甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义3

甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义3

鹤壁职业技术学院(鹤壁458030)　晋佳路　刘旺根33　王雪萍33　王玎玎33

　　摘　要　目的:探讨甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)在肺癌临床诊断中的应用价值。方法:选取56例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰标本,其中32例为肺癌,24例为良性肺部疾病。标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察。结果:32例肺癌组织标本中,14例(43.8%)在p16基因启动子区域呈现异常甲基化,其中9例(64.3%)在相应的BALF中检出甲基化存在,5例(35.8%)在相应的痰标本中也检出甲基化存在。良性肺部疾病24例,其中肺囊肿10例,肺结核14例,无论在手术切除标本还是BALF和痰标本中均未检出p16基因甲基化存在。结论:MSPCR技术对肺癌患者BALF及痰标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项很有潜力的肺癌早期诊断新技术。　　主题词　肺肿瘤 诊断　基因,p16 诊断应用　甲基化　@甲基化特异性PCR

　　近年来有关DNA甲基化与肿瘤发生发展的

关系日益受到人们的重视,抑癌基因p16失活的机理除基因缺失和突变以外,其5′端启动子区域的CpG岛甲基化使其不能转录,是该基因表达异常或失活的另一途径1,2。国外对包括肺癌在内的

3河南省科技攻关资助项目(编号河南中医学院解剖组胚学科

多种肿瘤进行的研究表明,p16基因CpG岛高度

甲基化是肿瘤中该基因的常见变异3。我们运用较为成熟的甲基化特异性PCR(Methylation2specificPCR,MSPCR)检测了部分肺癌及肺部良性疾病患者的组织标本和相应的支气管肺泡灌洗

现将液(BALF)及痰标本中p16基因甲基化状态。

热启动PCR，是提高PCR特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生而阻止引物与基因组DNA上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。

热启动PCR可通过三种方式实现：

1)手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg离子或dNTP），当反应液升温到80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误差，可能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低

2)将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；

3)使用热启动DNA聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动DNA聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动DNA聚合酶的价格较高。

降落PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对PCR循环条件进行耗时的优化实验。降落PCR过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低10-15℃。

在最初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。

巢式PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加DNA扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式PCR在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。

多重PCR，指在一个PCR管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重PCR检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增6个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重PCR基础上发展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术)使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重PCR耗时的优化步骤。

长距离PCR，普通的Taq聚合酶一般只能扩增不超过3-5kb的片段，通过使用特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的DNA链（10-40kb以上）。长距离PCR时经常会在10-15个循环后，使每个循环的延伸时间都比上一循环的时间增加10秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。

菌落PCR，通过PCR手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过PCR预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为PCR反应的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。

逆转录PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：

由于PCR的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。

RT-PCR可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定RNA转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。

一种RT-PCR方法，当对DNA序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增cDNA的5'端（对应转录的起始位点）或3'端从而产生新的cDNA，重叠的RACE产物可结合起来产生全长的cDNA片段。

差异显示技术，用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的RT-PCR产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带，只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。

不对称PCR，可选择性的扩增出靶DNA的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称PCR的基础上发展出Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，线性指数PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。

通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的DNA链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向DNA链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生最终的长链DNA分子。

甲基化特异性的PCR，用于研究基因组CpG岛的甲基化模式。首先是用亚硫酸氢钠处理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量PCR，可以对甲基化程度进行定量。

连接介导PCR，首先使用小的寡核苷酸接头连接靶DNA片段，然后选择与接头结合的PCR引物来扩增未知的靶片段。这一技术主要用在DNA测序、染色体步移技术（genome walking）和DNA指纹图谱等。

扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。

机扩增多态性DNA，使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因，形成基因组指纹图谱，用来分析物种的相关性。

可变数目串联重复序列PCR，使引物定位在具有长度多态性的靶基因区，通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。

等位基因特异性PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变定位在（或接近）引物的3'端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示不同的基因型。

一种DNA指纹图谱技术，所选的引物定位在基因组的片段重复区（如Alu族），扩增后产生基于不同产物长度的唯一的指纹图谱。

反向PCR，允许扩增已知序列侧翼的DNA区。首先将靶DNA用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。

定量PCR，用来测定样本中的靶DNA的量。最初的定量PCR主要是指Competitive PCR（竞争定量PCR）。竞争定量PCR：在反应混合物中加入起始拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产物长度与靶序列产生的产物长度不同，在PCR过程中对照与靶基因竞争相同的引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推断初始靶基因的拷贝数，由于内部对照和靶基因在扩增中的效率不一定相同，所以定量结果会产生偏差。

实时PCR，由于通常的PCR在几十个循环后都会进入平台期，产物的量与初始模板量不在成正比，因此只能用来定性。而实时PCR通过使用荧光染料，例如SYBR Green或荧光标记探针，例如TaqMan可用来检测随着扩增的进行，产物量的变化而进行定量。