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基因工程植物基因：植物基因工程载体及其构建
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第八章 植物基因工程载体及其构建第一节 植物基因工程载体种类第二节 根癌农杆菌 Ti质粒的结构与功能第三节 Ti质粒基因转化机理第四节 Ti质粒的改造及载体构建第五节 常用选择标记和报告基因植物基因转化系统l 1.载体转化系统（ Ti质粒转化载体,Ri质粒转化载体、病毒转化载体）l 2,DNA直接导入转化系统（原生质体、基因枪）l 3.种质转化系统（花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊子房注射法）。载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统,其中又以 Ti质粒转化载体最为重要。第一节 植物基因工程载体种类根据其功能和构建过程,可分为以下种类 。（ 1） 目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因 。 与微生物基因工程相似,通常是由多拷贝的 E,Coli小质粒为载体 。（ 2） 中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒 。 是由大肠杆菌质粒插入 T-DNA片段,目的基因和标记基因等构建而成 。（ 3） 中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体 。 是构建转化载体的质粒 。（ 4） 卸甲载体：是解除武装的 Ti质粒或 Ri质粒,是构建转化载体的受体质粒 。（ 5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。第二节 根癌农杆菌 Ti质粒的结构与功能一,Ti质粒的遗传特性,结构及功能二,T-DNA的基因结构与功能三,Vir区操纵子的基因结构与功能一,Ti质粒的遗传特性、结构及功能1,Ti质粒的遗传特性及类型l Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状 DNA分子,其分子量为 95～ 156× 106D,约有 200kb组成 。l 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同,Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型 (octopine),胭脂碱型(nopaline),农杆碱型 （ agropine） 和农杆菌素碱型 （ agrocinopine） 或称琥珀碱型 (succinamopine)2,Ti质粒的功能区域Ti质粒可分为四个区 。（ 1） T-DNA区 （ transferred-DNA regions）,T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时,从 Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 DNA,称为转移 DNA。 该 DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关 。（ 2） Vir区 （ virulence region）该区段上的基因能激活 T-DNA转移,使农杆菌表现出毒性,故称之为毒区 。 T-DNA区与 Vir区在质粒 DNA上彼此相邻,约占Ti质粒 DNA的三分之一 。（ 3） Con区 （ regions encoding conjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因 （ tra）,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移 。 冠瘿碱能激活 tra基因,诱导 Ti质粒转移,因此称之为接合转移编码区 。（ 4） Ori区 （ origin of replication）该区段基因调控 Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。3,Ti质粒的生物学功能Ti质粒的功能可归为以下 7个方面,① 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸 （ IAA） 和一些细胞分裂素的活动 。② 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分 。③ 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力 。④ 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性 。⑤ 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力 。⑥ 决定寄主菌株的植物寄主范围 。⑦ 有的 Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育,即具有对噬菌体的,排外性,。二,T-DNA的基因结构与功能1.T-DNA的发现Chilton等人 （ 1982） 利用同位素标记的 Ti质粒做探针发现,加入高浓度烟草肿瘤细胞的 DNA后,Ti质粒DNA的复性速度有加快的趋势 。 这表明肿瘤 DNA中有 Ti质粒的顺序,但该顺序不多,而且没有检测到完整的 Ti质粒 。 以后这些作者将章鱼碱型的 Ti质粒 B6-806用内切酶 Sma I分解成 19个片段,分别用同位素标记做成探针,然后与肿瘤 DNA进行分子杂交,结果有二段 Ti质粒的DNA（ 3b和 10c。 ） 能和肿瘤 DNA杂交,也就是 Ti质粒中这两段 DNA是与肿瘤 DNA同源的部分 。 进一步研究证明,这部分 DNA是从质粒 DNA上切割后,转移到肿瘤细胞,故称之为转移 DNA（ transferred-DNA） 。 这是首次证明在高等植物的细胞内存在有微生物的 DNA顺序 。2.T-DNA的结构特点l Ti质粒 T-DNA区的长度约为 23kbl T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核 DNA中； T-DNA含有激发和保持肿瘤状态所必需的基因； T-DNA和植物 DNA之间没有同源l 在 T-DNA的 5′端和 3′端都有真核表达信号 。 如 TATAbox、AATAAbox及 polyA等 。l T-DNA的两端左右边界各为 25bp的重复序列，即边界序列（ border sequence），分别称之为左边界（ BL或 TL）和右边界（ BR或 TR）。 (图 8-4)。该 25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（ TR）序列更为保守，左边界 (TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是 14bp，可分为 10bp(CACGATATAT)及 4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。左边界（ TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（ TR） 缺失则不再能致瘤,这里几乎完全没有 T-DNA的转移,这说明右边界 (TR)在 T-DNA转移中的重要性。3,T-DNA上的编码基因及功能T-DNA的转录有下述共同点：① T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录 。② T-DNA上每个基因都有各自的启动子 。③ 基因的转录由植物细胞 RNA聚合酶 Ⅱ 完成 。④ T-DNA具典型的真核生物 RNA合成起始和终止的调节信号,在其 5’ 端转录起始处有 TATA和 CAAT盒 。 同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现,故 T-DNA的转录机理可能与真核生物相同 。⑤ 植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性 。T-DNA区基因的功能研究方法,用遗传学方法在 T-DNA区中引入转座子，使特定的基因发生突变，从而在肿瘤细胞中 T-DNA的一个或多个转录产物也随之消朱。基因突变后不能转录出它所编码的mRNA，这时可观察到带有突变基因的 T-DNA的植物细胞的表型，从而确定这些基因转录产物的功能。用这种方法证明了编码两类转录产物的基因序列：T-DNA区 编码的基因第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因 。第二类是致瘤基因,前两个基因被称作为生长素基因 （ Aux） 。Aux基因突变将诱导肿瘤细胞茎芽产生,因此 Aux基因后来被称作Tms （ tumour morphology shoot） 基因,即肿瘤形态茎芽基因或 Shi（ shoot induction） 基因,即茎芽抑制基因 。 目前已查明,实际上 Aux基因包括两个基因,一个是 Aux-l（ Tms-1）,编码色氨酸单加氧酶 （ typtophan mono-oxygenase）,将色氨酸转变成吲哚乙酰胺 （ indol acetamid，,IAM）,故现在也称为 Iam基因；另一个是 Aux-2,编码吲哚乙酰胺水解酶,将 IAM转变成乙酸吲哚 IAA，现称为 iaaH基因 。 第三个基因是细胞分裂素基因 （ cyt）,其突变将引起易生根特性 。 故称为 Tmr（ tumour morphology root） 基因,即肿瘤形态根基因或 Roi（ root induction） 基因,即根抑制基因 。Cyt基因编码异戊烯基转移酶 （ isopentenyltransferase）,催化异戊烯基焦磷酸盐 （ isopentenylpyrophosphate） 和 AMP形成细胞分裂素即异戊烯基 -AMP（ isopentenyl-AMP）,故现称为 Ipt基因 。T-DNA区 编码基因的功能Aux基因突变将阻断肿瘤细胞生长素的大量合成,使细胞内的细胞分裂素与生长激素的比值升高 。 野生型肿瘤细胞中细胞分裂素与生长素的比值为 0,22,而突变型该值上升到 14.4,因此有利于芽的形态发生 。 同时 Cyt基因突变将会阻断细胞分裂素的大量合成,两者之间的比值下降到 0.02,因此有利于根的形态发生 。正是由于 Tms和 Tmr基因的表达,使转化植物细胞内激素平衡紊乱,冠瘿瘤细胞无限生长,形成激素自主性特性,引起癌变 。 Tms和 Tmr基因是致瘤所必须的基因,因此又称它们为致瘤基因 （ onc gene） 。三,Vir区操纵子的基因结构与功能1,Vir区操纵子的基因结构除 T-DNA外,Ti质粒的 vir区也是农杆菌致瘤所必须的 。 Vir区仅位于 T区 DNA左侧 。 两者之 间 的距 离 常随 Ti 质粒 类 型不 同而 有 差异,Octopine的间隔距离较大,而 Nopaline间隔距离很小 。 Octopine Ti质粒的 Vir区大小为40bp,含有 VirA,B,C,D,E,F,G,H(旧称PinF)等 8个操纵子 (operon),共 24个基因 。 它们协同调节,形成一个调控子 (regulon),起共调控作用 (co-regulation)。 而 Nopaline有 7个操纵子,比 Octoppine少一个 VirF操纵子 。2,VirA操纵子的诱导表达及功能对 VirA基因进行顺序分析发现,VirA是单个基因组成,分子大小为 2.8kb,仅编码一条多肽 。 Vir基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后才能转录活化,其中首先是 VirA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白（ membrane bound chemoreceptor protein,92kD）,可直接对植物产生的酚类化合物感应,称为感应蛋白 （ sensor） 。 当 AS与 TM-2受体部位结合后,会使整个 VirA蛋白构象发生变化,其 C端活化 。 VirA蛋白的胞质区有自激酶 （ autokinase） 的功能,可在保守的组氨酸残基上磷酸化,从而 VirA蛋白被激活 。 磷酸化的 VirA蛋白具有转移其磷酸盐至 VirG蛋白的能力,使VirG蛋白激活 。3,VirG操纵子的诱导表达及功能VirG操纵子小于 VirA,只有 1.0kb,同样是单基因结构,只能编码一条多肽,被称为 VirG蛋白,即 DNA结合活化蛋白 （ DNA-binding activator protein） 。 它的 C端已知有 DNA结合活性 。 它的 N未端部分具有磷酸化的酸性结构 。 当磷酸化的 A蛋白将其磷酸基转到 VirG蛋白 （ 30kD）保守的天冬氨酸盐残基上时,使 VirG蛋白活化 。 活化的VirG蛋白可能以二体或多体形式结合到 Vir区启动子的特定区域,从而成为其它 Vir基因转录的激活因子,打开 VirB、C,D,E,H等几个基因 。 并己证明,VirA或 VirG突变后会减弱或完全失去对其它 Vir位点活化的诱导 。 VirA及 VirG的这种调控作用被称为双因子调控体系 （ two一 componentregu1atory system） 。4,VirH,F及 Tzs操纵子的诱导表达及其功能这些基因对质粒是特异性的,在 Octopine中有 VirF、VirH,在 Nopaline中有 Tzs。VirH：可能对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用,从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制,可增强致瘤能力 。Tzs：大部分 Nopaline菌株的 Ti质粒上均有 Tzs基因,即转运玉米素合成酶基因 （ trans-zeatin synthease gene）,在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外 。 该细胞分裂素被植物所吸收后,能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂,提高植物对农杆菌转化的感受性 。VirF操纵子编码一个 23kD蛋白,它与任何数据库中所有蛋白质的序列无明显同源性 。 最近采用报告基因连接插入法研究发现,VirF在 T-DNA运输时发挥作用 。第三节 农杆菌 Ti质粒基因转化机理已知农杆菌附着到植物细胞后,只留在细胞间隙中 。 T-DNA首先在细菌中被加工,剪切,复制,然后转入植物细胞,并非整个 Ti质粒都进入植物细胞 。 该基因转化过程是一个复杂的遗传工程 。一,T-DNA的加工及转移Vir基因操纵子系统被活化后,在农杆菌中可测到单链 T-DNA（ ss T-DNA,亦称 T链或正链 ）,T链的形成取决于 VirD1及 VirD2两种蛋白,这些蛋白一起决定内切酶活性,在边界重复序列的特定位点形成切口,产生单链断裂 。 因为 T链的合成是从右边界至左边界,即 5′→ 3′,若右边界缺失,则 T链的合成便无法开始,故目前认为 T-DNA是以 T链形式向植物细胞转移的,而不是双链的 T-DNA分子 。 左边界作为 DNA合成起始点的效率比右边界低,这并不是因为左,右边界的核苷酸序列有什么不同,而是因为在右边界的右边约 17bp的超驱动序列,它可使T 链的形成大大增加,故被称作 为,转化增强 子（ transfer enhancer或 overdrive）,除去增强子序列导致菌株致病力消失 。 T链的形成过程如图 8-1示出 。1,T-DNA的复制首先是在下链 （ 或称底链 bottom strand）25bp重复序列的右边界左起第 3和第 4碱基间缺口剪切,然后从缺口 3′端开始合成新的 DNA链,并一直延伸到左边界第 22碱基处,置换出原来的下链,形成 ssDNA,即 T链 。 Nopaline T-DNA在缺口剪切后形成包括左右边界在内的单一 T链,但 Octopine T-DNA在剪切后则可形成 6种 T链,即 TL,TC,TR,TL-TC,TC-TR,以及 TL-TC-TR，这意味着边界序列的剪切是相互独立的 。2,VirD1及 VirD2的功能VirD1（ 16kD）及 VirD2（ 47Kd）蛋白与 T-DNA的加工有关，它决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生 T链断裂。 VirD1及 virD2突变,T-DNA边界便不能缺口剪切并形成 T链。这种缺口剪切可分成两步：VirDl首先与 25bp边界序列亲和结合，使边界序列松弛，然后使 VirD2可在特异位点剪切。 VirD2至少有两个功能，①特异剪切，并与 T链的 5′端共价结合,应当指出,农杆菌并非以裸露的 DNA分子转入植物细胞,而是 T链的 5′端与VirD2蛋白共价结合,这样可使 T链的 5′端不受核酸酶的攻击。②导向功能。已知仅 VirD2蛋白分子 N-端的 50%已足以缺口剪切,形成 T链。 VirD2蛋白分子的另一半即 C端可作为核定位的信号,引导 T链进到植物的细胞核,故称这为“向导”。这是因为 C端含有特异的氨基酸序列 (核靶序列,nuclear targetng sequence)之故。3,VirC的功能VirC编码两种蛋白 VirC1及 VirC2蛋白 。 VirC1蛋白可特异地与 Octopine Ti质粒上的超驱动序列结合,从而促进 T-DNA边界序列的缺口剪切 。若 VirC操纵子突变,则侵染性减弱 。 当 VirD1、VirD2不足时,VirC1有促进 T-DNA加工的作用,但当 VirD1,VirD2高量表达时,则 VirC1对 T链的形成无作用 。 VirC2蛋白的功能尚不清楚 。其它 Vir基因产物与边界缺口剪切及 T链形成无关 。二,T链蛋白复合体的形成及 VirE的功能T链必须横向跨越细菌细胞膜,细菌细胞壁,植物细胞壁,植物细胞膜及核膜,才能整合进植物基因内 。 在此全部转动过程中,Ｔ链必须避免被核酸降解,因此Ｔ链可能以一种 DNA-蛋白复合体 (简称 T链复合体或 T复合体 )的形式存在 。 目前已知至少有两种 Vir特异蛋白即 VirE2及 VirD2与 T链复合体的形成有关 。VirE2的功能,编码 ssDNA结合蛋白,该蛋白 (60.5kD)可非特异地与任何 ssDNA结合 。 通达与Ｔ链非共价结合,VirE2可包被 T链,形成细长的核 -蛋白丝,因而可能在 T-DNA转移过程中起保护 T 链的作用,使 ssDNA抗 3′和 5′外切核酸酶和内切核酸酶 。VirE2与 ssDNA结合后,可使 ssDNA解折叠和伸长 (约 50%),形成一种很细的蛋白 。 故 VirE2不仅保护 ssDNA,而且 T使链形变成一种可转运的形式 。三,T链复合体的转运及 VirB的功能如上所述,T链复合体至少包括 T链,VirD2及VirE2。 VirD2及 VirE2可能已足以保护Ｔ链并对Ｔ链的转运起导向作用,但Ｔ链的转运无疑还需要其它活性物质 。 这种活性物质可能来自蛋白质,可以是细菌和 /或植物的特异蛋白 。 若为细菌蛋白,则可能是 VirB蛋白 。 因为Ｔ链转运的第一步是通过细菌细胞膜,因此首先必须形成跨膜孔道,需有跨膜或膜结合蛋白的参与 。1,跨膜或膜结合蛋白有两个主要特性(1) 穿膜通常需在蛋白质的 N端有一信号肽序列，这种蛋白可能独立地或在类似伴随蛋白受体帮助下穿越细菌内膜（ IM），特异肽酶在 N端信号序列处剪切，产生成熟蛋白，并停止继续转运。(2) 有富含疏水残基的约 20个氨基酸的密接伸长段（ contiguous stretches）。向 IM转运的蛋白质可以（但非必须）在其 N端含剪切的信号序列，但疏水伸长段则有锚式功能，使蛋白质驻留（ 1odging）在膜上。2,VirB的功能对 Ti质粒的 VirB操纵子序列分析表明,VirB操纵子有11个基因组成,其中绝大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白 。VirB蛋白中的 10个基因产物具有很好的跨膜拓扑特性,其中 3个已被确定为外膜蛋白,一个为内膜蛋白 。 因此这些蛋白可能一起在膜上形成一种类似于细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必需的结构,即接合孔 （ conjugativepole） 或性毛 （ sex pilus）,T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞 。 同时,VirB也可能起运输和提供能量的作用 。 已知 VirB7在 Vir蛋白中最小,含信号肽,无跨膜区,它却能通过细菌内膜,至外膜定位,它也可能是一种裂解蛋白 （ lysisprotein）,起部分裂解农杆菌的作用,使 T复合体从细菌细胞中运出,或因其定位在外膜上,可促进与植物细胞表面相互作用 。 VirB11基因上有 ATP结合位点,最近发现 VirB11蛋白确有 ATP酶活性,因此它可能在 T-DNA转移中起提供所需能量的作用 。四,T链复合体靶向植物细胞核目前已知 VirD2及 VirE2上有核定位信号 (nuclearlocalizing signal,简称 NLS)。 前已指出,VirD2Ｎ端 50%已足以特异的剪切 T-DNA的边界序列,C端 50%则含 NLS。在 VirE2中也有类似的序列,将其与 Gus融合作为报告基因,证明 virE2可使融合蛋白导向植物细胞核,但 VirE2与 VirD2相比,其核定位功能较弱 。综上所述,VirD2可能以一种极性方向，首先将 T复合体定向至核孔，而 vir E2则作为一种促进因子，保证很长的 T复合体在进入核孔时不受干扰。 VirD2及 VirE2蛋白上的核定位信号与动物相似，说明植物和动物的这种信号从进化上讲是保守的。五,T链整合植物基因组的分子机理1,整合位点及其特性遗传作图的分析表明,T-DNA在植物染色体中的插入是随机的 。 它可插入任何一条植物染色体 。 但 插入位点常有以下特点,① T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点； ② T-DNA与植物 DNA连接处富含 A,T碱基对； ③ 植物DNA上的插入靶位点与 T-DNA边界序列有一定程度的同源性 。 Matsumoto等人认为正是由于这种同源性才使得插入的 T-DNA和靶序列能互相靠近,并有效地发生 DNA链的交换 。 非常有趣的是他们还发现在植物基因组靶序列附近有一段 （ dG-dT） 10序列 。 这种 （ dG一 dT） 10是真核基因组中保守的高度重复序列 。 当 DNA处于负超螺旋时,该重复序列极易形成 Z-DNA,使位于它附近的序列部分解旋,为DNA重组,T-DNA插入提供位点 。2,T-DNA的整合机理Mayerhofer等从转化的拟南芥菜中分离并测定插入的T-DNA及插入位点序列，发现 T-DNA的插入使得靶序列缺失 29～ 73bp。一部分整合的 T-DNA片段不完整，两端均有缺失。靶序列断裂处与插入的 T-DNA两端有部分重叠。另一部分整合的 T-DNA却保持完整。其中一些插入的 T-DNA能精确地取代植物靶序列，其右边界与靶序列连接,T-DNA左未端和靶序列裂口同源。还有一种情形则是,T-DNA插入片段的未端与缺失的靶序列裂口处并无同源性，而是在其内部有部分短片段与 T-DNA未端同源。在靶序列裂口处还发现有 DNA序列的倒位或重复。T-DNA的整合是异常重组（ illegitimate recombination ）的结果。 T-DNA右未端在靶序列的识别及连接中是必需的，T-DNA左未端和两个靶 DNA未端则参与部分配对和 DNA修复。3,T-DNA整合的遗传效应T-DNA插入的位点不同,可使转基因植物具有不同的表型和遗传特性,即所谓位点效应 （ position effect） 。 已知 T-DNA可插入多个物理位点 。 遗传位点数一般少于或等于插入的物理位点数,这是因为甲基化可使基因不表达,或者几个拷贝连锁在一起 。 多拷贝的 T-DNA可插入不同的独立位点,或可首尾串联 （ trandem） 插入同一位点,多拷贝 T-DNA进人同一植物细胞后,这些拷贝之间可能相互作用,导致基因的沉默,这种现象现被称为共抑制 （ co-supression） 。T-DNA插入的遗传特性：(1)T-DNA的插入不引起植物 DNA大的重排 。 但多数插入会导致靶位点处小的缺失,缺失多至 79个核苷酸 。(2)另一个常见的结果是,在 T-DNA／植物 DNA连接处,会有几个至33个核苷酸的,填充,DNA（ Filler DNA） 存在,这些,填充,DNA的序列与靠近连接处的植物 DNA序列相似 。(3)在植物靶位处不要求有特异的序列,但若在 T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列 （ 5～ 10b） 同源,则可以在整合中起作用 。六、农杆菌染色体基因对 T-DNA转移的调控目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也和 T-DNA的转移有关,并且已经了解它们编码的蛋白质的功能 。ChvA,ChvB,ChvC参与细菌的附着功能； Cel位点与细菌表面纤维丝的合成有关 ;Att基因影响农杆菌细胞表面蛋白的合成； ivr基因的突变能使农杆菌细胞表面的脂多糖发生改变而影响农杆菌宿主范围； PscA和 ExoC基因与多糖合成有关,并影响农杆菌附着能力 。 以上这些基因的突变将使细菌表面成分发生变化,从而丧失与植物细胞识别和结合的能力 。 此外,ChvD位点影响 AS对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤能力 。 CbvE位点编码一个单糖结合蛋白,与单糖影响 Vir区的表达有关 。 Ros基因与 Vir基因的负调节有关 。 可见,目前已知农杆菌染色体上有 10个基因与 T-DNA转移有关 。第四节 农杆菌 Ti质粒的改造及载体构建一,Ti质粒的改造及卸甲载体构建二,中间载体的构建三,中间表达载体的构建四,植物基因转化载体系统的构建一,Ti质粒的改造及卸甲载体构建野生型 Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍,① Ti质粒分子量过大，一般在 160～ 240kb，比pBR322质粒大 50倍左右，在基因工程中难以操作；②大型的野生 Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不论用何种限制酶切割，都会被切成很多片段，因此难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外 DNA重组技术直接向野生型 Ti质粒导入外源基因；③ T-DNA区内含有许多编码基因，其中 Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④ Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（ 10％左右）,因此，通过 Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在 T-DNA中只有单一切点的载体；⑤ Ti质粒上还存在一些对于 T-DNA转移不起任何作用的基因。为了使 Ti质粒成为有效的外源基因导入载体,必须 对野生型 Ti质粒进行一番科学的改造 。 十分幸运的是,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性 。 因此,科学家们可以先将 T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的 Ti质粒上,这是一种把预先进行亚克隆,切除,插入或置换的 T-DNA引入 Ti质粒的有效方法 。 带有重组 T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为,中间载体,（ intermediate vector）,而接受中间载体的 Ti 质 粒 则 称 为 受 体 Ti 质粒 （ acceptor Tip1asmid ）,一般是卸甲载体 （ disarmedvector） 。1,Onc-卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic） Ti质粒载体。因为利用野生型的 Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是 T-DNA中 Onc基因的致瘤作用。因此，为了使野生型的 Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除 T-DNA上的 Onc基因，即“解除”其,武装,,构建成所谓“卸甲”或称“缴械”载体（ disarmed vector）。在这种Onc-载体中，已经缺失的 T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒 pBR322取代。这样任何适合于克隆在 pBR322质粒中的外源 DNA片段，都可以通过与 pBR322质粒 DNA的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。2,Onc十 卸甲载体对于研究外源基因在转基因植株中的表达,以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言,Onc一 体系是最有用的 。 不过,人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表达问题 。 在这种情况下,使用 Onc十菌株载体则比较合适 。 由于冠瘿瘤组织具有不依赖于激素的表型特征,所以这种载体系统的优点在于它可以快速地增生冠瘿组织,比较快速而容易得到转化体 。二、中间载体的构建1,中间载体的基本结构与特点为解决 Ti质粒不能直接导入目的基因的困难,构建中间载体 （ intermediate vector ） 是有效方法之一 。 中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体 （ 例如 pBR322质粒 ） 中插入了一段合适的 T-DNA片段,而构成的小型质粒 。 中间载体通常是多拷贝的 E.Coli小质粒,这一点对于通过体外遗传操作导入外源基因是非常必要的 。 从结构特点看可分为两类中间载体,即共整合系统中间载体和双元载体系统中间载体 。共整合系统中间载体的特征① 中间载体必须含有与 Ti质粒 T-DNA区同源的序列,此外含有 pBR的序列,在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与 Ti质粒的 T-DNA的同源序列进行重组；② 它应具有一个或几个细菌选择标记,这将有利于筛选共整合质粒；③ 它必须 有 bom位点,在有诱导质粒存在的情况下,bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；④ 它应该含有阳性植物选择标记,以利于转化植物细胞的筛选,例如新霉素磷酸转移酶 (neomycin phosphotransferase,Npt-Ⅱ )基因,其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；⑤ 它应该含有单一的限制性内切酶切点,以利于外源基因的插入；⑥ 无 Ti质粒的边界序列 。双元载体系统的中间载体与共整合系统中间载体不同之处是①无同源序列；②具有 LB和 RB;③ 无 Co1E1复制点三、中间表达载体的构建中间载体从功能看可分为两大类,即克隆载体和表达载体 。 克隆载体的主要功能是复制和扩增基因；表达载体是适于在受体细胞中表达外源基因的载体 。上述构建的中间载体导入农杆菌 Ti质粒并转化到植物细胞后,插入的外源基因能否得到表达是一个十分重要的问题 。 研究表明,早期曾通过各种中间载体引入的外源基因,如转座子的抗生素抗性基因,酵母的乙醇脱氢酶基因,动物的 β-珠蛋白基因和干扰素基因等,均未能在植物中表达 。这是因为这些外源基因都缺乏特异启动子的缘故,后来的研究发现,在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子后,可使外源基因能在植物细胞中表达 。 这类含植物 特 异 启 动 子 的 中 间 载 体 就 称 为 中 间 表 达 载 体（ intermediate expression vector） 。1．启动子及其它调控序列转录的调控对真核生物基因表达起着关键性作用 。就真核生物基因表达调控序列而言,大多数真核生物在转录起始点的 5′端上游区第 30至 25bp处具有TATA盒,在 70至 80bp处还有 CAAT盒 。 在大多数真核生物基因的 3′端具有 AATAA序列 。 这些 5′和 3′端的调控序列对真核生物的基因表达起着关键性作用 。 Ti质粒虽然来源于农杆菌,但其 Nos,Ocs、Tmr等基因具有与真核生物启动子类似的 TATA盒和 CAAT盒,均能在植物细胞中表达,并且无组织特异性 。 因此,它们成为早期构建嵌合基因的启动子,其中以 Nos启动子 （ pNos） 最常用 。1．启动子及其它调控序列近年来的研究发现,来自花椰菜花叶病毒 DNA的 CaMV的 35s启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达,并表现出强烈的表达功能 。 由CaMV35s启动子,外源结构基因及 Nos3′端的非编码区域组成的嵌合基因,能在植物细胞中很快高效表达 。 CaMV35s启动子既无组织特异性,又不受发育时期的影响,是一个理想的植物基因工程的启动子 。 另外,近年来也发现,19s启动子亦能使嵌合基因在植物细胞中表达 。 近年来,从植物基因中分离出组织特异表达启动子及诱导表达启动子,为实现外源基因的定时,定位高效表达奠定了基础 。2.嵌合基因（ chimeric gene）构建所谓嵌合基因就是来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因,终止子连接在一起构成基因 。3 中间表达载体的构建过程中间表达载体是由中间载体加上能在植物细胞中表达的启动子及基因构成,也就是嵌合基因插入中间载体后构成,所以中间载体的构建是一个十分复杂的过程 。 下面以 pLGV2381为例简要地说明其构建过程 。 （ 见图 8-1）四、植物基因转化载体系统的构建上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外源基因转化的载体,因为中间表达载体仍是一种细菌的质粒,不能把外源基因转化到植物细胞 。 因此,必须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti质粒中,并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体,才能应用于植物基因的转化 。 它是由两种以上质粒构成的复合型载体,故称之为载体系统 。 近年来的研究已经建立许多种载体系统,但目前主要采用两种 Ti质粒基因转化载体系统,即一元载体系统和双元载体系统 。1．一元载体系统的构建这一类载体是中间表达载体与改造后的受体 Ti质粒之间,通过同源重组所产生的一种复合型载体,通常亦称为共整合载体 （ co-intergrated vecter）,又由于该载体的 T-DNA区与 Ti质粒 Vir区连锁,因此又称之为顺式载体 （ cis-vector） 。一元载体的特点是,① 由两个质粒（ E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；②共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；③必须用 Southern杂交或 PCR对大的共整合体质粒进行检测；④构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体和拼接未端载体（ split-end vector,SEV）。（ 1）共整合载体的构建共整合载体的特点是：①中间表达载体与受体 Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；②中间表达载体与受体 Ti质粒之间同源序列是 pBR322。共整合载体的构建过程l） 中间载体 pLGV1103导入农杆菌,目前通常 采 用 两 种 方 法,即 接 合 转 移 法（ conjugative transfer） 和三亲杂交转移法 。2） 中间载体与受体 Ti质粒的同源重组 。3） 共整合载体的选择 。（ 2） SEV的构建SEV系统即 T-DNA边界拼接系统,亦称拼接末端载体 （ sp1it-endvecter,SEV） 。 它是由 Freley等人于 1985年建立的另一种共整合载体,也因为它的两个 LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名 。 SEV与 pGV3850的差异及构建过程如下述：1） SEV的受体 Ti质粒的 T-DNA上的致瘤基因 （ onc） 及 TR都已被缺失,T-DNA的保留部分被称为,左边界内部同源区,（ 1eftinside homcology,LIH） 。 该受体 Ti质粒还保留了 Vir基因及其它正常的功能基因,同时还携有用于细菌筛选的抗性基因 。2） SEV中间载体具有一个细菌的抗性基因,一个植物抗性基因及与受体 Ti质粒同源的 LIH序列及 TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有 LIH同源序列，即可发生同源重组，形成 SEV的共整合载体。（ 3） SEV与 pGV3850比较两者都是通过受体 Ti质粒与中间载体同源重组而形成,故同属于共整合的一元载体系统,但它们之间有着一定的差异：1） 它们的受体 Ti质粒与中间载体的结构不同 。 pGV3850的左右边界在一个受体 Ti质粒上,而 SEV来自二个质粒,即 TR来自中间载体 。,2） 同源序列不同 。 pGV3850重组的同源序列是 pBR322，而 SEV是 LIH。3） SEV是更有效的共整合载体 。 由于 pGV3850共整合载体,带有大肠杆菌 pBR322序列,外源基因嵌合在该序列中,因而转化的植物中也带有重复的 pBR322序列 。 此重复序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响,而SEV系统则排除了这种可能 。2．双元载体系统双元载体 （ binary vecter） 系统是指由两个分别含 T-DNA和 Vir区的相容性突变 Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与 Vir基因在两个独立的质粒上,通过反式激活 T-DNA转移,故称之为反式载体 （ trans vecter）,（ 1）双元载体系统的构建原理双元载体主要包括两个 Ti质粒，即微型 Ti质粒和辅助 Ti质粒。Ti质粒上的 Vir基因与 T-DNA具有反式互补作用,Vir基因可以反式激活 T-DNA的转移 。 其次,中间载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点 （ oriV）,而代替了共整合载体中用以重组的同源区,能够在任何农杆菌寄主里自发复制 。（ 2）微型 Ti质粒（ mini-Ti plasmid）双元载体系统是在微型 Ti质粒基础上产生的 。 所谓微型质粒就是含有 T-DNA边界,缺失 vir基因的 Ti质粒 。 Mini-Ti是一个广谱质粒,除含有 T-DNA（ 左,右边界 ） 外,还具有广谱质粒的复制位点 oriV及选择标记基因 。Bevan等 （ 1984） 构建的 pBinl9微型质粒 （ 图 822）是应用得最广泛的 Mini-Ti。 它含有来自 pTiT37的 T-DNA左右边界序列,在两个边界序列之间的 T-DNA区含有植物选择标记 NptII基因,以及来自噬菌体 M13mpl9的多种酶连接接头的 LacZ基因 。 在 LacZ基因内部含有多克隆位点,外源基因可以便利地插入其间使其本身失活 。 此外,Binl9含有广宿主质粒 Rk2的复制和转移的起始位点 。（ 3）辅助 Ti质粒含有 Vir区段的 Ti质粒称为辅助 Ti质粒 （ he1per Ti） 。实际上辅助 Ti质粒是 T-DNA缺失的突变型 Ti质粒,完全丧失了致瘤功能,因此是相当于在共整合载体系统中的卸甲Ti质粒 （ disarmed Ti） 。 其主要作用是提供 Vir基因功能,激活处于反式位置上的 T-DNA转移,该卸甲载体在此又称之为辅助 Ti质粒 （ he1per Ti） 。最常用的辅助 Ti质粒是根癌农杆菌 LBA4404所含有的 Ti质粒 pAL4404。其为章鱼碱型 Ti质粒 pTiAch5的衍生质粒，其 T-DNA区已发生缺失突变，但仍保存有完整的 Vir基因功能。近年来的研究表明，野生型的 Ti质粒即不卸甲的 Ti质粒，同样可以作为辅助 Ti质粒，而且具有更强毒性。（ 4）双元载体的构建将 Mini Ti质粒转入含有 He1per Ti质粒根癌农杆菌的途径有两条,一条是直接用纯化的Mini Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条是与共整合载体构建一样,采用三亲接合的方式 。 Mini Ti质粒均能以 E.coli的 pRK2013为辅助质粒,通过三亲杂交而接合转移到含有辅助 Ti质粒的农杆菌细胞内 。 由于 E.coli的pRK2013不能在农杆菌中复制最后消失,含有Mini Ti质粒和 He1per Ti质粒的根癌农杆菌可直接用于植物细胞的转化 。（ 5）一元载体系统和双元载体系统的比较综上所述,双元载体系统与一元载体系统之间有着较大的差异：1）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。2） Mini-Ti质粒具有 E.coli质粒的复制位点、能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加 10～ 100倍，而且Mini-Ti质粒分子量小（ 10kb），可以直接进行体外遗传操作。3）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操作步骤比较简单。。4）由于 mini-Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，而且构建的频率较高。（ 5）一元载体系统和双元载体系统的比较5） 由于根癌农杆菌感染的寄主范围是由 Vir基因及染色体上的基因决定的,因此,使用双元载体系统更便于根据转化材料的来源不同选择适宜的 He1per系统 。6） 双元载体在外源 DNA转入植物细胞前,无需进行同源重组,插入载体的外源基因变异可能要比 pGV3850系统来得小 。7） 共整合载体系统比双元载体系统更难以应用,通常一个共整合载体在用于植物转化之前,应弄清 Ti质粒的拷贝数和大小,所以必须通过 southern杂交来鉴定 。8) 共整合载体的重组频率很低,而双元载体系统的两个质粒接合的频率较高,一般至少高 4倍,因此双元载体的构建频率较高 。9） 共整合载体构建成功后,工程菌的稳定性较好,双元载体稳定性较差,容易丢失 。10） 双元载体在外源基因的植物转化中效率高于共整合载体 。3．载体卡盒当一个动植物的外源基因插入转录载体后实现表达的水平高低十分重要，高效表达系统的建立在基因工程中非常有用。所以科学家们不断地构建一些复杂的载体来提供全部必须的表达信号。最近几年来，更先进的一代表达载体已得到发展。这些载体以卡盒形式提供基因表达所需的全部信号，包括启动子、终止子、增强子等。然后新的外源基因被插入到表达信号簇中间的唯一限制性切点，所以称之为盒式载体。在植物基因转化载体构建中同样采用了上述原理构建成载体卡盒。所谓载体卡盒 (vectercassette)（图 8-23）是将植物标记基因、多克隆位点、细菌标记基因和广谱质粒的复制和动员功能均集于一身的集装箱似的载体系统。利用载体卡盒可以更便利地构建基因转化载体。五、载体构建中常用的选择标记及报告基因如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。科学家家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。（不论是选择标记基因还是筛选标记基因，后者亦称报告基因）都 必须具备以下四个条件：①编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；②基因较小，可构成嵌合基因；③能在转化体中得到充分表达；④检测容易，并且能定量分析。 选择标记基因和筛选标记基因除具有上述共同之处外，它们在功能和性质上还有一定差异。选择标记基因的功能主要是该基因的产物给予植物细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如,Cat（氯霉抗性基因）。筛选标记基因强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。1．选择标记的应用选择标记的功能是在选择压力下把转化体选择出来 。 为达到这一目的,首先要在选择培养基中加入选择剂,产生一种选择压力,致使未转化细胞不能生长,发育 。 其次是选择标记基因的产物对选择剂产生抗性,致使转化细胞不受选择剂的影响,能正常生长,发育,分化,从而把转化体选择出来 。近年来已研究出较多的选择标记基因 。在选择标记的使用中值得注意的是标记基因的正确选择 。 没有一种标记在所有的植物全都行之有效；不同的标记基因对转化细胞的生长发育及转化率有着明显的影响；即使是同一种标记基因,在不同的选择抑制剂压力下也是不同的；不同的植物种类对选择系统的敏感性程度差异很大 。 因此,当试图转化一种新的植物时,设计许多种可替代的选择标记是有利的 。 选择系统必须突出对相关植物组织的约束性选择压力,要随选择的靶外植体或组织而异 。2．报告基困的应用在理想状态下，所有的在含有选择剂培养条件下再生的植株都是被转化体。不幸的是事情并非尽如人愿。由于种种原因，例如生理抗性的产生，选择与植物种类的敏感性，无性系的变异性，甚至“逃避者”或漏洞的出现等，都会产生非转化植株的再生。因此，对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞都要进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体。这是筛选标记基因的第一个作用。筛选标记基因的第二个功能是在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达，因此起到报告的作用，故亦称之为报告基因（ report gene）。第三功能是被用于启动子表达特性的评估和亚细胞区问的研究分析等。目前作为筛选标记的基因1） 冠瘿碱 opine基因至今广泛用于转化载体作为筛选标记之一是合成冠瘿碱基因。各种农杆菌菌株在它们的 T-DNA基因组中包含有合成植物细胞中不存在的单一氨基酸衍生物的基因。两种基因 Nos和 Ocs已被并入到许多植物转化载体中。这些基因不在细菌中表达，故它们在植物组织中的出现，通常是转化已发生的很好证据。而且冠瘿碱的检测和分析非常快、简单和廉价。值得警惕的是受伤的植物组织有时能产生冠瘿碱，所以可以检测到该化合物，即所谓本底。因此作对照样的分析是重要的。2） Gus基因 （ β-葡糖苷酸酶基因 ）Gus基因来自大肠杆菌染色体上的 uidA位点。它在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点：①在一定条件下与 X-G1ucuionic acid（ 5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。②当加入 4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成 4-甲基伞形酮，发荧光（ λ=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。③检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。④比 Cat和 NptII检测便宜 2000倍，而且还不需要使用放射性同位素。3） Cat（ 氯霉素乙酰移酶基因 ）Cat也是应用得较多的一种报告基因 。 它来自细菌转座子 Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因 。 Nos-Cat嵌合基因一旦在植物细胞中得到表达,即可敏感地检测这种酶的存在 。 它可以利用荧光光谱法测定,但由于植物内源活性本底较高限制了它的灵敏度 。 Cat酶的活力是通过薄层层析法和放射自显影法测定,操作比较繁琐 。 一般情况下,Cat表达产物没有 Gus基因稳定,而且在测定时花费较大,所以现在使用中逐渐减少,被 Gus基因代替 。4） GFP（绿色荧光蛋白基因）3．选择标记和报告基因的选择策略上述选择标记和筛选标记的基因产物,按其性质特点可分为三大类型：抗生素类标记,生化类标记及荧光素类标记 。 这些标记基因必须正确使用,总体来说要注意以下几个原则：（ 1） 不同的植物种类对选择系统的敏感程度差异极大；例如,Km抗性已在许多植物中被成功地用作可选择的标记,但有时对其他植物则无效 。 其无效的原因有两个方面：一方面由于产生对该化合物的高水平的耐受性；另一方面是在植物组织上形成枯斑病而坏死 。（ 2） 标记基因化合物的有效作用可能随被选择的靶外植体或组织而异,例如分化水平,外植体的类型 （ 原生质体,单细胞,细胞群体,胚状体,愈伤组织,离体的根,茎,叶 ）,大小等都会影响任何一个标记基因的使用 。（ 3） 在众多的选择标记中,Km抗性基因已证明是一个很有用的转化选择标记 。欢迎大家多提问题
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