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果蔬中维生素C的测定
实验十：果蔬中维生素 C 的测定（2，6―二氯靛酚滴定法） 教学目的要求 基本知识点 1、了解从果蔬中提取 VC 的方法。 2、掌握 2，6―二氯靛酚滴定法测定果蔬中 VC 的原理、基本过程和操 作关键。 3、熟练采样、样品处理、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 4、掌数据处理和结果计算技术。 重点 2，6―二氯靛酚滴定法测定果蔬中 VC 的基本过程和操作关键。 难点 2，6
―二氯靛酚滴定法测定果蔬中 VC 的原理 课时教学方案： 复习与提问： 1、2，6―二氯靛酚滴定法测定果蔬中 VC 的原理。 2、2，6―二氯靛酚滴定法测定果蔬中 VC 的基本过程和操作关键。 3、检查学生实验准备情况。 【引入新课】 VC 在人体内的主要功能是：参加体内的氧化还原过程，促进人体的生长发 育，增强人体对疾病的抵抗能力，促进细胞间质中胶原的形成，维持牙齿、骨 骼、血管和肌肉的正常功能，增强肝脏的解毒能力。当人体中缺少 VC 时，就 会出现牙龈出血、牙齿松动、骨骼脆弱、粘膜及皮下易出血、伤口不易愈合等 症状。近年来，科学家们还发现，VC 能阻止亚硝酸盐和仲胺在胃内结合成致 癌物质―亚脱胺，从而减低癌的发病率。 据测定，成年男子每天约需 VC 65 mg，成年女子每天约需 VC 60 mg。 VC 广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是猕猴桃、鲜枣、草 莓、枇杷、橙、橘、柿子等含有丰富的 VC。以 100g 水果的 VC 的含量来计算， 猕猴桃含 420mg，鲜枣含 380mg，草莓含 80mg，橙含 49mg，枇杷含 36mg，橘 含 30mg，柿子含 30mg。但葡萄、无花果、苹果各自只有 5mg，香蕉、桃子各 含 10mg，梨子仅含 4mg。 实验十：果蔬中维生素 C 的测定 ―2，6―二氯靛酚滴定法 维生素 C 是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病， 因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid） 。化学名称为：L-3-氧代苏己糖醛酸内 酯 【英文名： Ascorbic Acid(INN)】 分子式为 C6H8O6 ， ， 相对分子质量： 176.13。 自然界存在两种形式的维生素 C：抗坏血酸（还原型 VC）和脱氢抗坏血酸（氧 1化型 DHVC） 抗坏血酸易氧化成脱氢抗坏血酸， , 脱氢抗坏血酸又易还原成抗坏 血酸。 ，脱氢抗坏血酸水解后生成二酮古乐糖酸，失去抗坏血酸的生理活性。图 1 维生素 C 的构造式及其氧化还原 异抗坏血酸是抗坏血酸的异构体,化学性质与抗坏血酸相似,易被吸收， 但几乎没有抗坏血酸的生理活性（仅约二十分之一)。异抗坏血酸和抗坏血酸 棕榈酸酯只用作抗氧化剂，防止食品变质、水果变色以及腌肉。 VC 是无色晶体，属于水溶性维生素，易溶于水，水溶液呈酸性。在酸性 溶液中稳定，在中性或碱性溶液中易被氧化分解，遇热极易破坏。具有较强的 还原性，易氧化，铁、铜等金属离子能够加速其氧化速率。 一、实验目的 通过本实验加深对 2，6―二氯靛酚滴定法测定果蔬中维生素 C 的原理的 理解，掌握其操作要点，熟练基本操作技术。 二、实验原理 2、6―二氯靛酚是一种染料，其颜色反应表现为两种特性。一是取决于氧 化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态为无色；二是受其介质酸度的影响，在 碱性介质中呈深蓝色，在酸性溶液介质中呈浅红色。 用蓝色的碱性染料标准液，滴定含 VC 的酸性浸出液，染料被还原为无色， 到达终点时，微过量的 2、6―二氯靛酚染料在酸性溶液中呈浅红色即为终点。 从染料消耗量即可计算出试样中还原型抗坏血酸量。 AA+氧化型染料(碱性)→DAA+还原型染料 （蓝色） （浅红色） 还原型抗坏血酸能还原染料 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP） ，本身则氧化为脱 氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用 此染料滴定含有维生素 C 的酸性溶液时， 维生素 C 尚未全部被氧化前， 则滴下 的染料立即被还原成无色。 一旦溶液中的维生素 C 已全部被氧化时， 则滴下的 2染料立即使溶液变成粉红色。 所以， 当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中 的维生素 C 刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提 取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。 本法用于测定还原型抗坏血酸，测定总抗坏血酸含量常用 2,4-二硝基苯 肼法和荧光分光光度法测定。O C HO C O HO H HO CCl + ON OHH+CClC C H2OH 还 型抗 血酸 原 坏 O C O C O O H C 色 2，6－二氯 酚靛酚 (红 )OHCl ON O (蓝 色 )ClCl + O ClN H OHC CHO(无色 ） 还 型2，6－二氯 酚靛酚 原 C H2OH 氧 化型脱氢 抗 血酸 坏想一想：测定原理明白吗？ 三、材料 猕猴桃、黄瓜、卷心菜各 500g。 四、仪器： 1、研钵 (1 个/2 组) 【代替高速组织捣碎机:8000 r/min～12000r/min】 2、扭力天平（感量 0.01g） 3、小刀（4 把/班，合用） 4、50mL 移液管（2 支/全班） 5、500mL、50mL 烧杯（2 个//2 组） 6、胶头吸管（1 支/组） 7、100mL 容量瓶（1 个/组） 8、细玻璃棒（1 支/组） 9、漏斗（1 个/组） 10、滤纸（2 张/组） 11、10mL、5mL、2mL、1mL 移液管（1 支/2 组） 312、100mL、50mL 锥形瓶（3 个/组） 13、碱式滴定管（1 支/组） 14、电炉（2 个/2 组） 结合实验想一想，以上列举仪器全面吗？ 五、试剂 1、20g/L 草酸溶液：称取 20g 草酸，加水至 1000mL； 2、10g/L 草酸溶液：称取 10g 草酸，加水至 1000mL； 3、淀粉指示剂：取 1g 可溶性淀粉，加 10mL 冷水调成稀粉浆，倒入正在 沸腾的 100mL 水中，搅拌至透明，放冷备用。 4、60g/L 碘化钾溶液。 5、0.0167mol/L KIO3 标准溶液：准确称取经 105℃烘干 2h 的基准碘酸钾 3.5670g（0.3567 g） ，用水溶解并稀释至 1000mL（100mL）【KIO3 分子量 214】 。 -4 6、1.67×10 mol/L KIO3 标准溶液。准确吸取 0.0167mol/L KIO3 标准溶液 1 mL，用水稀释至 100 mL。此溶液 1mL 相当于维生素 C 0.088mg。 7、异戊醇。 结合实验想一想： （1）以上列举试剂全面吗？ （2）以上两种草酸溶液各有什么用途？ 六、操作方法： （一）维生素 C 标准使用液的配制与标定。 1、配制维生素 C 标准贮备液：精密称取 20mg 纯 L-抗坏血酸，用 10g/L 草酸溶解，并定容至 100mL。 注：相近两组做一份共用 2、 配制维生素 C 标准使用液： 吸取维生素 C 标准贮备液 5mL 于 50mL 容量 瓶中，用草酸溶液(10g/L)定容。 3、标定：准确吸取上述维生素 C 标准使用液 25.0mL 于 50mL 锥形瓶中， 加入 0.5mL 60g/L 碘化钾溶液，3～5 滴淀粉指示剂 (10g/L)，混匀后用 0.0010mol/L 标准碘酸钾溶液滴定至淡蓝色（极淡蓝色）为终点。 重复操作 三次，取平均值计算 L-抗坏血酸的浓度。C ? V 1 ? 0 . 088 V2式中：C―维生素 C 的浓度，mg/ mL； V1―滴定时消耗 1.67×10-4mol/L 碘酸钾标准溶液的体积，mL； V2―吸取维生素 C 标准使用液的体积，mL； 【5mL】 -4 0.088―1.00mL 碘酸钾标准溶液 (1.67×10 mol/L) 相当的维生素 C 4的量，mg。 提示： 1、标定原理 还原型 VC+I2→脱氢型抗坏血酸+2HI KIO3+3H2C2O4+5KI→3I2+3K2C2O4+3H2O 2、滴定时可同时吸取两份。 一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考。 （二）2、6―二氯靛酚的配制与标定： 配制：称取 52mg 碳酸氢钠，溶解于 200mL 热蒸馏水中，然后称取 50mg 2，6―二氯靛酚溶解于上述碳酸氢钠溶液中，冷却后，移入 250mL 容量瓶中， 用蒸馏水稀释定容。过滤于棕色瓶内，保存于冰箱中。每次使用前，用标准抗 坏血酸标定其滴定度。 标定：吸取已知浓度的维生素 C 标准使用溶液 5.00mL 于 50mL 锥形瓶中， 加 5mL10g/L 草酸溶液，用 2.6―二氯靛酚溶液滴定至呈粉红色，且 15s 不褪 色即为终点。同时，另取 5mL10g/L 草酸溶液做空白试验。重复操作三次，取 平均值计算 L-抗坏血酸的浓度。T ? c?V V1 ? V 2式中： T ―每 mL 2，6―二氯靛酚溶液相当于维生素 C 的毫克数； C―维生素 C 标准使用液的浓度，mg/ mL； V―标定时吸取维生素 C 标准使用液的体积，mL； V1―滴定抗坏血酸溶液消耗 2，6―二氯靛酚的溶液的体积，mL。 V2―滴定空白所用 2，6－二氯靛酚溶液的体积, mL。 注：相近两组做一份共用 （三）样品处理 1、去除不可食性部分：苹果去皮、核；黄瓜、 ：清洗； 2、粉碎：称取新鲜的具有代表性样品的可食部分 100.00 g，迅速置打碎 机中，用移液管准确加入 20g/L 草酸溶液 100 mL，快速打成匀浆，转移至 500 mL 洁净的烧杯中备用。 3、浸提：用 50 mL 干净、干燥的小烧杯在扭力天平上称取匀浆 20.00 g， 加入适量的（10 mL ~20 mL）10g/L 草酸，搅匀，小心转移至 100 mL 容量瓶 中，用 10g/L 草酸稀释定容，摇匀。 4、过滤：用小漏斗和滤纸过滤，取中间滤液备用，用 50 mL 小烧杯承接。 想一想： 1、加入 20g/L 草酸溶液的目的是什么？ 52、新鲜的具有代表性样品的可食部分 100.00 g 应采用什么仪器称量？ 3、为什么要取中间滤液？ 4、过滤的规范操作应注意哪些方面？ 提示： 1、若滤液有色,可按每克样品加 0.4g 白陶土脱色后再过滤。 2、维生素 C 在酸性条件下较稳定，故样品处理或浸提都应在弱酸性环 境中进行。浸提剂以偏磷酸 (HPO3) 稳定维生素 C 效果最好，但价格较贵。一 般可采用草酸 (20g/L)代替偏磷酸，价廉且效果也较好。 3、测定维生素 C 时，应尽可能分析新鲜样品，在不发生水分及其它成 分损失的前提下，样品尽量捣碎，研磨成浆状。需特别注意的是：研磨时， 加与样品等量的酸提取剂以稳定维生素 C。 （四）滴定 吸取样品处理液滤液 10.00 mL 于 50 mL 锥形瓶中，迅速用已标定过的 2、 6―二氯靛酚溶液滴定，至溶液出现红色，15S 不褪色为终点。重复三次，平 行误差＜0.1 mL。同时作空白试验：吸取 10.00mL1%草酸溶液于 50 mL 锥形瓶 中，迅速用已标定过的 2、6―二氯靛酚溶液滴定，至溶液出现红色，15S 秒不 褪色为终点。重复三次，平行误差＜0.1 mL。 提示：整个操作过程应迅速，滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红 色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色 15 秒内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定 终点以出现红色 15 秒不褪色为终点。 想一想： 1、如何准确判断滴定终点？ 2、样品处理液滤液 10.00 mL 相当于多少原始样品？ 3、本法终点指示剂是什么？其变化特点是什么？ 4、10mL 样品处理液滤液、10mL1%草酸溶液如何取？ 七、数据记录与计算 （一）数据记录 1、维生素 C 标准使用液的标定 Ⅰ滴定时消耗碘酸钾标准溶液的体积， mL 吸取维生素 C 标准使用液的体积，mL 维生素 C 的浓度，mg/ mLC ? V 1 ? 0 . 088 V2ⅡⅢ平均值=62、2、6―二氯靛酚的配制与标定 Ⅰ滴定标准抗坏血酸使用溶液消耗 2,6―二氯靛 酚的溶液的体积，mL 滴定空白所用 2,6－二氯靛酚溶液的体积, mL 标定时吸取维生素 C 标准使用液的体积，mL 维生素 C 标准使用液的浓度，mg/ mL 每 mL 2,6―二氯靛酚溶液相当于维生素 C 的毫 克数T ? c?V V1 ? V 2ⅡⅢ平均值=（3）样品中还原性抗坏血酸含量的测定 Ⅰ滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL 滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL 称取匀浆相当于原样品的质量，g 1mL 染料溶液 (2,6―二氯靛酚溶液) 相当于 维生素 C 的质量，mg；X ? T (V ? V 0 ) m? 10 100 ? 100ⅡⅢ平均值样品中还原型维生素 C 的含量，mg/100g=（二）结果计算X ? T (V ? V 0 ) m? 10 100 ? 100式中：X―样品中还原型维生素 C 的含量，mg/100g； T―1mL 染料溶液 (2,6―二氯靛酚溶液) 相当于维生素 C 的质量， mg； V―滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL； V0―滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL； m―称取匀浆相当于原样品的质量，g。 想一想：公式中各种数字和符号的意义！ 要求：平行测定的结果，用算术平均值表示，取三位有效数字，含量低 的保留小数点后两位数字。 7平行测定结果的相对相差，在维生素 C 含量大于 20mg/100g 时，不得超 过 2％，小于 20mg/100g 时，不得超过 5％。 八、课时总结 1、本法测定的结果为食品中的还原型 L-抗坏血酸含量，而非维生素 C 总 量。此法是测定还原型 L-抗坏血酸最简便的方法，适合于大批果蔬，但对红 色果蔬不太适宜。 。 2、维生素 C 在酸性条件下较稳定，故样品处理或浸提都应在弱酸性环境 中进行。浸提剂以偏磷酸 (HPO3) 稳定维生素 C 效果最好，但价格较贵。一 般可采用草酸 (20g/L)代替偏磷酸，价廉且效果也较好。 3、样品处理过程中加入等量的 2%草酸，目的是抑制抗坏血酸氧化酶， 避免维生素 C 氧化损失，也可用 2%偏磷酸代替。 4、某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物在 100 mL 容量瓶中泡 沫太多，可加入戊醇 2~3 滴消除之。 5、同法作空白实验，消除系统误差。 6、整个操作过程应迅速，滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不 立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色 15 秒 内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定终点以 出现红色 15 秒不褪色为终点。 7、操作要迅速，防止还原型维生素 C 被空气中的氧化。滴定过程一般不 超过 2min。滴定所用的染料不应小于 1mL 或多于 4mL，如果样品含维生素 C 太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。 8、整个操作过程应迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化。滴定开始时，染 料溶液应迅速加入直至红色不立即消失， 而后尽可能一滴一滴地加入， 并不断 摇动三角瓶，至粉红色 15s 内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料， 但速度较慢，故滴定终点以出现红色 15s 不褪色为终点。滴定时，可同时吸 二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考。 9、所有试剂配制最好用重蒸馏水。整个操作过程尽量避免溶液接触金属 离子。 10、对动物性的样品可用 10%三氯醋酸代替 2%草酸溶液提取；对含有大 量 Fe 的样品，如储藏过久的罐头食品可用 8%醋酸溶液代替草酸溶液提取。 11、若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土吸附色素后 再过滤。白陶土使用前应测定回收率，同时做空白试验。 12、2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而 1%草酸无此作用。 13、干扰滴定因素有： 8（1）色素 若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶 土脱色，或加 1mL 氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。 （2）Fe2＋ Fe2＋可还原二氯酚靛酚。对含有大量 Fe2＋的样品可用 8%乙酸 溶液代替草酸溶液提取，此时 Fe2＋不会很快与染料起作用。 （3）样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸 慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不 断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于 15s 内不消退为终点。 （4）若试样中含有 Fe2＋、Cu2＋、Sn2＋、亚硫酸盐等还原性杂质，会使结 果偏高。可通过以下方法来校正：取 10mL 提取液两份，各加入 10g/L 硫酸铜 溶液 1mL，在 110℃加热 10min，冷却后用染料滴定。有铜存在时，抗坏血酸 完全被破坏，从样品滴定值中扣除校正值，即得抗坏血酸含量。 14、提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。 九、实验结果与分析讨论 （一）检测结果及质量评价 1、说明检测结果 2、 查阅“食物成分表”， 核对被测水果或蔬菜的维生素 C 含量(mg/100 g)。 （二）分析讨论 1、如果计算结果与“食物成分表”中的相应数值有误差，请分析出现误 差的可能原因。 2、为了测得准确的维生素 C 含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？ 为什么？ 十、思考题： 1、试述本法测定维生素 C 的原理。 2、试述碱性染料的变色特征？ 3、在生产和储备食品过程中，L-抗坏血酸能被氧化成 L-脱氢抗坏血酸。 你如何用 2，6-二氯酚靛酚滴定法来测定总的维生素 C 含量，以及如何分别测 定这两种形式。 4、食品中维生素 C 测定的方法有哪些，各自的原理和适用范围是什么？ 5、测定脂溶性维生素时样品需如何处理？ 6、测定水溶性维生素时、从样品中提取浓缩可采用那些方法？ 7、计算题： 2、6-二氯靛酚法测定维生素 C 含量。已知维生素 C 标准使用液的浓度是 0.02mg/mL。 （1）标定 2、6-二氯靛酚：取维生素 C 标准使用液 5.00mL，于小锥形瓶 中，加 5 mL10g/L 草酸溶液，用欲标定的 2、6-二氯靛酚溶液滴定。三次消耗 9的体积为：1.01mL； 1.00mL； 0.99 mL。 （2）称取去除不可食部分的菠萝 100.00g，加等量 20g/L 草酸溶液，打 成匀浆。称取匀浆 20.00g 于小烧杯中，用 10g/L 草酸溶液稀释至 100mL，过 滤，取中间滤液备用。 （3） 吸取样品处理滤液 10mL， 50mL 锥形瓶中， 于 迅速用上述标定过的 2、 6-二氯靛酚溶液滴定。 三次消耗 2、 6-二氯靛酚溶液的体积为： 3.20mL； 3.19mL； 3.21mL；空白试验三次消耗 2、6-二氯靛酚溶液的体积为：0.10mL； 0.09mL； 0.11mL； 问题 1：试根据题意,完成原始数据记录表 问题 2：试计算试样中维生素 C 含量。项目 标定 2、6-二氯靛酚溶液消耗的体积，mL 滴定样液时消耗染料溶液的体积，mL 滴定空白时消耗染料溶液的体积，mL 维生素 C 标准使用液的浓度，mg/mL 1mL2,6―二氯靛酚溶液相当于维生素 C 的质量， mg； 称取匀浆相当于原样品的质量，g Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均值河南农业职业学院课时授课方案(两个学时为一个授课单元)授课日期 授课班次 日1～4节 食品生物技术05-1班 日1～4节 食品生物技术05-2班课时教学课题（章节） ： 实验十一：火腿肠中亚硝酸钠含量的测定―盐酸萘乙二胺比色法 10课时教学目的： 1、掌握盐酸萘乙二胺比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的原理、基本过程和 操作关键。 2、 熟练吸光光度分析法的原理、 定量方法和 721 分光光度计的操作方法。 3、掌数据处理和结果计算技术。 课时教学方案： 复习与提问： 1、盐酸萘乙二胺比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的原理。 2、比色法火腿肠中亚硝酸钠含量的基本过程和操作关键。 3、检查学生实验准备情况。 引入新课： 1．亚硝酸钠 亚硝酸钠为白色或微黄色结晶或颗粒状粉末，无臭，味微咸，易吸潮，易 溶于水，微溶于乙醇，在空气中可吸收氧而逐渐变为硝酸钠。 本品是食品添加剂中急性毒性较强的物质之一， 是一种剧药 （在药物学中， 根据毒性试验结果，把毒性较强的物质称为剧药，如亚硝酸钠、氢氧化钠等； 把毒性更强的称为毒药，如三氯化二砷等） 。过量的亚硝酸盐进入血液后，可 使正常的血红蛋白（二价铁）变成高铁血红蛋白（三价铁） ，失去携氧的功能， 导致组织缺氧。潜伏期仅为 0.5～1 小时，症状为头晕、恶心、呕吐、全身无 力、皮肤发紫，严重者会因呼吸衰竭而死。ADI（每日允许摄入量）为 0～ 0.2mg/kg。 我国规定：本品可用于肉类罐头和肉制品，最大使用量为 0.15mg/kg。残 留 量 以 亚 硝 酸 钠 计 ， 肉 类 罐 头 不 得 超 过 0.05mg/kg ， 肉 制 品 不 得 超 过 0.03mg/kg。此外，还规定亚硝酸盐可用于盐水火腿，但应控制其残留量为 70ppm。 2．硝酸钠 硝酸钠的毒性作用主要是因为它在食物中、 水或胃肠道， 尤其是在婴幼儿 的胃肠道中，易被还原为亚硝酸盐所致，其 ADI 为 0～5mg/kg。我国规定：本 品可用于肉制品，最大使用量为 0.5g/kg，其残留量控制同亚硝酸钠。 3．亚硝酸盐的安全性问题 近年来， 人们发现亚硝酸盐能与多种氨基化合物 （主要来自蛋白质分解产 物）反应，产生致癌的 N－亚硝基化合物，如亚硝胺等。亚硝胺是目前国际上 公认的一种强致癌物，动物试验结果表明：不仅长期小剂量作用有致癌作用， 而且一次摄入足够的量，也有致癌作用。因此，国际上对食品中添加硝酸盐和 亚硝酸盐的问题十分重视， 在没有理想的替代品之前， 把用量限制在最低水平。 4．关于亚硝酸盐替代品问题 许多世纪以来，人们一直使用亚硝酸盐来保存肉类。到 19 世纪末，才认 11识到亚硝酸盐可使腌肉产生颜色。 后来， 人们发现亚硝酸盐可抑制引起肉类变 质的微生物生长， 特别是对肉毒梭菌有很强的抑制作用。 有些国家在没有使用 亚硝酸盐之前，肉毒梭菌中毒率很高，使用后，肉毒梭菌中毒才得到了控制。 亚硝酸盐除抗菌作用外，还有抗氧化及增强风味的作用。尽管如此，由于亚硝 酸盐的安全性即致癌问题， 使其应用越来越受到限制， 全世界都在寻找理想的 替代品。 目前人们使用的亚硝酸盐替代品有两类：一类是替代亚硝酸盐的添加剂， Sweet(1991)报道， 这种替代物由发色剂、 抗氧化剂/多价螯合剂和抑菌剂组成， 发色剂用的是赤鲜红， 抗氧化剂/多价螯合剂为磷酸盐/多聚磷酸盐， 抑菌剂用 的是对羟基苯甲酸和山梨酸及其盐类； 另一类是在常规亚硝酸盐浓度下阻断亚 硝胺形成的添加剂，Mirrish 等报道，抗坏血酸能与亚硝酸盐作用以减少亚硝 胺的形成。此外，山梨酸、山梨酸醇、鞣酸、没食子酸等也可抑制亚硝胺的形 成。 实验十一：火腿肠中亚硝酸钠含量的测定―盐酸萘乙二胺比色法 一、原理 样品以处理，沉淀蛋白质，去除脂肪后，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸在弱酸 性条件下发生重氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合，形成紫红色的染料，在 538nm 处有最大吸收，其颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比。 二、仪器名称 1、分析天平 3、50mL 烧杯 5、电炉 7、10mL 移液管 9、玻璃棒 11、漏斗 13 滤纸 15、50mL 容量瓶 数量 1 架/2 组 1 个/组 1 个/2 组 2 支/组 1 个/组 1 个/组 2 张/组 1 个/组 名称 2、粉碎机（组织捣碎机） 4、500 mL 烧杯 6、水浴锅 8、500mL 容量瓶 10、5mL 移液管 12、带有铁圈的铁加台 14、20mL 移液管 16、1mL、2mL 移液管 数量1 台/班1 个/组 1 台/4 组 1 个/组 2 支/组 1 个/组 1 支/组 1 支/组另：作标准曲线组： 1、50mL 容量瓶（9 个/组） 2、1mL、2mL、5mL 吸量管（各 1 支/组） 3、2mL、1mL 移液管（1 支/组） 三、试剂 1、亚铁氰化钾溶液：称取 11g 亚铁氰化钾溶于 100mL 水中。 2、乙酸锌溶液：称取 22g 乙酸锌溶于少量水中，加冰醋酸 3mL，稀释到 12100mL。 3、饱和硼酸溶液：称取 50g 硼砂(Na2B4O7?10H2O)溶于 500mL 水中，冷却 后使用。 4、4%的对氨基苯磺酸溶液：称取对氨基苯磺酸 0.4g，溶于 100mL20%的盐 酸溶液中，避光保存。 5、0.2%盐酸萘乙二胺溶液：称取 0.2g 盐酸萘乙二胺，溶于 100mL 水中， 避光保存。 6、亚硝酸钠标准贮备液[ρ (NaNO2)=0.2mg/mL]：精密称取在干燥器中干 燥 24h 的分析纯亚硝酸钠 0.1000g，用水溶解后移入 500 mL 容量瓶中，加水 至刻度，摇匀。 7、亚硝酸钠标准使用液[ρ (NaNO2)=0.2mg/mL]：临用时准确吸取标准贮 备液 5mL 于 200 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 四、操作方法 （一）样品处理 1、粉碎：将牛肉、火腿肠置粉碎机内打碎均匀。 2、称量：用分析天平称取样品 5.0g 于 50 mL 烧杯中。 3、加热蒸馏水、开启水浴锅：与此同时，打开水浴锅加热。在 500 mL 烧杯内加入约 400 mL 蒸馏水，在电炉上加热到 70℃左右。 4、转移：在盛有 5.0g 样品的 50mL 小烧杯中加入 12.5mL 饱和硼砂溶液， 再用 300mL70℃左右的水分次将样品全部洗入 500mL 容量瓶中，在沸水浴中加 热 15 分钟（将容量瓶盖打开） 5、冷却：从水浴锅中取出 500mL 容量瓶，一边转动一边加入 5mL 亚铁氰 化钾溶液，摇匀，再加入 5mL 乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，定容，摇匀、静置 0.5h。 6、过滤：除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液 30mL，滤液备 用。 （二）标准曲线绘制 取 9 只 50mL 容量瓶并进行编号，吸取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、 1.00、1.50、2.00、2.50mL 亚硝酸标准使用液，分别置 50mL 容量瓶中，加入 2.00mL0.4%的对氨基苯磺酸溶液,混匀,静置 3～5 分钟后，各加入 1.00mL0.2% 盐酸萘乙二胺溶液，加水到刻度，混匀，静置 15 分钟，用 2cm 比色杯，以零 管调节零点，538nm 波长测定吸光度，绘制标准曲线。 （三）试样测定 吸取 40mL 样品处理液于 50mL 比色管中，按标准曲线绘制同样操作，在 13538nm 处测吸光度，从标准曲线上查出样品液含的亚硝酸盐含量。 五、计算 在坐标纸上以分光光度值为纵坐标，以相当于 NaNO2 的质量为横坐标， 绘制标准曲线。A 吸光光度值C 相当于 NaNO2 的质量（ug）六、说明 1、本法测得的是样品中的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量，不包括硝 酸盐含量。 2、亚硝酸盐容易氧化为硝酸盐，样品处理时，加热的时间与温度均要控 制。配制标准溶液的固体亚硝酸钠可长期保存在硅胶干燥器中，若有必要，可 在 80℃烘去水分后称量。 3、原始数据记录：编 号 0 加入亚硝酸标准使用液 0.00 （5 ug / mL）体积（mL） 相当于 NaNO2 的质量 0.00 分光光度值 1 0.20 1.00 2 0.40 2.00 3 0.60 3.00 4 0.80 4.00 5 1.00 5.00 6 1.50 7.50 7 2.00 10.00 8 2.50 12.50 样品课时总结:吸收光谱分析法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类分析方法，也是食 品分析常用的方法,其理论依据是光的吸收定律。包括可见光吸收光谱法、紫外吸收光谱 法、红外吸收光谱法、原子吸收分光光度法等。 (一)光的吸收定律 当一束平行的单色光在通过一个有色溶液后， 透射光的强度比原入射光的强度减弱 了，这种现象称为有色溶液对光的吸收作用。溶液的浓度越大，光透过的液层厚度愈大， 则光被吸收愈多，透射光强度的减弱也愈显著。 单色光在通过有色溶液时，透射光的强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的 厚度及溶液本身对光的吸收性能有关。这种关系或用正式表示，即称朗伯―比耳定律：14A=logI0 It=KCL式中 I0―入射光强度；It―透射光强度；A―吸光度；C―有色溶液浓度；L―有色溶 液厚度；K―溶液的吸光系数； 从朗伯―比耳定律可见，对一定强度的入射光，当 K 和 L 不变时，吸光度与溶液的 浓度成正比，这就是我们通过测定吸光度来确定溶液浓度的依据。 （二）分光光度法 利用分光光度计测量有色溶液的吸光度， 求得被测物质含量的方法称为分光光度法。 1．基本原理 将一束白光经过单色光器后得到单色光，让此单色光通过有色溶液后再投射至光电 池上，由光电效应的产生的光电流的强度与透射光强度成正比，经检流计直接指示出相 应的吸光光度。 单色光器用棱镜或光栅作为分光器，白光经分光后，再经出光狭缝而分出波长范围 很窄的一条单色光。单色光进入装着被测溶液的比色皿，从比色皿出来的透射光照射到 光电管的阴极面上，产生光电流。光电流在一个高电阻上产生电压降，此电压降经直流 放大器放大后，用精密电位计测量，直接指示出溶液的吸光光度或透光率。 2、测定浓度的方法 利用分光光度计测定有色溶液的吸光度，然后用标准曲线法进行定量，是吸光光度 法中最常用的一种定量方法。 先用纯试剂配制一定浓度的标准液，然后按一定程序配成一套浓度逐一递增、浓度 逐渐加深的标准色列，利用分光光度计，在一定波长下分别测出标准色列的吸光光度。 将测得的吸光光度与相应的浓度在坐标纸上做图，以吸光光度为纵坐标，标准溶液浓度 为横坐标，得到一条通过原点的直线，即标准曲线或称工作曲线。 在同样的条件下配制样品溶液，测定样品溶液的吸光光度，根据样品溶液在吸光光 度值在标准曲线上读出其相应的浓度值。 利用标准曲线法定量，标准色列起码要有 5 份以下，做出来的点至少有 3 个在直线 上，否则直线不好确定。作业或思考题：1、实验报告：格式、写法等。 2、要熟悉食品检验中级操作的规范。 3、计算题 Ⅰ.用盐酸奈乙二胺比色法测定火腿肠中的亚硝酸盐含量。 称取均匀样品 5.0000g，?置于 50mL 烧杯中，加入硼砂饱和液后，转移至 500mL 容量 瓶中，经过一系列处理后，定容，静置，过滤。吸取中间滤液 40mL 和 0.00mL，0.20mL， 0.40mL， 0.60mL， 0.80mL， 1.00mL， 1.50mL， 2.00mL， 2.50mL 亚硝酸钠标准使用液 （5ug/mL） ，15分别置于 50mL 比色管中，各加入 2.0mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置后，?各加入 1.0mL0.2%盐酸奈乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置后，用 2cm 比色杯，以零管调节 零点，于分光光度计 538nm 波长测定吸光度，结果如下： 项目 0.00 分光 度值 0.000 亚硝酸钠标准使用液（5ug/mL）用量（mL） 0.20 0.016 0.40 0.032 0.60 0.048 0.80 0.064 1.00 0.080 1.50 0.120 2.00 0.160 2.50 0.200 样品 0.120计算该样品中亚硝酸盐的含量（以 NaNO2 计，mg/kg） 。 Ⅱ.用直接滴定法测定高温蒸煮肠中的淀粉含量。 （1）葡萄糖标准溶液配制：准确称取 1.000g 经过 96±2℃干燥 2h 的纯葡萄糖，加 水溶解后加入 5mL 盐酸，并以水稀释至 1000mL。 （2）样品处理与水解：称取 5.2000g 匀浆。除去样品中脂肪、可溶性糖类物质后， 残渣转移至 250mL 锥形瓶（磨口与冷凝管连接）中，置沸水浴中回流酸解 2h，除铅后，全部溶液及残渣转入 500mL 容量瓶中，定容过滤，弃去初滤液，滤液供测定用。 （3） 标定碱性酒石酸酮溶液： 吸取 5.0mL 碱性酒石酸铜甲液及 5.0mL 乙液， 置于 150mL 锥形瓶中，加水 10mL，加入玻璃珠 2 粒，从滴定管滴加约 9mL 葡萄糖标准溶液，控制在 2min 内加热至沸，趁沸以每两秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖或其他还原糖标准溶液，直 至溶液蓝色刚好褪去为终点。 三次滴定消耗葡萄糖标准溶液 （每毫升相当于葡萄糖 1mg） 分别为 10.25mL； 10.24mL； 10.26mL。 （4）样品溶液预测：滴定管初读数为 0.26mL，终读数为 10.28mL； （5）样品溶液测定：三次滴加样品溶液的体积为：1.04mL；1.05mL；1.06 mL。 问题 1：试填写原始数据记录表 表 1：高温蒸煮肠淀粉含量测定原始数据记录表1 标定碱性酒石酸酮溶液消耗葡萄糖标准溶液的体积 （mL） 葡萄糖标准溶液的浓度（mg/ mL） 10mL 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg； 预测时消耗样品溶液的体积，mL 样品测定时消耗样品溶液的体积，mL 称取样品的质量，g 2 3 平均值问题 2：计算该样品中淀粉的含量（%） 。16}