，只有与细胞周期蛋白结合时才表现出激酶活性 3. 细胞周期蛋白通过泛素化途径降价 泛素：高度保守的７６个氨基酸残基组成的蛋白称为泛素（ubiquitin）。共价结合一串泛素的过程称为多泛素化 4.泛素化步骤： 泛素化修饰涉及泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 的一系列反应:（1）在 ATP 供能的情况下酶 E1 粘附在泛素分 子尾部的 Cys 残基上激活泛素（2）, E1 将激活的泛素分子转移到 E2 酶上（3）E2 酶和一些种类不同的 E3 酶共同识别靶蛋白,对其进 行泛素化修饰。 根据 E3 与靶蛋白的相对比例可以将靶蛋白单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。 （4） E3 酶识别 cyclin,E2 将泛素传给 cyclin, 泛素化。（5）泛素化蛋白被 26S 蛋白酶体迅速降解. 泛素化主要功能：由于基因突变、自由基破坏、环境胁迫、疾病等导致反常蛋白的产生，需要被及时降解清除，以免干扰正常的生命 活动；维持体内的氨基酸代谢库；防御机制的组成部分；蛋白质前体的裂解加工等。 5.细胞周期调节的关卡 ：G1-S,G2-M,M 后期 6、细胞周期蛋白-激酶抑制因子（cyclin-kinase inhibitor，CKI）。 目前根据这些因子与CDK相互作用的特异性和序列同源性，把CKI分为三类。 一类是INK4（inhibitors of kinase 4, 激酶4抑制因子）家族，另一类是CIP（CDK Inhibitory Protein, CDK 抑制蛋白）/KIP家族。 新的CKI：14-3-3 σ INK家族的CKI包括p15、p16、p18和p19。这些蛋白结构上是相关的，都含有4个锚（ankyrin）重复序列。INK4家族的蛋白识别CDK4和 CDK6，但不识别CDK2，通过与细胞周期蛋白 D竞争结合CDK4而引起细胞周期G1期停滞。 第二个家族是CIP/KIP，包括p21，p27和p57。这一家族的蛋白都有一个N端的CDK抑制性功能域。 它们与CDK-}