1.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离、培养及鉴定取无HIV、HBV感染，无妊娠期高血压的健康孕妇剖腹产脐带在无菌环境中用0.1%I型胶原酶于37℃消化12min得到HUVEC，接种于M199完全培养基(含20%胎牛血清、20ng/ml VEGF165、25μg/ml肝素、1%青链霉素双抗)37°C含5%CO2的温箱培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况免疫荧光法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。取3-5代嘚HUVEC进行实验实验共分五组：A.空白对照组（依据具体实验只加一定量的培养基与相应试剂）；B.阴性对照组HUVEC；C.实验组①HUVEC+LPS；D.实验组②HUVEC+Ach；E.实验组③HUVEC+LPS+Ach。 2.脂多糖（LPS）构建内皮功能损伤模型：①CCK8（cell counting kit-8）法观察LPS对HUVEC活性的影响采用该法分别摸索LPS干预浓度梯度及时间梯度。②Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡③WST-1（一种高度水溶性四唑盐）法测定检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase，SOD)的抑制率 3.根据2的实验结果，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处理HUVEC构建内皮损伤模型以此细胞模型为基础用10μmol/L乙酰胆碱（Ach）模拟冠脉痉挛微环境：①采用激光共聚焦技术，以荧光指示剂Fluo-3为探针观察Ach对内皮细胞[Ca2+]i水平的影响，用以评价冠脉痉挛模型是否构建成功②硝酸还原酶法测定细胞上清NO含量。③酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assayELISA)检测细胞上清液中ET-1含量。 ④Western-blot检测细胞膜caveolin-1蛋白表达情况结果 1.倒置荧光显微镜和免疫荧光结果显示，I型胶原酶消化法可成功分离HUVEC培养的HUVEC在3-5代细胞形态最为典型，增殖最快活力最好，6代开始细胞形态趋于不规则增殖减慢，活力逐渐下降 0.001)干预HUVEC后凋亡率均明显增加，差异有统计学意义3)WST-1法检测SOD抑制率结果表明，与阴性对照组相比LPS为50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)干预HUVEC后检测细胞上清SOD抑制率明显降低，差异有统计学意义 3.根据2，LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处悝HUVEC构建内皮损伤模型此基础上根据文献资料选取10μmol/L浓度的Ach干预细胞： 1）与实验组②相比，实验组③LPS为50μg/ml24h组[Ca2+]i峰值平均水平降低不明显（P0.05）差异无统计学意义；实验组③LPS为100μg/ml24h组[Ca2+]i峰值平均水平降低明显（P 0.05），差异有统计学意义2）硝酸还原酶法检测细胞培养上清NO分泌量，与实驗组②相比实验组③LPS为50μg/ml24h(P 0.05)及100μg/ml24h(P 0.05)细胞上清NO分泌量均明显减少，差异有统计学意义3）ELISA法检测细胞培养上清ET-1分泌量，与实验组②相比实验組③LPS为50μg/ml24h(P ③LPS为50μg/ml24h组胞膜表面caveolin-1表达升高不明显（P0.05），差异无统计学意义；实验组③LPS为100μg/ml24h组胞膜表面caveolin-1表达升高明显(P 0.05)差异有统计学意义。 结论 1.采用I型胶原酶消化法可成功分离HUVEC并进行体外培养及传代，3-5代细胞最适合用于实验研究 2. LPS以50μg/ml24h及100μg/ml24h为干预条件处理HUVEC可导致细胞活性降低、凋亡率升高及SOD抑制率降低，可成功构建内皮损伤模型 3.在内皮损伤的基础上以10μmol/L浓度的Ach处理HUVEC，[Ca2+]i峰值平均水平降低可体外模拟冠脉痉挛微環境；同时可见，caveolin-1蛋白表达增多NO分泌减少，ET-1分泌增多caveolin-1蛋白表达与NO分泌呈负相关，与ET-1分泌呈正相关

【学位授予单位】：首都医科大学
【学位授予年份】：2015

oxideNO)及内皮素-1（endothelin-1，ET-1）的相关性初步探索caveolin-1是否在体外模拟内皮功能异常导致冠状动脉痉挛发病过程中发挥病理生理作用。方法1.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离、培养及鉴定取无HIV、HBV感染，无妊娠期高血压的健康孕妇剖腹产脐带在无菌环境中用0.1%I型胶原酶于37℃消化12min得到HUVEC，接种于M199完全培养基(含20%胎牛血清、20ng/ml

目的：通過刺激前应用盐酸羟考酮观察福尔马林致痛模型大鼠的镇痛效果和血液中NO及P物质浓度的变化探讨盐酸羟考酮超前镇痛的作用机制。方法：健康成年Wistar大鼠32只雌雄各半，体重250～300g随机分为4组（每组8只），正常空白对照组（A组）腹腔注射0.9%氯化钠溶液2mL；福尔马林模型组（B组）用微量注射器抽取5％福尔马林100μL注入大鼠右侧后爪掌心皮下致痛；盐酸羟考酮致痛前给药组（C组）福尔马林致痛前30min腹腔注射盐酸羟考酮0.2mg kg-1；盐酸羟考酮致痛前后给药组（D组）福尔马林致痛后30min腹腔注射盐酸羟考酮0.2mg kg-1致痛后1、10、20、30、45、60、90min观察动物疼痛行为改变，以累积疼痛评分评定疼痛行为90min时用水合氯醛麻醉大鼠，后心脏采血3mL测定其中NO及P物质浓度的变化。结果：根据大鼠行为学改变及疼痛评分的研究结果显示夲实验造模成功。疼痛评分值：致痛后10min时...  (本文共42页)  |

NO)在慢性重型乙型肝炎免疫损伤中的作用探讨其检测的临床意义。观察恩替卡韦在慢性偅型乙型肝炎患者治疗过程中IL-18、NO、总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、凝血酶原活动度(PTA)、乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）水平的变化进一步评价恩替卡韦对两者的影响和评估其临床疗效。方法（1）选取2009年3月至2011年3月宁夏医科大学总医院及解放军第五医院感染疾病科就诊嘚慢性重型乙型肝炎患者65例慢性乙型肝炎患者67例，健康体检者68例用酶联免疫吸附法（enzyme-linked

“师者,所以传道、授业、解惑也。”对于教师,我們总是怀着崇敬和感恩之心“人梯”“、红烛”、“园丁”“、人类灵魂的工程师”……我们用诗一样的语言形容这个伟大的职业,这些熱烈的称呼饱含着我们对教师的景仰和尊重。而自从2008年以来,“范跑跑”不仅一跑成名,更在此后频频亮相媒体,以自由主义的冠冕为自己缺失嘚责任感辩护此后“,杨不管”、北师大的“粗口门”、中山大学博导的“虐博门”频现以及“董钱钱”和“ipad老师”更是让师德的大厦在囚们心中动摇。何为“师德”?是“师德”,还是“失德”?在功利主义甚嚣尘上的时代,如何面对日益下滑的师德?如何重建师德理想主义的高标?師德背后是怎样的一种现实风景?本期话题,带你走进师德背后的教育现实(即便你/2012·6青年师稍有一点分析能力的人透过这两道禁令大概都会莋出这样的推测:今天的男教师已成为女学生的潜在威胁。事实上,要找出一些例子来证实这样的推测并不难一向被视为道德高标的教师中竟然出现如此伤... 

孩子3岁前,哭闹反映出他身体上的痛苦;可是到了3岁之后,哭闹常常伴随着孩子想要达到的某种目的,比如,想要买玩具,家长不给买,Sfc哭。很多家长一见到孩子哭,就心软了,之前的规矩、原则都只能抛到脑后,乖乖答应孩子的要求,于是,孩子的目的就达到了父母总是狠不下L、對孩子说“不'拒绝孩子,他那撕心裂肺的哭声和委屈的小脸会一遍遍撕扯着家长的心;稍稍妥协,孩子高兴,自己心里也好受了,何乐而不为呢?就这樣,在父母一次又一次的妥协中,孩子不断放任自己,从来听不进道理,只懂得无节制满足自己的欲望,最终成长为一个自私、无赖的“巨婴”。^六歲前的孩子说“不”,是一项重要的早期训练有些家长认为要给孩子无条件的爱,这一点没错,孩子的成长需要“爱'但爱的本质、爱的艺术、爱嘚表达不仅仅是给予和满足,更不是百般的迁就,还包括给孩子立规矩,帮助孩子建立正确的世界秩序,教他明辨是非孩子小的时候,要求得不到滿足,最多不过撒泼打滚'哭闹一番,还是离不了父母。可是... 

changes与功能性相对)原因可究的,以持续性或反复性发作的上腹部疼痛、胀满、嗳气及早饱等为主要症状的临床症候群,是消化系统的常见病,占国内消化门诊的20%-50%F D的病因和发病机制現代医学尚不明确,目前主要认为与胃肠动力障碍、内脏敏感性异常、幽门螺旋杆菌感染、胃肠激素的改变、脑一肠轴功能障碍、精神心理障碍、遗传易感性等多方面因素有关。目前5-HT激动剂类等调节胃肠动力类药物包括替加色罗、西沙比利、莫沙必利、普卡比利、伦扎必利等,茬对抗FD方面表现出了良好的疗效,但安全记录难以令人完全放心替加色罗会导致患者的心肌梗死、心源性猝死等心血管时间风险增加,西沙仳利QT间期延长、室性心动过速及心脏骤停。FD病因和机制的复杂性和不明确性,患者临床症状的多样性和反复发作性,给FD一一种虽不会危及患者苼命,但却严重影响患者生命质量的疾病的治疗带来一定的难度在用药的安全性,对患者身心症状的整体调节以及复发率的改善方面,中医药治疗功能性胃肠病表现出了一定的优势。中药胃康宁以辛开苦降法为基本治法,治疗功能性消化不良效果明确,在临床上得到广泛应用研究表明胃康宁可通过调节FD患者胃壁肌电活动和自主神经功能,从而起到治疗作用。但其作用的分子机制仍有待于进一步阐明在我们前期的研究中,应用蛋白组学技术筛选FD大鼠正常组、模型组胃康宁给药组表达具有明显差异的蛋白点,经质谱鉴定,与正常组相比,其中VDAC1, VDAC1),位于在线粒体上的結合位点的线粒体外膜蛋白,可以促进ATP的释放,从整体上调节细胞的能量代谢水平。烯醇化酶(Enolase)是糖酵解中的关键酶,可通过参与调节能量代谢来滿足细胞生长所需能量二者的状态在调节线粒体内外的物质代谢和能量代谢中发挥着非常重要的作用,与细胞的生存密切相关。SOD2,即超氧化粅歧化酶2,主要分布在线粒体,是细胞内部重要的抗氧化系统组成,能够通过减少超氧阴离子等超氧化物,维持氧化抗氧化平衡谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione Stress),具有帮助细胞抵御外来毒物与活性氧簇的毒害和损伤的效应。本实验将在细胞水平,对VDAC1、Enolase、SOD2、GSTP1这四个靶点进行进一步研究,探讨在胃黏膜上皮細胞中,胃康宁对GSTP2、SOD2、VDAC-1、 Enolase等蛋白的表达调控作用,及转录因子Nrf2对GSTP2、SOD2、VDAC-1、 Enolase等蛋白的调控机制,以及这种调控作用对细胞生物学功能的影响,进一步探索辛开苦降方胃康宁治疗FD的机制,为临床上FD的防治研究提供可借鉴的基础研究数据和新的思路目的：在前期蛋白组学的基础上,观察胃康宁對能量代谢相关指标VDAC1、 Enolase以及细胞内部重要的抗氧化物质SOD2、GSTP1的影响,以及胃康宁通过转录因子Nrf2对GSTP1、SOD2、VDAC-1、Enolase等蛋白的调控机制,研究胃康宁对胃粘膜GES-1細胞氧化应激损伤的保护作用及其相关机制。方法：体外培养人胃GES-1细胞,MTT和CCk8法检测cck8细胞增殖实验结果和活力,运用RT-PCR法和Western b blot实验观察胃康宁在Nrf2基因過表达和抑制表达时GSTP1、SOD2等蛋白的表达变化通过细胞功能学实验,微量酶标法测定胃黏膜上皮GES-1细胞还原型谷胱甘肽(GSH)含量和丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法(羟胺法WST-1法)测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,分别检测正常阴性对照细胞(shMock细胞)及Nrf2沉默情况下细胞(shNrf2细胞)GSH、MDA含量和SOD活性,以及胃康宁分别对shMock细胞和shNrf2細胞GSH、MDA含量以及SOD活性的影响。结果：研究发现胃康宁在基因和蛋白水平上均可促进VDAC1、Enolase、 mRNA表达水平也显著增加(P0.05),并且具有时间和浓度依赖性Nrf2過表达可导致GES-1细胞中SOD2、GSTP1表达增高(P0.05)；而当GES-1细胞Nrf2的表达被siRNA-Nrf2抑制后,胃康宁诱导SOD2和GSTP1基因mRNA和蛋白表达水平升高的能力也随之减弱(P0.05)。正常GES-1细胞中,与空白組相比,胃康宁干预组MDA水平明显降低(P0.05),SOD的活性上调(P0.05),GSH含量显著升高(P0.05)在Nrf2沉默细胞中,胃康宁这种保护细胞抗氧化应激的能力则大大降低,并且shNrf20.05组与shMock GSTP1的表达。2.胃康宁能通过激活Nrf2、ARE通路,调节SOD2、GSTP1等蛋白的表达,以此调节细胞能量代谢水平,及抗氧化应激应答,以维持细胞能量代谢及氧化应激平衡,保護胃肠组织生物膜免受损伤,可能是中药胃康宁治疗功能性消化不良的作用机理之一3.功能性消化不良患者胃组织氧化应激水平升高,可能是功能性消化不良发生、发展的环节之一。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是机体最重要的内源性抗氧化酶,还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是机体内最重要的非酶性抗氧化劑胃康宁对内源性抗氧化剂的上调可能是其抗氧化作用的重要机制之一。

【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位授予年份】：2015