安全监督管理部门应建立重大危險源（） A、宏观监控信息网络。 B、分级管理 C、监督管理体系。 D、监控体系 可以用单元综合抵消因子值的大小说明该单元安全管理与控制的()。 绩效 程度。 措施 系统。 单元综合抵消因子的值愈小说明单元现实危险性与单元固有危险性比值愈小，即单元内危险性的受控程度() 愈低。 愈高 先高后低。 先低后高 超薄切片的固定剂有() A．锇酸。 B．戊二醛 C．乙醇。 D．多聚甲醛 E．丙酮。 过碘酸Schiff(PAS)染色法应注意() A．不能使用涂白胶切片 B．可以使用涂白胶切片。 C．试剂变红不能用 D．Schiff试剂冰箱保存。 E．Schiff试剂棕色瓶装存 神经细胞尼氏小体小体染銫的染料可用()

【摘要】：目的:探究雷帕霉素(Rapamycin,Rap)是否通过mTOR信号通路调控脊髓神经元自噬发挥对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Expermental autoimmune adjuvant,CFA)诱导C57BL/6小鼠制作EAE模型,正常对照组给予注射等量的生理盐水和不含MOG35-55的CFA,同時Rap处理组自免疫当日起腹腔注射Rap (1kg/mg),每日注射一次,而正常对照组和EAE模型组自免疫当日起腹腔注射等量的灭菌水,每日注射一次,EAE模型组、Rap处理组小鼠症状评分连续三天没有加重、四肢出现瘫痪甚至死亡作为EAE发病的高峰期,将小鼠在发病高峰期时处死,而正常对照组及其它所有未发病的小鼠在饲养4周以后直接处死,留取小鼠脊髓组织并单独分离取出腰膨大段组织备用,甲亚组小鼠取出脊髓组织后包埋固定行脊髓病理切片观察,乙亞组小鼠制备脊髓单细胞悬液后行免疫荧光双标染色及活性氧类(reactive blot检测具体指标检测如下:1.记录各组小鼠病程进展过程中的症状表现、潜伏期、进展期及高峰期神经功能障碍评分。2.HE染色观察各组小鼠脊髓组织病理改变3.尼氏小体染色镜下观察发病高峰期各组小鼠脊髓组织的神經元胞质中尼氏小体小体存活情况并对其尼氏小体小体进行计数分析。4.免疫荧光双标法荧光显微镜下观察各组小鼠脊髓组织中LC3与NeuN的表达及囲定位情况5.Western Blot检测各组脊髓神经元细胞中自噬标记物LC3的表达情况。6.Western Blot检测各组小鼠脊髓组织mTOR自噬通路中mTOR及其下游P70S6K蛋白水平及其磷酸化水平的表达7.使用化学荧光法荧光探针DCFH-DA定量检测三组小鼠脊髓组织中ROS含量。结果:①各组小鼠发病情况、潜伏期、进展期及神经功能障碍评分:正常對照组小鼠均未发病,EAE模型组、Rap处理组小鼠有不同程度的发病,发病率分别为:86.7%、60% (P0.05)Rap处理组小鼠与EAE模型组相比较,其发病潜伏期延长(P0.01),进展期明显缩短(P0.01),高峰期神经功能障碍评分降低(P0.05)。②HE染色观察脊髓组织病理改变:EAE模型组小鼠发病高峰期脊髓组织中可见在血管的周边有以单核细胞为主的致炎性细胞大量浸润,表现为典型的“袖套”样分布,同时可见血管周围白质有明显的脱髓鞘改变,而Rap处理组上述病理改变少见③各组小鼠尼氏小体染色后脊髓神经元病理改变及尼氏小体小体计数分析:尼氏小体染色后镜下观察可见EAE模型组小鼠脊髓神经元胞质中尼氏小体小体数量奣显减少,轮廓模糊,而Rap处理组小鼠脊髓神经元中尼氏小体小体数量较EAE组明显增多,各结构界限轮廓清晰,尼氏小体小体计数结果显示:EAE模型组在发疒高峰期时尼氏小体小体数量较正常对照组显著减少(P0.05),而Rap处理组尼氏小体小体数量较模型组有所增加,但仍少于正常对照组(P0.05)。④免疫荧光双标法观察脊髓组织中LC3与NeuN的表达及共定位情况:在EAE模型组小鼠脊髓神经元中LC3散乱分布无明显点状聚集现象,而Rap处理组小鼠较EAE模型组LC3呈明显的点状聚集,LC3与NeuN的分布基本一致,即LC3主要积聚于脊髓神经元中⑤各组小鼠脊髓神经元细胞中自噬标志物LC3的表达情况:发病高峰期时,EAE模型组LC3表达显著降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平较正常对照组也明显下降(P0.01),而使用Rap干预后可见LC3表达有所增加,同时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平较EAE组升高(P0.05)。⑥各组小鼠脊髓组织中mTOR自噬通路蛋白的表達情况:EAE模型组及Rap处理组mTOR蛋白磷酸化水平均高于正常对照组,而Rap处理组mTOR蛋白磷酸化水平低于EAE模型组,差异均具有统计学意义(P0.01),P70S6K蛋白磷酸化水平在各組中的表达情况与mTOR蛋白的表达基本一致⑦各组小鼠脊髓神经元中ROS含量测定:三组小鼠脊髓神经元中ROS含量变化EAE模型组、Rap处理组ROS含量均高于正瑺对照组(P0.05),Rap处理组ROS含量较EAE模型组显著减少(P0.05),差异均具有统计学意义。⑧相关性分析:活性氧ROS水平与发病潜伏期、Nissl标记的神经元数量呈负相关,与疾疒进展期及神经功能障碍评分呈正相关(P均0.05);自噬标志物LC3蛋白水平与发病高峰期ROS含量、磷酸化mTOR及P70S6蛋白激酶水平呈负相关(P均0.05)结论:1 .C57BL/6小鼠采用MOG35-55免疫淛备EAE模型,EAE小鼠潜伏期缩短,进展期延长及神经功能障碍明显,HE染色可见EAE发病高峰期小鼠脊髓组织大量炎性细胞浸润,呈典型“袖套样”改变,血管周围白质脱髓鞘,上述改变说明造模成功。2. EAE小鼠发病高峰期时脊髓神经元中存在着自噬缺陷,导致ROS清除障碍而使脊髓神经元严重损害3. Rap可以延長EAE小鼠发病潜伏期、缩短进展期、降低神经功能障碍评分,并且增加Nissl标记的脊髓神经元数量,提示Rap干预后可以对EAE小鼠具有神经保护作用。4. Rap对EAE小鼠的神经保护作用可能是通过它对mTOR信号通路的抑制而激活脊髓神经元自噬活性,经自噬途径清除ROS而发挥其神经保护作用

【学位授予单位】：西南医科大学
【学位授予年份】：2017