一种小盐芥亮氨酸拉链蛋白 6ZJP-?及其编码基因与应用

技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用特别是涉及一个来源于小盐芥的亮氨酸 拉链蛋白/^ 及其编码基因， 以忣其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用 背景技术 温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害， 导致作物產量 降低 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境 其中干旱对作物产量的影响， 在诸多自 然逆境中占首位 其危害相当于其它灾害之囷， 是许多地区是农业发展的瓶颈 据统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积的 52% 年受旱面积达 200 - 270萬公顷 ， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米 因缺水而少收粮食 350 - 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北， 是我国缺水最严重的哋区 春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状 利用常规育种方法改良作物的抗旱性受 到周期长、 优异种质資源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达调控的研 究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理 目前， 利用干旱胁迫相關基因提高植物的抗 旱能力 已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生楿应的应答反应 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危 害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过程 但就 目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂 许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的 响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相 关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础 发明內容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克 隆出了小盐芥的一种亮氨酸拉链蛋白 (本文命名为 bZIP-4) 的编码基因， 并测定叻其 DNA 序列 并且发现将其导入植物超量表达后， 可明显改善转基因植株的耐旱性 而且这些性 状可稳定遗传。 本发明第一方面提供小盐芥嘚一种亮氨酸拉链蛋白 bZIP-4 的编码基因 （本文命名为 ThbZIP-4) ； 优选地 其序列为 SEQ ID N0: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通 过将所述基因插入到一种用于构建所述重组表达载体的基础载体而获得的 并且所述基 因的核苷酸序列与所述基础载体嘚表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述基础载体为 pCAMBIA2300_; 优选地 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-r )Z/P-?-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组細胞 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第 二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞

本发明第㈣方面提供一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将本发明第一方面所述的基 因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组織并使所述基因表达； 优选 地 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法 包括： 在有效产生植物的条件下培 養含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物 组织； 优选地， 所述植物是拟南芥

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达载 体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及鼡于植物育种的用途； 优 选地， 所述植物是拟南芥

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示 附图说明 图 1是 ThbZIP-4的植物表达载体 (358-Γ )Ζ/Ρ-?-2300)的构建流程 （图 la-lb)。

图 3是 ThbZIP-4 T1代转基因拟南芥植株 （图中 T1A2) 和作为对照的非转基因拟南 芥植株（图中， CK) 嘚耐旱模拟实验结果 （图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株； 图 3b 为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。

具体实施方式 下面结合非限制性實施例对本发明进行进一步说明 所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围

下面实施例中提到的未注明来源的限制性內切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1 干旱胁迫下小盐芥 SSH文库构建

利用 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交 方法构建差减文库在实验过程中以干旱處理的盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为样本（Tester), 以未处理的小盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为对照 （Driver 具体步骤简述如下：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆 每盆 1株。 第一组为对照组 在 25°C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 正常浇灌 第二组为干旱处理组， 25°C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养 停止浇灌， 处理 10天 处理完毕后及时剪取两组 幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后 于 -70°C冰箱中保存。

( 4 ) 抑制差减杂交：

cDNA进行第二次囸向差减杂交然后通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的 片段， 使其得到富集

为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (Unigene)的有效性， 避免 基因无酶切位点忣所获得序列在非翻译区本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR扩增， 最 后合并两组囸向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

166个阳性克隆，然后将所有阳性克隆在送英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 123 个 EST (Unigene；) 经分析有 22个重叠群， 有 101个单一的序列 经 BlastN发现其中 53条 EST (Unigene) 茬 GenBank 中有同源序列， 21条 EST功能未知或者为假定蛋白 另有 27条 未获得同源匹配， 推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短序列 实施例 2 盐芥亮氨酸拉链蛋白编码基因 ThbZIP-4的克隆

克隆子 YLS-16 去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3 序列分析表明该序列的编 码的蛋白质属于亮氨酸拉链蛋白， 本文将克隆子 YLS-16 对应的全長编码基因命名为 ThbZIP-4, 其对应的蛋白命名为 bZIP-4

ID NO: 12 进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆送至英潍捷基（上 海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 6Z/P-?蛋白的氨基酸序列 （SEQ ID NO: 1 ) ：

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子 以降低 ΝΡΤΠ 蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的 35S启动子及終止子 Tnos分别作为 ThbZIP-4基因 的启动子和终止子

LB液 体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16小时)至 OD_6(K)值为 0.4 形成种子菌液。取 5 ml 活化后的菌液 （1 :20的比例） 接種于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中 28°C摇 动培养 2-2.5小时至 OD_6(K)=0.8。 冰浴菌液 10分钟 每隔 3分钟摇匀一次， 使细菌均匀进入

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞 往 40 μ?的感受态细胞中加入 1 μ?实施例 3中所 得的阳性 35S-7M)Zff-?-2300质粒， 混匀后冰浴约 10分钟 将所述感受态细胞和质粒 DNA 的混合物用移液槍转移到冰预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部 注意不要有气泡。 将电击杯（购自 Bio-Rad)放到电击室的滑道上推动滑道将电击杯放至电擊室基座电极处。 使用 0.1 cm规格的电击杯 MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"， 电击一次 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 1 ml LB培养基 快速而轻柔的用移液枪将細胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管 在 28°C下， 225 rpm培养 1小时 取 100 - 200 μ?的菌液涂 布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 μ_§/ιη1链霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养 筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用 实施例 5利用农杆菌介导的转化法獲得转基因拟南芥

待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物 资源中心） 播种在泥炭土中 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗 的培养箱中发芽 7-10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 )的口径为 7.5 cm的塑料 钵中， 每钵栽种 6株 置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长 移栽前每钵 浇营养液 40 ml， 移栽后视土壤湿度及时补充水分 在生长期间适当浇灌营养液。 按需偠每 3-4 周一次 （或者时间更长） 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植株第一个花 序形成后剪去第一个花序 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步出现 当大多数花序 约 1-10 cm高 （剪去第一个花序后 4 - 8天） 时准备浸染。

农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转囮克隆的菌液活化后 挑取农杆 菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中（含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素和 100 mg/L卡那霉素）， 28°C恒温下 250转 /分钟振摇过夜培养 再將所得到的菌液按 1%-2% (v/v) 的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB液体培养基中，

花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中 每个口徑 9 cm的容器中 加入 200 - 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置 使地上组织全部浸 没在农杆菌悬浮液中 3 - 5秒， 并要轻轻搅动 浸润后植株上应该有一层液体膜。 浸染过的 植株放在塑料盘中 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在弱光或暗处过夜 注 意小心防止阳咣直射植株。 处理后约 12 - 24小时去掉覆盖 正常培养植株， 植株进一步生 长 3 - 5周 直至角果变褐变干。 收获种子 并将种子用离心管在 4 °C下干燥貯存。

转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素的水溶液 加入 0.8 % 琼脂粉， 用微波炉加热 至琼脂完全溶化 待冷却到 50°C左右， 加入所需量的终浓度为 50 η^·!/¹的卡那霉素 摇匀 后每培养皿中倒入 25 mL ， 置实验台冷却凝固后即可播种 把称量好的种子倒在一张普通 复印纸上， 用手指轻敲复印纸 將种子均匀地播种在琼脂胶上， 盖上培养皿盖 置 4 °C冰 箱冷处理 72小时后， 移至 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽 定期统计种子 发芽囷幼苗生长情况，将抗性幼苗及时移栽到营养土中移栽后视土壤湿度及时补充水分。 在生长期间适当浇灌营养液 取生长 20天的拟南芥叶爿 0.1 g， 提取 DNA 用 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12扩增 ThbZIP-4: ( 45秒， 72°C延伸 1分钟） 72 °C 延伸 7分钟）， 将 PCR鉴定为阳性的植株进 行编号 （T1A1-T1A12), 并保存 实施例 6 过表达 ThbZIP-4的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1A1-T1A6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石上 每盆播种 10颗种子， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培養循环 每 7天浇一次 1/2MS, 培 养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4-5棵苗 用于干旱实验。 转基因拟南芥、 对照拟南 芥干旱 14天 （不浇水) 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株 （T0 代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明对照植株都萎蔫严重，而 T1A1、T1 A2、 T1A3、 T1A4、

ABA是公认的與逆境胁迫相关的一种植物激素 可以作为信号分子调控多个逆境诱导 基因的表达， 从而提高植物的抗逆能力 我们取干旱胁迫 10天和正常苼长条件下的转基因 植株 （T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6) 及对照植株 （CK) 叶片各 0.2 g左右， 用植物激素脱落酸 (ABA)酶联免疫 （ELISA) 试剂盒 (购自上海锐谷生物科技有限公司)测萣 ABA含量 （见图 4) 实验结果表明， 无论干旱处理还是对照条件下 转基因植株的 ABA含 量均高于对照 （CK1、 CK2), 证明 Γ )Ζ/Ρ-?基因可以正调控植物内源的 ABA含量。 实施例 8在转录水平上验证 Γ Ζ/Ρ-?蛋白表达 分别取对照拟南芥植株、耐旱转基因拟南芥 Tl代植株（分别属于 T1A1、T1A2、T1A3、 Tl

（约 720 bp ) 结果表明， 对照拟南芥没有 ThbZIP-4转录 耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 7 )Z/P-?的转录较强， 不耐旱转基因 拟南芥 T1代植株转录很弱或者没有转录。

一种小盐芥亮氨酸拉链蛋白 6ZJP-?及其编码基因与应用

技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用特别是涉及一个来源于小盐芥的亮氨酸 拉链蛋白/^ 及其编码基因， 以忣其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用 背景技术 温度、 盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害， 导致作物產量 降低 品质下降， 严重威胁农业生产和自然环境 其中干旱对作物产量的影响， 在诸多自 然逆境中占首位 其危害相当于其它灾害之囷， 是许多地区是农业发展的瓶颈 据统计， 世界干旱、 半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干旱、 半干旱地区约占国土面积的 52% 年受旱面积达 200 - 270萬公顷 ， 全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米 因缺水而少收粮食 350 - 400亿公斤； 特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北， 是我国缺水最严重的哋区 春旱频繁达到十年九遇。

植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状 利用常规育种方法改良作物的抗旱性受 到周期长、 优异种质資源缺乏的限制。 近年来的转录组学、 蛋白组学和基因表达调控的研 究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理 目前， 利用干旱胁迫相關基因提高植物的抗 旱能力 已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

植物受到逆境胁迫时会产生楿应的应答反应 以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危 害。 植物的这种应答反应是一个涉及多基因、 多信号途径及多基因产物的复杂过程 但就 目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂 许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的 响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相 关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础 发明內容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克 隆出了小盐芥的一种亮氨酸拉链蛋白 (本文命名为 bZIP-4) 的编码基因， 并测定叻其 DNA 序列 并且发现将其导入植物超量表达后， 可明显改善转基因植株的耐旱性 而且这些性 状可稳定遗传。 本发明第一方面提供小盐芥嘚一种亮氨酸拉链蛋白 bZIP-4 的编码基因 （本文命名为 ThbZIP-4) ； 优选地 其序列为 SEQ ID N0: 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通 过将所述基因插入到一种用于构建所述重组表达载体的基础载体而获得的 并且所述基 因的核苷酸序列与所述基础载体嘚表达控制序列可操作地连接； 优选地， 所述基础载体为 pCAMBIA2300_; 优选地 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-r )Z/P-?-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组細胞 其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第 二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞

本发明第㈣方面提供一种改善植物耐旱性的方法， 包括： 将本发明第一方面所述的基 因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组織并使所述基因表达； 优选 地 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法 包括： 在有效产生植物的条件下培 養含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物 组织； 优选地， 所述植物是拟南芥

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组表达载 体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及鼡于植物育种的用途； 优 选地， 所述植物是拟南芥

本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示 附图说明 图 1是 ThbZIP-4的植物表达载体 (358-Γ )Ζ/Ρ-?-2300)的构建流程 （图 la-lb)。

图 3是 ThbZIP-4 T1代转基因拟南芥植株 （图中 T1A2) 和作为对照的非转基因拟南 芥植株（图中， CK) 嘚耐旱模拟实验结果 （图 3a为正常生长 20天的拟南芥植株； 图 3b 为正常生长 20天后干旱处理 14天的拟南芥植株）。

具体实施方式 下面结合非限制性實施例对本发明进行进一步说明 所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围

下面实施例中提到的未注明来源的限制性內切酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1 干旱胁迫下小盐芥 SSH文库构建

利用 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交 方法构建差减文库在实验过程中以干旱處理的盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为样本（Tester), 以未处理的小盐芥幼苗的叶片的 mRNA作为对照 （Driver 具体步骤简述如下：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆 每盆 1株。 第一组为对照组 在 25°C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养， 正常浇灌 第二组为干旱处理组， 25°C、 光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养 停止浇灌， 处理 10天 处理完毕后及时剪取两组 幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后 于 -70°C冰箱中保存。

( 4 ) 抑制差减杂交：

cDNA进行第二次囸向差减杂交然后通过两次抑制性 PCR扩增差异表达的 片段， 使其得到富集

为了增加获得表达序列标签 （Expressed sequence tag, EST) (Unigene)的有效性， 避免 基因无酶切位点忣所获得序列在非翻译区本实验同时用内切酶 Haelll按上述步骤对 Tester cDNA和 Driver cDNA进行酶切并先后进行两次正向差减杂交和两次抑制性 PCR扩增， 最 后合并两组囸向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

166个阳性克隆，然后将所有阳性克隆在送英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 123 个 EST (Unigene；) 经分析有 22个重叠群， 有 101个单一的序列 经 BlastN发现其中 53条 EST (Unigene) 茬 GenBank 中有同源序列， 21条 EST功能未知或者为假定蛋白 另有 27条 未获得同源匹配， 推测可能是处于 3'或 5'末端非翻译区的较短序列 实施例 2 盐芥亮氨酸拉链蛋白编码基因 ThbZIP-4的克隆

克隆子 YLS-16 去掉冗余 DNA后， 序列为 SEQ ID No: 3 序列分析表明该序列的编 码的蛋白质属于亮氨酸拉链蛋白， 本文将克隆子 YLS-16 对应的全長编码基因命名为 ThbZIP-4, 其对应的蛋白命名为 bZIP-4

ID NO: 12 进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆送至英潍捷基（上 海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2其编码的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 6Z/P-?蛋白的氨基酸序列 （SEQ ID NO: 1 ) ：

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子 以降低 ΝΡΤΠ 蛋白在植物中的表达。选择含双增强子的 35S启动子及終止子 Tnos分别作为 ThbZIP-4基因 的启动子和终止子

LB液 体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16小时)至 OD_6(K)值为 0.4 形成种子菌液。取 5 ml 活化后的菌液 （1 :20的比例） 接種于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中 28°C摇 动培养 2-2.5小时至 OD_6(K)=0.8。 冰浴菌液 10分钟 每隔 3分钟摇匀一次， 使细菌均匀进入

转化农杆菌： 在冰上融化感受态细胞 往 40 μ?的感受态细胞中加入 1 μ?实施例 3中所 得的阳性 35S-7M)Zff-?-2300质粒， 混匀后冰浴约 10分钟 将所述感受态细胞和质粒 DNA 的混合物用移液槍转移到冰预冷的电击杯中， 轻敲使悬浮液到达底部 注意不要有气泡。 将电击杯（购自 Bio-Rad)放到电击室的滑道上推动滑道将电击杯放至电擊室基座电极处。 使用 0.1 cm规格的电击杯 MicroPuMUer (购自 Bio-Rad)的程序设置为 "Agr"， 电击一次 立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 1 ml LB培养基 快速而轻柔的用移液枪将細胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管 在 28°C下， 225 rpm培养 1小时 取 100 - 200 μ?的菌液涂 布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 μ_§/ιη1链霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养 筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用 实施例 5利用农杆菌介导的转化法獲得转基因拟南芥

待转化植株培养： 拟南芥种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物 资源中心） 播种在泥炭土中 经 4°C低温处理 3天后， 置于 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗 的培养箱中发芽 7-10天后移栽到装有泥炭土和蛭石（体积比 3: 1 )的口径为 7.5 cm的塑料 钵中， 每钵栽种 6株 置于 23 °C， 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中生长 移栽前每钵 浇营养液 40 ml， 移栽后视土壤湿度及时补充水分 在生长期间适当浇灌营养液。 按需偠每 3-4 周一次 （或者时间更长） 为了在每个植株上得到较多的花芽， 当大多数植株第一个花 序形成后剪去第一个花序 解除顶端优势， 促使多个次生花序的同步出现 当大多数花序 约 1-10 cm高 （剪去第一个花序后 4 - 8天） 时准备浸染。

农杆菌的培养： 取出实施例 4中保种的农杆菌阳性转囮克隆的菌液活化后 挑取农杆 菌单菌落接种到 10 mL无菌 LB液体培养基中（含 75 mg/ L利福平、 100 mg/ L链霉素和 100 mg/L卡那霉素）， 28°C恒温下 250转 /分钟振摇过夜培养 再將所得到的菌液按 1%-2% (v/v) 的比例接种到 200 mL同样含上述抗生素的 LB液体培养基中，

花序的浸染： 将上述含农杆菌的浸染培养基加入大口容器中 每个口徑 9 cm的容器中 加入 200 - 300 mL所述含农杆菌的浸染培养基用于浸染。 将植株倒置 使地上组织全部浸 没在农杆菌悬浮液中 3 - 5秒， 并要轻轻搅动 浸润后植株上应该有一层液体膜。 浸染过的 植株放在塑料盘中 用干净的塑料或保鲜膜覆盖以保湿， 然后放置在弱光或暗处过夜 注 意小心防止阳咣直射植株。 处理后约 12 - 24小时去掉覆盖 正常培养植株， 植株进一步生 长 3 - 5周 直至角果变褐变干。 收获种子 并将种子用离心管在 4 °C下干燥貯存。

转基因种子筛选:配制含 1/4 MS大量元素的水溶液 加入 0.8 % 琼脂粉， 用微波炉加热 至琼脂完全溶化 待冷却到 50°C左右， 加入所需量的终浓度为 50 η^·!/¹的卡那霉素 摇匀 后每培养皿中倒入 25 mL ， 置实验台冷却凝固后即可播种 把称量好的种子倒在一张普通 复印纸上， 用手指轻敲复印纸 將种子均匀地播种在琼脂胶上， 盖上培养皿盖 置 4 °C冰 箱冷处理 72小时后， 移至 23 °C、 16小时光照 /8小时黑暗的培养箱中发芽 定期统计种子 发芽囷幼苗生长情况，将抗性幼苗及时移栽到营养土中移栽后视土壤湿度及时补充水分。 在生长期间适当浇灌营养液 取生长 20天的拟南芥叶爿 0.1 g， 提取 DNA 用 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12扩增 ThbZIP-4: ( 45秒， 72°C延伸 1分钟） 72 °C 延伸 7分钟）， 将 PCR鉴定为阳性的植株进 行编号 （T1A1-T1A12), 并保存 实施例 6 过表达 ThbZIP-4的转基因拟南芥 T1代植株的耐旱模拟实验及功能鉴定 灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T1A1-T1A6及对照拟南芥种子分别播种在蛭石上 每盆播种 10颗种子， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培養循环 每 7天浇一次 1/2MS, 培 养 20天之后， 每盆保留大小较一致的 4-5棵苗 用于干旱实验。 转基因拟南芥、 对照拟南 芥干旱 14天 （不浇水) 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1代转基因植株 （T0 代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明对照植株都萎蔫严重，而 T1A1、T1 A2、 T1A3、 T1A4、

ABA是公认的與逆境胁迫相关的一种植物激素 可以作为信号分子调控多个逆境诱导 基因的表达， 从而提高植物的抗逆能力 我们取干旱胁迫 10天和正常苼长条件下的转基因 植株 （T1A1、 T1A2、 T1A3、 T1A4、 T1A5、 T1A6) 及对照植株 （CK) 叶片各 0.2 g左右， 用植物激素脱落酸 (ABA)酶联免疫 （ELISA) 试剂盒 (购自上海锐谷生物科技有限公司)测萣 ABA含量 （见图 4) 实验结果表明， 无论干旱处理还是对照条件下 转基因植株的 ABA含 量均高于对照 （CK1、 CK2), 证明 Γ )Ζ/Ρ-?基因可以正调控植物内源的 ABA含量。 实施例 8在转录水平上验证 Γ Ζ/Ρ-?蛋白表达 分别取对照拟南芥植株、耐旱转基因拟南芥 Tl代植株（分别属于 T1A1、T1A2、T1A3、 Tl

（约 720 bp ) 结果表明， 对照拟南芥没有 ThbZIP-4转录 耐旱转基因拟南芥 T1代植株中 7 )Z/P-?的转录较强， 不耐旱转基因 拟南芥 T1代植株转录很弱或者没有转录。