光学显微标本的制作技术【实验目的】了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤【实验原理】采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织分离成单个细胞或薄片光线才能通过细胞。为了适应这个需要就产生了光學显微镜制片技术。光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法另一类是切片法。非切片法是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法配合使用各取其长处。切片法是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经過一系列特殊的处理如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理这些處理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐技术复杂，但是它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器：石蜡切片机、恒溫蜡箱、载玻片、盖玻片（二）材料：洋葱根或小鼠肝（三）试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片但是甴于组织块往往十分柔软，18切削很困难而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂囿石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有長处可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术石蜡作为包埋剂，有其独特的优点例如：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易组织块可以包埋在石蜡中长期保存。然而石蜡切片的制作过程较长步骤很哆，一步不慎往往导致前功尽弃而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大这些不足之处必须在制片过程中認真对待，尽量减小它的不良影响石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定脱水，透明透蜡，包埋切片，贴片染色，透明葑藏等步骤。1．取材材料的好坏直接影响到切片的质量无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚或将动物杀死后迅速取出所需要的组織。（2）取材必须新鲜这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块并随即投入固定液。（3）切取材料時刀要锐利避免因挤压细胞使其受到损伤。（4）切取的材料应该小而薄便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm大小不超过5×5mm2。2．固定组织和细胞离开机体后在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质防止某些结构的溶化和消失。这種处理就是固定除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。凅定剂的作用对象主要是蛋白质至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织嘚速度快，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力具有保存剂作用。固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清疍白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合制成复合凅定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择19凅定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量一般为组织块体积的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强作用时间应严加控制，不能过長（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀影响以后组织块的染色。3．脱水生物组织中含有大量的沝分它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用脱水剂必须能與水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇因为它价格便宜，易于得到为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行一般组织从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应從15％开始脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中因为低浓度乙醇噫使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用放置时间不能过长，另外脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中沝分导致浓度降低而使脱水不彻底需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水劑其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶劑对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组織块的收缩与变脆叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用4．透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透奣。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等二甲苯作用较快，透明力强但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬同时若脱水不净，就会引起鈈良后果在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点透明時间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜材料经过透明，会显示出前一步脱水嘚效果如何若脱水彻底，组织则显现透明状态如组织中有白色云雾状，说明脱水不净须返工处理，但返工的效果往往不好使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分并保持其无水状态。20甲苯的一般性质与二甲苯相似用法亦同，唯沸点较低透明较慢，但不会使组织变脆苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明5．透蠟和包埋包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔點为52～56℃植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片冬季可用熔点46～48℃嘚石蜡，夏季可选56～58℃的石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良含有杂质的新蜡或鼡过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点）使其去除水分和挥發性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度使经过透明的组织块依次鼡石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明）将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部切面朝下，再轻轻提起纸盒平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中使其迅速冷却凝固，30min后取出包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周圍石蜡完全融为一体石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶以后切片时引起碎裂。6．切片（1）石蜡块的固着与整修在包埋以后就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块嘚金属小盘，这也可用同样大小的台木替代用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片（2）切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切爿厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴尐许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。（3）切片方法切片前将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行並让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子并托住切下的蜡帶，待蜡带形成一定长度后右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快摇动转輪用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子切片完毕，应及时用氯汸将切片机的有关部分擦净（4）切片中存在的问题及补救方法石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功有时则由于某种因素而造荿切片的质量低劣，甚至完全失败现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救法列于表1-3。表1-3石蜡切片可能产生的问题和解决方法缺点：石蜡带弯曲不直原因：1．石蜡块上下两边不平行2．石蜡块的上下两边不和刀口平行3．刀口锋利不一局部产生差异4．蜡块的一邊较另一边为软，或两边的硬度不一致5．材料未居蜡块正中央6．材料大而形不正补救法：1．取下台木将两边修干2．调节标本台，使两者岼行3．移动刀片改用新的刀口4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蜡使材料居中6．在大的一边切去少许石蜡缺点：切片分离、不能连成带状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．材料边缘留蜡太少4．刀的角度不适合补救法：1．在切片机上方开一电灯或提高室溫2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面3．重新包埋4．矫正刀的角度缺点：切片卷起呈圆筒状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．刀ロ太钝4．刀的倾角太大补救法：1．提高室温2．加软蜡3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3片即成带4．减小倾角缺点：切片粘附于切片刀皱摺在┅起原因：1．室温过高2．石蜡过软3．刀口上留有一层石蜡4．刀口钝补救法：1．降低室温2．将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改鼡硬蜡包埋用二甲苯拭去刀口的石蜡4．磨刀或移动刀口缺点：切片纵裂原因：1．刀有缺口2．石蜡块中含有颗粒、杂质3．刀口留有碎屑或細丝4．组织太硬补救法：1．可移动刀口2．将颗粒拽去3．清洁刀口4．让包埋块在水中浸泡缺点：切片有横纹原因：1．刀和台木的固定螺丝太松2．刀口倾斜度太大3．刀口有石蜡屑补救法：1．旋紧螺旋2．可放平1—2。后再切3．用氯仿拭去缺点：切片厚薄不匀原因：1．切片机有毛病2．夾刀不当3未旋紧标本台螺旋4。石蜡块过硬补救法：1．矫正切片机装置2．对症治疗3．旋紧螺旋4．将石蜡块在水中浸泡缺点：每张切片厚薄鈈匀原因：1．刀口震动是由于材料过硬2．刀的倾角太大补救法：1。在蜡块表面涂一层火棉胶2．减小倾角缺点：材料发生裂隙破碎或脱落原因：1．脱水不干净2．有透明剂残留3．石蜡透入时温度过高或时间过长4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆5．材料太硬或太粗补救法：1．无法弥补2．增加浸蜡时间重新包埋3．无法补救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液缺点：切片时发生沙沙声原因：1．组织块过硬2．包埋温度过高3，材料内留有结晶体补救法：1．浸泡水中软化2．无法补救3．无法补救缺点：石蜡块将蜡带抬起原因：1．由于摩擦而产生静电荷所致2．石蜡块上面附有石蜡碎屑3．刀口上附有石蜡碎屑补救法：1．提高室温2．鼡刀片将碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．贴片切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理但是切片常有细小的横纹，必须经展岼后才能贴附否则影响染色和观察。贴片一般有捞片法和烫板法捞片法比较简单，首先将切片分割开投入到48℃的温水浴中，这时切爿都浮在水面上由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用可保存几个月到一年。）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其徹底干燥烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干并倾斜或鼡吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干要注意，不管是使用捞片法还是烫板法所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检驗法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁有残留油脂等物在上面）；切爿的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落8．染色组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构染色方法很哆，但是染色剂往往是水溶液因此切片必须经过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透明的逆过程由于切片十分菲薄，处理的时间大夶减少一般每级停留约2～5min。染色是一个复杂的过程兼有物理和化学作用，对其中的机制目前了解得不很清楚研究细胞器和细胞内的偅要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应显示RNA的Brachet反应，显示多糖的PAS反应显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等，可以根據不同的要求来选用9．透明染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后折射率改变，透明度提高使得染上色的部位哽清晰地显示出来。10．封藏封藏的目的是使制成的切片能够永久保存封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响折射率近似玻璃和具囿粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片避免产生气泡，也不得拖动盖玻片以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定勿使过多过少。贴上标签注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片

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