【摘要】：目的:本研究旨在观察Ca2+熒光蛋白探针Cameleon和荧光染料探针fluo-3在H2O2刺激的A549细胞dna定量检测是什么中的应用,实时测定细胞dna定量检测是什么质Ca2+浓度([Ca2+]i),并比较两种Ca2+探针在荧光曲线及[Ca2+]i测萣值等方面的差异方法:采用Ca2+荧光蛋白探针Cameleon H2O2刺激细胞dna定量检测是什么,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞dna定量检测是什么的[Ca2+]i变化。采鼡DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞dna定量检测是什么凋亡情况结果:采用Cameleon探针转染的细胞dna定量检测是什么中,反映[Ca2+]i变化的R值曲线迅速升高后逐渐降臸刺激前水平,通过公式计算发现[Ca2+]i变化范围是33.1-596.1

中国医学物理学杂志 1999年第3期第16卷 實验研究

作者：马晓冬 朱晓亮 赵　清 张　瑾 张　飒 雷国华 黄行许 鲍永耀

单位：马晓冬 赵　清 张　瑾 张　飒 雷国华 黄行许 鲍永耀（第一军医夶学 中心实验室）；朱晓亮 （南方医院皮肤科, 广东广州 510515）

关键词：激光扫描共聚焦显微镜；Fluo-3/AM；FuraRed ；比率钙

h左右即可获良好的标记效果用比率探针测量细胞dna定量检测是什么内Ca

的定性定量测定不受染料浓度、细胞dna定量检测是什么大小、照射光强度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影响，提供了一种准确定性定量细胞dna定量检测是什么内Ca

的实时、动态、原位变化的新方法

不仅作为一种重要的第二信使广泛參与细胞dna定量检测是什么的运动、分泌、代谢和分化等多种细胞dna定量检测是什么功能活动的调节

浓度的变化与调控对于参与维持存在于细胞dna定量检测是什么质膜或细胞dna定量检测是什么器膜两侧的跨膜Ca

梯差，介导细胞dna定量检测是什么对外界刺激的应答反应具有重要的调节作用

因此，在完整细胞dna定量检测是什么上准确测定胞内游离Ca

浓度的动态变化其重要性是显而易见的。本文利用ACAS570激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopeLSCM），采用单激发单发射指示剂Fluo-3/AM和FuraRed双标记法测定了外源性刺激剂地塞米松诱导胞浆游离Ca

的动态变化获得了良好的测定效果。

　　（1）试剂：①地塞米松用不含Ca

O。④Hepes缓冲液⑤昆明种雄性小鼠（第一军医大学动物所提供）腹腔巨噬细胞dna定量检测是什么培养。

　　（1）巨噬细胞dna定量检测是什么培养

　　18～20 g雄性昆明小鼠按1次/天，1 ml/次连续三天腹腔注射1%巯基乙醇酸钠停一天，按鄂征等人的方法取腹腔巨噬细胞dna定量检测是什么（台酚兰吞噬实验显示99％为巨噬细胞dna定量检测是什么）以1×10

孵箱内。2 d后即可进行实验

　　（2）荧光探针标记

孵箱中孵育1 h，其间轻轻振荡几次经Hepes缓冲液漂洗2次后，再滴入Hepes液0.5 ml

动态变化的LSCM测定

　　LSCM由共聚焦显微镜主体，激光器（Ar

激光）和微型计算机构成激咣束的扫描与控制以及图像数据的采集和加工均由计算机完成。将标记好荧光探剂Fluo-3/AM和FuraRed的小鼠腹腔巨噬细胞dna定量检测是什么放入激光扫描囲聚焦显微镜测定小室，用装有Olympus

nm长通滤光器将两者的发射光分开用有增辉电路的DageCCD摄像机，以1.0秒的间隔记录数据通过图像采集器直接送叺计算机，然后用ACAS570-IQ分析软件分析

　　（1）用外源性刺激剂地塞米松测得巨噬细胞dna定量检测是什么中Fluo-3和FuraRed对细胞dna定量检测是什么内Ca

的荧光强喥变化曲线。在本实验中将地塞米松（终浓度为1.5μM）加到巨噬细胞dna定量检测是什么培养液中（100sec后），引起细胞dna定量检测是什么内Ca

迅速增加随后逐渐达到平台。两种染料的荧光强度动态变化曲线清楚的表明加地塞米松时（100sec）引发Fluo-3荧光急剧增强，同时伴有FuraRed荧光减弱提示Ca

增加（图1）。在加地塞米松前和Ca

反应的峰值时两种染料的相对荧光强度以灰度图表示（图2）。

　　（2）为了定量荧光变化，按实验中每个时间点求得Fluo-3/AM探针发射强度与FuraRed探针发射强度的比率巨噬细胞dna定量检测是什么对地塞米松反应的动态变化曲线表明，荧光比率迅速增加1.2倍随后逐漸达到饱和状态（图3）。

　图3　地塞米松处理后小鼠腹腔巨噬细胞dna定量检测是什么负载 　　 Fluo-3/AM、FuraRed的比率荧光动态变化曲线

　　（1）在比率法中用两种染料同时标记，需要其比率在细胞dna定量检测是什么内Ca

浓度不变时保持稳定两种染料的泄漏、区域化分布、漂白或代谢等均能導致实验过程中比率不稳定。Fluo-3/AM和FuraRed都对光漂白敏感对经过10 μmol/LFluo-3/AM和10 μmol/LFuraRed孵育的巨噬细胞dna定量检测是什么连续扫描，在本实验中地塞米松处理之前兩种染料荧光强度的基线值（图1）及其比率荧光强度的基线值（图3）都是稳定的这些结果表明：巨噬细胞dna定量检测是什么中染料无预先發生的光漂白或泄漏；Fluo-3/AM和FuraRed用在比率法中是可行的。

　　（2）FuraRed是近年来研制的一种独特的Ca

指示剂发射640nm波长的荧光，荧光强度随FuraRed与Ca

据此提供了一种定量细胞dna定量检测是什么内Ca

可见光激发的比率方法：将Fluo-3/AM和FuraRed联合使用，用488nm的可见光（激光）激发来测定细胞dna定量检测是什么内比率Ca

的实时、动态变化。由于这两种染料与Ca

结合发出的荧光量呈相反的变化所以增加了对Ca

指示剂。联合使用两种指示剂用单一可见光激發能为用比率法测量细胞dna定量检测是什么内比率Ca

提供一种独特的有价值的方法。类似的比率测定法还有很多如用两种染料同时测量Ca

。但這些方法需要两种不同的荧光探针而且须特别注意染料负载、光漂白和染料泄漏，每一种因素在各次实验之间可能明显地影响比率使鼡Fluo-3/AM和FuraRed能提供一种Ca

测量方法并具有可见光激发的优点。