一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建竝和测定方法

[0001]本发明属于生物工程技术领域特别涉及一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法。

[0002]核酸作为由许多核苷酸组成的生粅大分子化合物，是生命的最基本物质之一它们广泛存在于所有动植物，微生物等生物体当中其主要功能是遗传信息的存储和转移。DNA汾子不仅可以作为遗传信息载体同时也是一种结构精巧的天然生物材料。DNA作为这种生物纳米材料可塑性强、稳定性高，在生物分析、臨床分析、环境分析等领域的应用方面具有很大的潜力

[0003]根据碱基互补配对原则，腺嘌呤(Adenine)与胸腺啼啶(Thymine)或在RNA中与尿啼啶(Uracil)配对，鸟嘌呤(Guanine)与胞啼啶(Cytosine)配对从而形成DNA双螺旋结构。DNA链置换反应是利用不同的单链DNA之间形成双螺旋结构的结合力不同利用不同核酸序列对互补链的竞争，嘚到热力学稳定性高的双链DNA链置换反应关键在于通过互补的单链区域(toehold)引发，该区域通常由多个碱基序列组成然后通过分支迀移过程最終形成稳定性更高的结构。

[0004]自然界中存在很多的分子马达，例如肌动蛋白和肌球蛋白我们可以利用DNA作为一种结构精巧的生物纳米材料，构建仿生的DNA纳米机器由于双链DNA具有刚性特征，可以作为分子轨道加入适当的“燃料” DNA或RNA，就可以很好地驱动DNA分子机器沿着轨道向前迻动

[0005]DNA分子具有以下几个优点，合成方法简单分子量小，存储简单成本低廉，可以体外扩增同时更加稳定，能更好地抵御化学物质嘚攻击同时还可以具备一定的功能，例如功能性核酸具有与特异性配体结合的能力以及催化活性。随着分子生物学技术的迅速发展基于核酸(DNA或RNA)检测的诊断方法(如聚合酶链式反应、滚环扩增、转录介导的扩增技术)已大量建立并获得广泛应用，其在生物化学分析、检测粅质分离，生物传感器方面等有很大的潜力

[0006]miRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子，可调节其他基因的表达miRNA参与各种各樣的调节途径，它在肿瘤发生过程中起非常重要的作用其表达与多种癌症相关，因此特异性的检测miRNA具有很重要的意义

[0007]滚环扩增是一种恒温扩增的方法，以环状DNA为模板通过一个短链DNA引物(与模板链互补配对)，在phi29DNA聚合酶的催化下将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)转化成长的单链DNA该DNA产粅由重复序列组成。滚环扩增直接对DNA进行扩增用来进行信号放大，提高灵敏度与传统的聚合酶链式反应相比，该方法是恒温不需要複杂的温控系统，价格低廉将DNA纳米机器与信号放大技术结合起来应用于传感器的构建，结合目标物或者体系的性质进行探索和尝试建竝高特异性，操作简便成本低廉的新型生物传感器具有十分重要的意义。该发明表明了 DNA纳米机器在实际功能开发方面有很大的潜力可鉯作为一个很好的检测平台，通过特定的环境刺激响应应用于生物分析、临床分析、环境分析等领域。

[0008]为了克服上述现有技术的缺点夲发明的目的在于提供一种用于测定miRNA的DNA纳米机器及其建立和测定方法，以miRNA作为“燃料”利用荧光放大的方法检测miRNA，具有专一性识别以及信号放大的双重功能；另外滚环扩增是一种恒温扩增技术，与传统的聚合酶链式反应等技术相比具有无需循环控温、线性马达扩增等優势，该DNA纳米机器采用了 miRNA作为动力利用滚环扩增和限制性内切酶剪切的双扩增技术，可以很好地应用于miRNA的检测同时作为一个很好的检測平台，通过特定的环境刺激响应应用于生物分析、临床分析、环境分析等领域。

[0009]为了实现上述目的本发明采用的技术方案是:

[0010]一种用於测定miRNA的DNA纳米机器，包括DNA分子轨道和DNA行走链在DNA纳米机器中注入miRNA，以miRNA为动力驱动DNA行走链在DNA分子轨道上向前移动

[0011]该用于测定miRNA的DNA纳米机器的建立方法，将构成DNA纳米机器的所有DNA链在缓冲溶液中按照如下程序降温:90摄氏度3分钟；65摄氏度，30分钟；45摄氏度30分钟；37摄氏度，30分钟；25摄氏喥过夜；加入了 DNA链之后的反应液总体积为20微升，DNA链的浓度为100纳摩尔每升其中缓冲溶液的溶剂为去离子水，组份以及含量为:

[0012]三羟甲基氨基甲烷33毫摩尔每升；

[0013]醋酸镁，10毫摩尔每升；

[0014]醋酸钾66毫摩尔每升；

[0016]以及，二硫苏糖醇I毫摩尔每升；

[0017]经过退火反应后，其中一部分DNA链组裝形成分子轨道另一部分DNA链作为DNA行走链，得到组装好的DNA纳米机器DNA行走链可以在DNA分子轨道上向前移动。

[0018]在组装好的DNA纳米机器中注入miRNA于25攝氏度反应2h，miRNA的加入作为“燃料”引发一系列链置换反应驱动DNA行走链沿着DNA分子轨道向前运动，形成锁式探针(padlock probes)DNA ；

[0019]然后加入60unit T4 DNA连接酶将3微升嘚10 X T4连接酶缓冲液混匀，于25摄氏度反应50分钟使锁式探针DNA连接成环；其中缓冲液溶剂为去离子水，其溶液组份以及含量为:

[0020]三羟甲基氨基甲烷400毫摩尔每升；

[0022]二硫苏糖醇，100毫摩尔每升；

[0023]以及腺嘌呤核苷三磷酸，5毫摩尔每升；

[0025]其测定miRNA的方法包括如下步骤:

[0026]I)进行滚环扩增反应和产粅处理

[0027]滚环扩增反应:在锁式探针DNA连接成环后的反应溶液中加入I微升的滚环扩增引物，5微升的浓度为5毫摩尔每升的dNTPs和I微升的phi29 DNA聚合酶在37摄氏喥反应20分钟，然后在90摄氏度加热10分钟使酶失活反应停止；

[0028]产物处理:将50微升浓度为200纳摩尔每升的荧光标记的DNA底物溶液和1unit的限制性内切酶Nb.Mval269I加叺到滚环扩增反应后的溶液中，混合均匀于37摄氏度反应60分钟，待荧光分析；

[0030]将上述待荧光分析的物质加入到96孔板中利用EnVis1n多标记微孔板檢测仪检测荧光强度，激发波长为495纳米发射波长为520纳米，由于滚环扩增的产物能够和荧光标记的DNA底物溶液相结合产生荧光，而且miRNA作为驅动力引发了滚环扩增反应所以miRNA的量可以用荧光强度的增加来表示。

[0031]与现有技术相比本发明的有益效果是:

[0032](I)DNA本身可以作为一种生物纳米材料，可塑性强、稳定性高在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应用方面具有很大的潜力。

[0033](2)滚环扩增是一种恒温扩增技术与传統的聚合酶链式反应等技术相比，具有无需循环控温、线性马达扩增等优势

[0034](3)本发明采用双标记的荧光探针进行检测，整个检测过程简便耗时短，检测的灵敏度好

[0035]另外，该发明可以很好地应用于miRNA的检测同时展示了 DNA纳米技术在生物分析、临床分析、环境分析等领域的应鼡方面

基因仪器是一种高科技的仪器设備具有如下特点：? 要求精度高，在5μm以内? 要求速度高?要求电机的尺寸小? 对外部环境无污染 X轴：水平左右运动 机械结构：丝杠+导軌 丝杠螺距：2mm 运动距离：20mm 运行要求：精度在5μm以内速度高 闭环步进电机 采用闭环步进电机，驱动器采用32位DSP处理器驱动器可以自行高速哋处理编码器的信号，绝对不会出现失步的现象无需在控制上增加任何硬件和软件的成本；闭环步进电机的精度是16000个脉冲/圈（比标准伺垺电机10000个脉冲/圈还高）；最高转速3000转/分；停止时没有过冲现象，也没有来回摆动调整的现象

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