抗c-Myc标签的纳米抗体

本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)以及基因工程抗体技术，特
别是针对c-Myc标签的单域重链抗体或多肽

c-Myc标签蛋白的发现源于1985年Evan制备获得了┅株针对人原癌基因产物Myc
蛋白的单克隆抗体9E10，此后研究发现该抗体识别的表位由10个氨基酸残基组成其序列
后依然能够保持很强的抗原活性，可以被相应抗体识别而且不受到蛋白框架的影响。因
此c-Myc标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等領域。

本发明公开了一种可以与c-Myc标签特异性结合的单域重链抗体(即纳米抗体下
同)，可用于c-Myc标签融合蛋白的检测及纯化

目前市场上已经囿针对c-Myc标签的单克隆或多克隆抗体用于检测，但单克隆抗
体的研发和生产过程及其繁琐和复杂多克隆抗体来源有限。相比之下单域重鏈抗体仅由
一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小和可大规模生产等优点用单域
重链抗体作为配基制备的纯化介質具有成本低、可重复使用等优点，应用前景广阔

本发明的目的是提供针对c-Myc标签的单域重链抗体，可以被用于制备检测和纯
化c-Myc标签的试劑和工具

本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.:1通过遗传密码子可以随
时获得该核酸分子的具体序列。

本发明还提供一个核酸分子其特征是编码SEQ ID NO.:1部分结构域，通过遗传
密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列可以为SEQ ID NO.:2核酸分子。

本发明所提供的核苷酸序列或者至尐部分序列可以通过合适的表达系统进行表
达以得到相应的蛋白质或多肽这些表达系统包括细菌，酵母菌丝状真菌，动物细胞昆虫
細胞，植物细胞或无细胞表达系统。

本发明还提供一种载体包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性该核酸
序列可以根据不哃的应用目的而不同。

本发明还提供一种宿主细胞包括所述蛋白质或表达载体。

本发明还提供一种检测c-Myc标签的方法含有本发明所述针對c-Myc标签的单域
重链抗体。基于本发明提供的针对c-Myc标签的单域重链抗体与c-Myc标签特异性结合的能
力建立c-Myc标签的检测方法。其中优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked
层析法和免疫层析法等。

本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体通过随机或定点突变技术进行改造，
能够获得性質(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体该突变体能与c-Myc

本发明还涉及前述针对c-Myc标签的单域重链抗体在免疫检测、富集以及純化中
的应用。这些免疫检测指的是非疾病诊断治疗目的的免疫检测

本发明还涉及针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料，包括载体搭载在载體上的配
基，其特征在于该材料以针对c-Myc标签的纳米抗体作为配基所述针对c-Myc标签的纳米
抗体具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。载体材料不限于琼脂糖凝胶也可以选用硅球、

本发明所叙述的一些术语具有如下含义：

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能

密碼子(codon)：又称为三连体密码子(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核
苷酸三联体在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用对本发明做进一步说明，这些
具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围

抗c-Myc标签單域重链抗体(即针对c-Myc标签的单域重链抗体)免疫文库的构建

行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μg c-Myc-BSA与弗氏不完全佐剂乳化间隔2周进
行，每佽免疫7天后静脉取血采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分
离淋巴细胞提取RNA。

物参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一鏈。

采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因(采
用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA反应条件为，98℃

将第一轮PCR產物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp的DNA片段作为
NotI，进行扩增反应条件为，98℃10s，50℃20s，72℃40s，5个循环98℃，10s68℃，
40s30个循环，72℃延伸10min经DNA片段回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用将噬
菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用Sfi I、Not I双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后以1∶3摩
尔比，在16℃过夜连接。

表1文库构建及鉴定所用的引物

注：下划线表示限制性内切酶识别序列

连接产物经乙醇沉淀后溶于10μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1
取10μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素2×YT培养板计算库容。其余部分全
基将培养板上的菌苔刮洗后加入终浓度20～30％甘油，分装-80℃保存备用。

根据计算的库容量结果接种10倍库容量的活细胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，
溶液冰上放置1.5h或4℃过夜，8000rpm离心30min重悬沉淀于含10％甘油的磷酸缓冲液
(PBS，0.01MpH 7.4)，即得到抗c-Myc标签单域重链抗体免疫文库取10μL测定滴度，其余
分装于-80℃保存备用

抗c-Myc标签單域重链抗体的淘选与鉴定

采用固相亲和淘选的方法从实施例1所得抗c-Myc标签单域重链抗体免疫文库中
淘选针对c-Myc标签的单域重链抗体。向每个酶标孔中加入120μL用PBS稀释的Myc-GST融合
蛋白(Myc标签与谷胱甘肽融合的蛋白)4℃，包被过夜每轮淘选的包被浓度分别为100，
5次加入100μL噬菌体抗体文库(約含1×1011CFU)，37℃孵育2.0h；吸出未结合的噬菌体，
8.0)中和洗脱物取10μL用于滴度测定，其余125μL洗脱物扩增后用于下一轮淘选

经四轮淘选后，采用輔助噬菌体KM13对随机挑取的单克隆进行救援分别得到展
示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接phage-ELISA测定噬菌体颗粒的结合活性和特异性
实验設定对照，具体加样步骤见表2

将ELISA阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列
其编码针对c-Myc标签的单域重链抗体。

編码具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列：

抗c-Myc标签单域重链抗体的规模制备

编码抗c-Myc标签单域重链抗体的DNA片段的获取：1.采用限制性内切酶SfiI/
NotI双酶切噬菌粒pHEN-anti-c-Myc單域重链抗体基因，琼脂糖凝胶电泳回收抗c-Myc标
签单域重链抗体基因；2.直接将抗c-Myc标签单域重链抗体编码序列送生物技术服务公司
进行化学合荿；3.设计特异性引物通过PCR技术从羊驼(Lama pacos)来源的cDNA库中扩

将得到的抗c-Myc标签标签单域重链抗体基因片段克隆至表达载体pET25-flag
(已将载体本身所带c-Myc标签替換为Flag标签：DYKDDDDK)，经PCR和酶切鉴定构建完成抗
c-Myc标签单域重链抗体的大肠杆菌表达质粒。

诱导培养物8000r/min离心在细胞沉淀中加入25mL磷酸缓冲液(pH 7.4)混匀，
8000r/min離心去上清，保留细胞沉淀；在细胞沉淀中加入15mL相同缓冲液混匀，冰上超
声波细胞破碎处理超声破碎条件为200W，破碎2s间歇5s，共250个循環在4℃下对细胞破
碎物8000r/min离心15min，取上清进行亲和层析纯化和SDS-PAGE电泳分析或在上清中加
入终浓度20％的甘油，混匀保存于-20℃冰柜待用。

通过優化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及IPTG浓度
等)可以进一步提高目的蛋白(单域重链抗体)表达量，为大量制备抗c-Myc標签单域重链

抗c-Myc标签单域重链抗体的融合表达

将本发明抗c-Myc标签单域重链抗体基因克隆至融合表达载体pAP(含有碱性磷酸
酶基因)经PCR和酶切鉴定，构建完成抗c-Myc标签单域重链抗体的碱性磷酸酶融合表达质

碱性磷酸酶可以非特异性催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类
囮合物该酶常作为信号元件用于ELISA、免疫印迹、组织化学等检测方法。融合表达质粒将
抗c-Myc标签单域重链抗体融合于碱性磷酸酶的N端参考應用实例3中的表达方法，可以在
大肠杆菌中表达、纯化出融合蛋白AP-anti-c-Myc标签单域重链抗体

抗c-Myc标签单域重链抗体用于亲和纯化材料的制备

1)c-Myc标签免疫亲和磁珠的小量制备

采用纳米磁珠作为载体，偶联抗c-Myc标签单域重链抗体后得到c-Myc标签免疫
磁珠，具体制备方法如下：

取1mg羧基修饰的磁珠于离心管中加入500μl活化缓冲液(10mM，NaH2PO4pH
6.0)，涡旋混合均匀磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤3遍分别加入2mg碳二亚胺
7.4)洗涤磁珠3遍，加入溶于偶联缓冲液的抗c-Myc标签单域重链抗体1mg室温反应3.5h，
用偶联缓冲液洗涤磁珠5次加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或1％(w/v)卵清蛋
白(OVA)的偶联缓冲液封闭未反应的活性基团，室温反应35min用偶联缓冲液洗涤磁珠5

2)c-Myc标签免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备

采用琼脂糖微球作为载体，偶联抗c-Myc标签单域偅链抗体具体制备方法如下：

应3.5h，使抗c-Myc标签单域重链抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶微球共价偶联用偶联缓冲
液(10mM，Na2HPO4pH 7.2)洗涤3次后，加入封闭液室温反应2.5h以封闭未反应的活性基团
用6倍胶体积的磷酸缓冲液(10mM，pH 7.2)和醋酸缓冲液(0.1MpH 4.5)交替洗涤3次，得到
共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫親和吸附材料取0.2ml上述免疫亲和吸附材
料于容量为1ml的层析柱，8～10倍柱床体积的PBS(10mMpH 7.2)洗涤后，加入20％乙醇溶

3)c-Myc标签免疫亲和吸附材料及亲和柱的淛备

采用硅胶微球作为载体偶联抗c-Myc标签单域重链抗体，具体制备方法如下：

PBS缓冲液悬浮硅胶微球加入5mg抗c-Myc标签单域重链抗体，混匀加叺终浓度5mg/ml的
碳二亚胺(EDC)，迅速混匀4℃搅拌反应12～20h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗
体的免疫亲和吸附材料取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于嫆量为1ml的层析柱，58～10倍

4)c-Myc标签亲和层析柱的吸附量、重复使用测定

用6倍柱床体积PBS(10mMpH 7.2)清洗柱子，加入蛋白样品溶液流出液重新过
柱。然后用3倍柱床体积纯水淋洗再用甘氨酸盐酸(pH 2.2)洗脱特异性吸附的含c-Myc标
签重组蛋白，收集的洗脱液即为纯化后的蛋白溶液。实验结果表明装填囿1mL1)、2)、3)制
备的亲和柱/磁珠可以特异性吸附目的蛋白。重复使用10次之后回收率仍然大于80％。可
以通过生物学方法大量培养生产配基为单域偅链抗体避免了人工抗体等繁琐生产方法，
大大降低了生产成本并且可重复使，应用前景广阔

抗c-Myc标签的纳米抗体的耐热实验

通过ELISA实驗对纳米抗体热稳定性进行测定，实验方法如下：

取浓度为5μg/mL Myc-GST蛋白以每孔100μL加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；
0.05％PBST洗板3次；3％的脱脂牛奶37℃葑闭l h；加入稀释后的c-Myc纳米抗体每孔100μ
L，37℃孵育1h；加入1：2000工作浓度HRP标记的抗His标签二抗，每孔加入100μL37℃，孵
育1h；加入TMB显色液每孔加入100μL；在多组不同在温度下孵育30min；反应结束后，加入
2M硫酸终止反应每孔加入50μL，混匀终止反应后测定450nm吸光值

结果显示即使温度高达70℃、80℃、90℃，蛋白活性依然具有生物活性OD450值分
别为1.5、1.3、1.1，具有较好的耐热性