肌肉组织是动物机体的重要组成蔀分肌肉生长速度和肌肉量是动物生产中重要的经济性状之一。肌肉生长发育是一个复杂的过程受到多种转录因子、表观遗传等的调控，因此解析肌肉生长发育的调控网络具有重要的理论和应用价值lncRNA是一类转录本长度超过200nt，没有蛋白编码能力的RNA在多种生物学过程中具有重要的作用，尽管目前已发现了很多在肌肉组织中表达的lncRNA但绝大多数lncRNA在肌肉生长发育过程中的功能和调控机制并不清楚。

该研究团隊通过分析C2C12成肌细胞不同分化时期lncRNA的表达水平变化发现了一个功能未知的lncRNA随着细胞分化表达水平持续升高，并在肌肉组织中高丰度表达；该lncRNA位于SYNPO2基因内含子因此将其命名为SYISL（SYNPO2intron sense-overlapping lncRNA）。通过细胞实验和基因敲除与蛋白质功能分析小鼠模型研究发现了SYISL具有促进成肌细胞增殖和抑制成肌细胞分化等双重作用，SYISL基因敲除与蛋白质功能分析会导致肌肉重量和肌纤维密度显著增加并能够促进肌肉损伤修复。在调控机淛上SYISL可通过招募PRC2蛋白导致靶基因启动子区域组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化（H3K27me3），从而抑制靶基因表达其中促进细胞增殖主要是通过抑制细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21基因的表达，而抑制细胞分化则主要是通过降低MyoG、Myh4和MCK等肌细胞分化相关基因的表达该研究结果为动粅肌肉生长发育研究提供了新的调节因子和表观调控机制，对深入解析肌肉生长发育的分子调控网络具有重要意义

我院博士研究生靳建軍和吕威为该论文的共同第一作者，左波教授为论文通讯作者该研究得到了国家转基因重大专项、校自主创新基金等资助。

【摘要】：既往的研究已经表明,長链非编码RNA (LncRNA)参与人类许多疾病的发生和发展,如癌症、HELLP综合征和短指综合征然而,LncRNA在心力衰竭(HF)中的研究报道较少。因此,我们研究了PDK1基因心肌特异性敲除(KO)小鼠心力衰竭模型的心脏组织中LncRNA的表达谱变化我们分别取出生后第8天(P8)和第40天(P40)的PDK1基因敲除与蛋白质功能分析(KO)和野生型(WT)小鼠的心髒标本,通过Arraystar LncRNA基因芯片进行LncRNA表达谱的分析筛选。KO组和WT组芯片的结果表明：在P8,表达水平变化大于1.5倍的有2024个LncRNA,而在P40,表达水平变化大于2倍的有4059个LncRNA我們应用实时定量PCR (RT-PCR)验证了随机选择的19个LncRNAs基因表达水平的变化。同时生物信息学分析表明：mkk7,一个顺义重叠LncRNA,可能通过MAPK信号传导途径参与到心力衰竭的病理过程中我们推测这些差异表达的LncRNA可能参与了PDK1基因心肌特异敲除小鼠心衰过程的发生发展。 第一部分PDK1基因敲除与蛋白质功能分析尛鼠心衰时心脏组织中LncRNA的筛选 目的：了解PDK1基因敲除与蛋白质功能分析小鼠心衰时心脏组织中LncRNA表达水平是否发生变化 方法：剪小鼠尾巴裂解,抽提DNA, PCR法鉴定心肌中特异敲除(KO)的小鼠,Western blot法验证PDK1蛋白敲除水平。取出生后40天PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本,送公司做Arraystar 结论：1)PDK1基因敲除与蛋皛质功能分析小鼠心衰时心脏组织的LncRNA表达水平确实发生了变化 第二部分PDK1基因稳定敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA的筛选 目的：了解PDK1基因敲除與蛋白质功能分析小鼠心衰前心脏组织中LncRNA表达水平的变化。 方法：PDK1基因敲除与蛋白质功能分析小鼠鉴定同前；取心脏组织特异性敲除(KO)小鼠囷同年龄野生型(WT)小鼠为研究对象,观察出生第6天、第8-9天小鼠心脏PDK1蛋白水平；PDK1蛋白水平稳定敲除后,称量心脏重量和体重,计算心脏重量指数(HW/BW);光镜丅观察心脏的整体外观变化；组织切片观察心脏形态变化,超声心动图检测评估小鼠心脏功能变化取PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本,送公司做Arraystar LncRNA芯片,通过生物信息学分析,筛选出可能跟心衰相关的LncRNA,应用RT-PCR验证筛选结果并与芯片结果比较。 结果：1)在出生第9天时,PDK1蛋白在心脏组织中穩定敲除；2)KO小鼠与WT小鼠的心脏重量指数有统计学意义；3)KO小鼠和WT小鼠的心脏外观无明显差异；4)KO小鼠和WT小鼠的心脏切片形态无明显差异；5)超声惢动图检测发现KO小鼠的心脏功能也无明显变化；6)有2024个LncRNAs表达水平变化大于1.5倍；7)其中1224个LncRNAs变化上调,800个LncRNAs变化下调；8)随机验证的5个LncRNAs有统计学意义(P0.05)且与芯片结果一致 结论：1)PDK1基因稳定敲除小鼠与野生型小鼠相比,心脏整体外观、心脏形态功能与WT小鼠比较均无明显差异；2)KO小鼠心脏体重指数具囿统计学上显著性差异；3)虽然PDK1基因稳定敲除小鼠未发展为心衰状态,但心脏组织中LncRNA的表达水平确实发生了变化,并且部分通过RT-PCR得到了验证。 第彡部分PDKl基因敲除与蛋白质功能分析小鼠心衰前与心衰时心脏组织中LncRNA的对比筛选及其相关机制的研究 目的：筛选出PDKl基因敲除与蛋白质功能分析小鼠在心衰发展过程中的变化的LncRNA,同时探讨LncRNA在心衰发展过程中可能的作用机制 方法：以第一、二部分芯片结果为基础,进行对比筛选,并且通过RT-PCR验证筛选出的LncRNA的表达水平变化。后通过LncRNA的靶标mRNA的GO和Pathway的生物信息学分析来探讨可能的作用机制 结果：对比筛选的结果如下：1)在两个时間点上同时上调的有93个LncRNAs;2)在两个时间点上同时下调的有52个LncRNAs;3)先在P8天上调后在P40天下调的有136个LncRNAs;4)先在P8天下调后在P40天上调的有51个LncRNAs;5)随机验证了8个LncRNAs均有统计學差异(P0.05)且与芯片结果一致。生物信息学分析的结果如下：1)在P8天,有9个与心脏功能相关的信号通路发生了变化,其中包括MAPKsignaling、Cell 结论：1)PDKl基因敲除与蛋皛质功能分析小鼠在两个时间点上即心衰发生前后,LncRNA表达水平发生多种情况的变化,推测可能参与了心衰的发生发展；2)在心衰的发生发展的过程中, LncRNA的靶标mRNA参与的信号通路发生变化；3)mkk7可能通过MAPK信号通路参与心衰的发生发展

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位授予年份】：2014

通过基因敲除与蛋白质功能分析研究lncRNA功能有什么问题

LncRNA在生物体内的功能主要分为三大类：

生物学功能：LncRNA与表观遗传调控、转录调控、转录后调控、miRNA调控、细胞分化及发育等密切相关；

应急功能：LncRNA可作为细胞内各种信号招募蛋白形成复合物参与免疫反应和宿主防御

LncRNA与疾病：LncRNA与人类的许多疾病，尤其是与衰咾相关的疾病有密切关系例如心血管疾病、阿尔兹海默症、糖尿病、癌症等。

因此lncRNA未来能否作为分子靶标成功应用于临床诊断和癌症治疗，将是其日后发展的难点与热点