1 . 用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液並去除红细胞（单 元 2.1)

2.将细胞在 10 ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A)。

4.按基本方案 1 中的步骤 4?7 操作这样 B 细胞将从阳性通道洗脫。

基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选

1.用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单元 2.1)

2.将细胞在 IOml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血細胞计数器计数（附录 3A)。

4.除了选择 depletes 程 序（非 possel 程序）其他操作按基本方案 1 中的步骤 4?7 进行，这样辅助细胞将从阴性通道洗脱

备 选 方 案 1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞

不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）

la. 对于分离总 T 细胞 CD4⁺ T 细胞或 CD8⁺ T 细胞：按前述方法制备並标记单细胞悬 液（见基本方案 1， 1?3 步）

lb. 对于分离 B 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 2 , 步骤 1?3)。

lc. 对于分离辅助细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 3 , 步骤1?3

3.离心期间将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LS 分选柱（用于分离总 T 细胞、 CD4+T 细胞、 CD8+T 細胞或 B 细胞）或 LD 柱（用于分离辅助细胞）放到磁体中在分选柱下放一支无菌的 15 ml 离心管。用 4°C 不含气体的 MACS缓冲液冲洗分选柱 3 次每次 3 ml。弃洗脱液在分选柱下方放置一支干净的无菌离心管。

由此方法得到的阴性细胞（CD4⁺CD2 5^- ) 可用作反应细胞或对照细胞

备 选 方 案 2 用磁性分选柱手工操作分离 CD4 +CD25+抑制性细胞

不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）