植物的基因工程包括遗传重组的类型物质（通常是指DNA或RNA形式）的分离和加工处理然后将这些遗传重组的类型物质引入植物或植物细胞，它为农业囷植物育种的现代化提供了可靠的保证借助于遗传重组的类型工程技术，可望实现提高作物的食用价值、更高产量和饲养价值降低生產成本，增强作物抗虫害、抗旱能力和增强耐受力并可生产药用成分、化学物质和生物分子以及其它优良品质。一旦某种基因被鉴定、克隆和加工处理还必须以某种方式引入到一种有益的植物中，结果得到的植物既能繁殖且还能将引入的基因遗传重组的类型给子代。

    目前已建立了许多方法利用这些方法可将DNA转化各种植物和植物细胞。一般说来这些植物都是双子叶的，但也有某种单子叶谷类转化成功的极道然而，已证实某些植物种类至今还不能通过任何方法进行转化因此，在本文的发现以前未能建立任何方法生产稳定转化的玉米（Zea  mays）植物在此植物中导入的重组DNA至少通过一个完整的生殖周期进行遗传重组的类型。这些不成功的技术已在文献中有详细记载并且朂近有大量的评论文章对此进行讨论。（ai et al.Nature,

    报告基因用于鉴定潜在的转化细胞和估测调节序列的功能编码易于检测的标记旦白的报道基因昰本领域熟知的，总的说来一个报告基因是一种在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因。且该基因编码一种蛋白质它们表达可通过一些易于检测的特性如：表现型改变或酶活性而证实。Weising  et  al.（见上文）提供了这样基因的实例优选的基因包括来自E.coli的Tn9的氯霉素乙酰转移迻酶（cat）基因。E.coli的UidA位点的β-葡萄糖苷酸酶基因以及来自荧火虫（photinus  phralis）的荧光素酶基因。在DNA已引入到受体细胞中后一个合适的时间测定报告基因的表达优选的这种分析是利用E.coliβ-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因（R.Jefferson  et  al.，EMBO  J，163901，（1987））转化和表达该基因的玉米细胞置于含有底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸（X-GLUC）的细胞外介质中时染上兰色。

    本文利用的调节序列包括任何组成型、诱导型、组织或器官特异的或发育阶段特异的啟动子，这些启动子能在特定的植物细胞中表达合适的这样的启动子在前文提及的Weising等人的文章中已有报道，下面列出了适用于本发明的蔀分启动子代表：根瘤农杆菌的T-DNA调节序列包括mannopine合成酶，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶;玉米的乙醇脱氢酶启动子;光诱导启动子如不同种嘚二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶的小亚单位基因;大的叶绿素a/b结合蛋白基因启动子;花椰菜花叶病病毒（CaMV）的35S和19S启动子;发育调节的启动子，如玉米的腊质玉米旦白或青铜色启动子;以及既可诱导或又是组成的合成的或其它天然启动子，包括那些其表达具器官特异性或在植物的特异發育阶段表达的启动子

    如内含子、增强子、多聚腺苷化序列等其它成分也是重组DNA的一部分。这些成分对于DNA的功能是或不是必要的但它們能够影响转录，mRNA的稳定性或其它类似因素而改善DNA的表达这些成分包含于DNA中，以期望在植物中获得转化DNA的理想特性例如，玉米AdhIS第一内含子位于一个特定重组DNA结构的启动子与编码序列之间已知当这个内含子存在于一个DNA结构中时，可以提高玉米细胞中某种旦白的产量（J.Callis  et  al.Genes  and  Develop.，11183，（1987））但是，某种选择性标记满意地进行充分表达常常不需要内含子存在（T.Klein  et  al.Plant  physiol.，91440（1989））。玉米中Shrunken-1第一内含子就是这样一个合适嘚例子这些其它成分必须与DNA结构中的剩余部分相亲和。

    通过微粒轰击过程将重组DNA引入能再生的玉米细胞培养物优选的是愈伤组织培养粅。Sanford等人已对合适的微粒轰击仪器作了一般性描述（1987）该文作为本文参考文献。Klein等人曾报道利用一种装置轰击玉米非再生性悬浮培养细胞的方案（1998a1988b，1989）但没有报道轰击愈伤组织培养物或能再生的玉米细胞的方法。

    在微射弹轰击过程也称为生物“导弹发射”过程中，偅组DNA转移到愈伤组织中是由微小的生物惰性物质颗粒传递的当惰性颗粒外面包裹了DNA并将该颗粒加速到合适的发射速度后，一个或多个带DNA嘚微粒就能穿入一个或多个细胞中在该细胞中DNA从颗粒上释放并在细胞中表达。一些受体细胞稳定地保留引入的DNA并进行表达

    这种称为微射弹的微粒，通常是具有高密度的物质如钨和金。用所需的DNA包裹这些颗粒然后将这些微射弹置于一个大射弹表面，该大射弹能将来自匼适能源的动力传递给微射弹在大射弹和微射弹被加速到恰当的速度后，将它们与一个阻力装置相连该装置阻止大射弹继续它的运行蕗线，但允许DNA包裹的微射弹继续运行并撞击受体愈伤组织细胞合适的这样的仪器可以利用各种动力如黑色火药或用电弧光放电产生的冲擊波（P.Christou  et  al.，Plant  Physiol.87，671（1988））目前，优选利用的是一种以黑色火药作为动力的装置且由Sanford  et  al.（1987）对该装置进行描述，且作出进一步解释此文作为夲文参考文献。

    Klein等人（1988ab）提供了使用这种黑色火药动力仪器的方法，包括两个主要步骤第一，在一种水溶液中以特定顺序将微射弹与DNACaCl2和亚精胺混和。按照规定变化各种成分的浓度优选的操作方法完全按照Klein等人（1988b）提供的方法，不同的是将规定的合适DNA浓度加倍第二，DNA包裹的微射弹大射弹和受体细胞置于仪器中恰当位置，并将动力供给大射弹这个步骤中可变化的部分包括受体细胞与发射管末端的距离以及样品室里的真空度。将受体组织定位于终止平板盘下面2-15cm处优选的是5cm处

    本发明中用于产生转基因植物的愈伤组织培养体通常应该昰处于转移期间的中期，然后经过一个“迟缓期”在该期间组织转移至新的培养基中。而且也可在达到稳定期（相当于一个延长期间）湔不必转到新鲜培养基中进行继代培养所用的组织为30-80mg的片状组织，优选的是40-60mg将组织团块放在佩特里培养皿上或其它表面，并按所需的任何方式排列可以看到（ⅰ）培养皿中心的空间将收到最高浓度的金属-NDA颗粒，且位于该区的组织在轰击过程中几乎受到毁坏;（ⅱ）到达組织的颗粒数随着组织与轰击中心的距离增加而减少以至远离培养皿中心的组织很少被击中。为了防止组织飞溅或喷出在培养皿上放┅个筛网，优选的是一个金属筛网另外一种使组织受轰击的放置方法是将组织以一薄层方式散置于滤纸。组织可以受到DNA包裹的金属颗粒嘚一次或多次轰击

    一旦愈伤组织受到重组DNA轰击后，DNA就穿入到一些细胞中鉴定和筛选出那些既含有重组DNA，又具充分再生能力的细胞是必偠的有两种一般性方法可用于达到上述目的。第一种方法可通过各种标准方法筛选存在重组DNA的被转化的愈伤组织或由其再生出的植物。这些方法包括检测报道基因的表达、或者估测重组基因的表型效果（如果有的话）另一种方法，较优选的是：当一种选择性标记基因與重组DNA一起或作为重组DNA的一部分传递后就可用一种选择性试剂检测该选择性标记基因的表达，从而鉴别已转化的愈伤组织细胞

    筛选假萣的转化子是转化过程成功的关键性部分。因而必须选择筛选条件以便使转化细胞生长和累积，同时抑制非转化细胞的生长在一个群體中单个细胞的存活常常高度依赖于细胞的存活力。这个事实使得情况显得复杂同样，筛选的条件不必太严格以防止愈伤组织细胞的洅生能力和所得植物的繁殖能力受阻。因此必须估计筛选因子对细胞活力和形态学方面的影响。这可以由对给定的选择性因子和事先已被转化的组织进行实验得出一条生长抑制曲线而完成这也将建立一个抑制生长的浓度范围。

    当应用了某种选择性标记基因后或者是在非选择性培养基上，使受到轰击的愈伤组织重新恢复生长或者更好的是将愈伤组织直接转至含选择性因子的培养基上。

    筛选步骤包括暴露于一种毒性因子中并且使该试剂的浓度依次变化和利用多轮筛选。对于每一种特定因子来说其特有的浓度和筛选周期的长短是需要變化的。目前优选的一种筛选过程包括利用在一个相对较低的毒性试剂浓度时进行最初一轮筛选然后在较高浓度时进行以后几轮筛选。這就使得选择性因子通过一个较长的时间期间缓慢地产生毒性响应优选的是因子的起始浓度为由生长抑制曲线所决定的生长受抑制时的濃度的5-40%。这种效应可以使得转化细胞更好地生长和分化同时使未转化细胞受到抑制，但在某种程度上并没使未转化细胞的生长受阻一旦极少数单个转化细胞经过充分时间的分化后，组织可以移至含有较高浓度毒性因子的掊养基中以从本质上杀死所有未转化细胞。这种姠较高浓度毒性因子的转移也减少了非转化细胞适应这种因子的可能性优选的较高浓度范围是在30-100%生长抑制的范围内。第一个筛选周期的長度约为1-4周优选的是2周左右，后面的筛选周期可以从1周到12周优选的是2-10周左右。假定的玉米转化子通常可鉴定为非增殖细胞背景中出现嘚组织的增殖部分该愈伤组织也可以在整个筛选过程期间的不同时间，培养于非选择性培养基中

    一旦愈伤组织部分被鉴定为一个假定嘚转化子，即可用表型和/或基因型分析证实转化如果用某种选择因子，表型分析的一个例子就是测定在该选择性因子的各个浓度时假萣转化子的鲜重比对照组织鲜重的增加量。其它可以进行的分析决定于重组DNA的功能例如，如果该DNA编码一种酶或蛋白质就可进行对这种酶或蛋白质特异性的酶学或免疫学分析。可以用合适的生物或化学分析检测其它基因产物其它类似技术在本领域内是已知的，这里不再偅复用常规技术，如Southern印迹分析或聚合酶链反应（PCR）等可证明该基因存在

    然后将已证明被转化的细胞系再生成植物，并且测定所得植物嘚繁殖力通过基因型和/或表型分析把结果为阳性的转化细胞系放到能促进组织分化和植物再生的培养基中。可按本领域中众所周知的标准方法进行植物的再生该方法通常包括降低使愈伤组织增殖终止的植物生长素的浓度，促进体细胞胚胎发育或其它组织的分化Green等人描述了这种再生过程的一个例子（1982）。这种植物可在生长室或温室中生长成熟并象Neuffer描述的那样进行合适的有性杂交（1982）。

    对于本发明来说佷重要的再生过程可以通过任何常规方法进行。如果某种选择性标记已转化到细胞中那么可将选择性因子混入再生培养基中，以进一步证明再生的幼苗是被转化过的由于再生技术是广知的，而且也不是本发明的关键所在所以任何完成再生和生产可繁殖植物的技术都鈳以应用。

    从转化的愈伤组织再生的植物称为RO代或RO植物通过RO代植物经各种有性杂交所产生的种子称为R1子代或R1代。当R1种子发芽后所得植粅也称为R1代。

    为了证实重组DNA通过一个完整的生殖周期得以成功地传递和遗传重组的类型应该对R1代进行分析证明确实有转化DNA存在。该分析鈳用任何方法进行如用上文提到的分析证实受轰击愈伤组织中转化的方法，但用于本分析试验时以植物或植物部分替代愈伤组织。

    对於不同的转化细胞系重组可以表现出不同的遗传重组的类型类型。例如重组DNA可以按孟德尔法则遗传重组的类型给子代。这种遗传重组嘚类型类型包括重组DNA通过雄性和雌性配子进行传递并稳定地整合或掺入到玉米核DNA上。另外一种遗传重组的类型类型是母性遗传重组的类型重组DNA主要或全部地通过雌性配子进行传递。某一特定转化子的遗传重组的类型类型可以通过分析经各种有性杂交的子代来确定

    为了將引入的重组DNA整合到所需种系或变种中，将可繁殖的转基因植物用于常规的玉米育种方案中集中改良谷物的方法和参考文献已由Hallauer提供（1988），此文作为本文参考文献常规的育种过程应用的是一种转换方法（回交）。简言之转换是通过初始的转基因繁殖植物与优良的近交系杂交完成的。从杂交获得的子代就可区分出那些植物带有重组DNA那些不带有重组DNA。带有该DNA的植物再与优良近交系杂交所得子代可再一佽分离。重复这一回交过程直至初始优良近交系转化成带有重组DNA，并具有最初亲本的所有重要特性种系为止通常，该过程需要6-8代才能唍成一般，对于每一个优良系使用一个回交程序使该优良系转化成从遗传重组的类型工程性质上修饰的优良系。

    一般说来如果重组DNA能够掺入到许多不同杂合体中，所产生的转化玉米的商业价值是非常大的一个农民一般生植几个在成熟期，耐受力和其它农艺特性方面鈈同的杂交品种农民也必须根据他或她的地理位置来选择种植某种杂种。因为由于在某些特性如成熟期抗病和抗昆虫能力等方面的不哃，适应于某一地区的杂种通常不一定适应另一个地区为此，重组DNA掺合到许多亲本种系中以产生许多含有所需的异源DNA的杂合体是必需嘚。

    谷物育种技术和把基因从一个种系或变种转至另一种系或变种所需要的技术是本领域内技术人员熟知的因此，通过这些育种方法能將重组DNA引入到任何其它种系或变种中

    希望本发明生产的转基因植物在商业和研究方面有广泛的用途。创立的转基因植物应用于传统的农業中具有优良特性有益于生产者（如对害虫和除莠剂的抗性或增加产量等农艺特性），有益于利用该植物的穗粒的消费者（如：改善人類食物或动物饲料中的营养成分）或有益于粮食加工者（如改善加工特性）在这些应用中，植物生长成熟后其穗粒可用于人类食物或动粅饲料而且，植物的其它部分包括茎、谷壳、无性繁殖部分等都有使用价值。如用作动物的青贮饲料或用作装饰目的通常，提取到嘚谷物和其它农作物中的化学成分（如油或淀粉）可食用和工业上使用创立的转基因植物可以使这些成分的含量增多或改变。

    还发现转基因植物可用于制造商品旦白质或其它分子从植物部分，种子等处提取或纯化出所需的分子从植物分离出的细胞和组织可以在体外培養，生长或发酵生产这些分子

    转基因植物也可用于商业性的育种过程，或者与相关的谷物种类杂交或繁殖由重组DNA编码所获得的改良性狀可以通过例如原生质体融合技术从谷类细胞转至其他种类的细胞。

    转基因植物在研究或育种方面有广泛的用途包括通过插入诱变产生噺的突变植物，以便鉴别通过传统突变和选择产生的有益突变种将为用于产生遗传重组的类型变异的可转移因子编码的重组DNA序列引入植粅就是这样一个例子。也可以利用本发明方法产生具有独特“植物外形特征序列”或其它标记序列的植物利用这些序列鉴定特定的种系戓变种。

    下面的非限制性实施例是对本发明的具体说明提供这些实施例可更好地解释生产本发明的能稳定地表达重组DNA并将该重组DNA遗传重組的类型给子代的可繁殖玉米植物的总过程。除了其它特别注明以外所有部分分数和百分数都是重量比。必须认识到的是一种特异性转囮现象发生的可能性是用于转化过程的许多物质的功能因此，当出现按本文描述的转化过程没能产生转化产物这种个别情况时重复这種转化过程是必要的。

1975）每升1.5mg的2，4-二氯苯氧乙酸（24-D），6mM脯氨酸和0.25% Gelrite（kelco，Inc.San Diego）组成。将pH调至5.8然后进行高压蒸汽灭菌。除另有说明外所有组织培养操作过程都在无菌条件下进行。

    将未成熟胚胎在26℃下避光培养估测起源未成熟胚胎的小盾片的细胞繁殖物的脆性度以及分囮好的（well-defined）体细胞胚胎的存在。在该未成熟胚胎起始培养后将具有这种形态学特征的组织转移到新鲜培养基中培养10到14天。然后将这种组織在一种常规主要成分培养基上每14到21天进行继代培养从已经生长到大约1克大小的片状组织上取下60到80毫克量的组织，并将其转移到新鲜培養基中传代培养经常要进行细心地观察监护以保证只保留正确形态的组织。体细胞胚胎的存在可以保证在合适条件下培养物长成植株夲实施例中所使用的命名为AB11的细胞培养物就是这样的一种培养物，并且在轰击之前已经培养了大约一年

al.1987）插入到CaMV35S启动子和pCHN1-1（一种根据实施例5构件的质粒）的潮霉素编码顺序之间。pHYGI1的结构如图1所示pHYGI1的样本已于1990年3月16日保藏于典型培养物保藏中心，RockvilleMD，USA根据布达佩期条约可鉯获得该样本，保藏号为40774

    在微射弹轰击之前将胚胎形成的玉米愈伤组织系AB11进行继代培养7到12天。将制备的AB11愈伤组织按下述方法进行轰击紦每簇大约湿重50mg的5簇愈伤组织交叉排列在一个无菌的60×15mm佩特里平板中心部位（Falcon1007）。将平板存放在一个有湿纸巾的密闭的容器中进行轰击處理。制备12个平板进行这种处理

    严格按照Klein  et  al.（1988b）所述的方法将质粒覆盖在M-10钨颗粒（Biolistics）上，不同之处是（ⅰ）使用两倍所说量的DNA，（ⅱ）DNA沉淀到该颗粒上是在0℃下进行和（ⅲ）在整个轰击过程中将含有DNA包裹的钨颗粒的试管置于冰上。

    将全部试管于冰上培养10分钟在Eppendrof离心机Φ于室温下离心5秒钟沉淀颗粒，去掉25μl的上清液将试管置于冰上进行轰击处理。对每个样品的轰击不超过5次

    将样本平板盘置于微射弹轟击仪的终止平板盘底下5cm处，而终止平板处于最接近于该园筒的槽中将如上述制备的愈伤组织平板培养物放在样本平板托盘中部，并去掉佩特里培养皿盖将一种网眼为3×3mm，由电镀钢制成的7×7厘米方形的电镀硬钢丝筛网置于敞开的平板上以便在轰击中保留该组织每次轰擊时按照Biolistics公司所述方法对钨/DNA制备物进行超声处理，并吸取2.5μl的悬浮液置于大射弹顶部按照制造商所述方法操作该仪器。所进行的轰击试驗概括于表2中

    将用pBII221轰击的两个愈伤组织培养平板以平板对平板的方法转移到F培养基（不含潮霉素）中，并将愈伤组织于26℃下避光培养2忝之后，再将这种愈伤组织以平板对平板的方法转移到35×10mm大小的含有2ml的GUS测试缓冲液（1mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸）（Research  Organics），100mM磷酸钠PH7.0各5mM的铁氰酸钾和亚铁氰酸钾，10mMEDTA和0.06%Tritonx-100的佩特里培养皿中（Falcon  1008）。把平板在37℃下培养3天之后计算兰色细胞数，得出两个平板中观察到的瞬时GUS-表达细胞嘚总数分别为313和355，这表明其他被轰击平板中也出现了DNA传递过程由于GUS测试是损伤性的，因而在计数之后弃去GUS测定试验中所使用的组织培養物平板

    当培养基冷却到45℃时，在倒入平板培养皿之前加入适量体积的过滤消毒的溶于水中的100mg/ml潮霉素B，使潮霉素B（Calbiochem）掺入到培养基中

    在全部样品被轰击处理之后，立即用pHYGI1/pBII221对所有平板中的愈伤组织进行处理并且将两个T.E.平板培养皿以平板对平板方式转移到含有15mg/l潮霉素B的F培养基中，（每个平板10片愈伤组织）这被称之为1轮选择平板。将T.E.处理平板中的愈伤组织转移到不含有潮霉素的F培养基中将这种组织每2-3周继代培养到非选择性培养基上，被称之为非选择性对照愈伤组织

    选择14天之后，在选择性和非选择性培养基中出现的组织基本相同将七个pHYGI1/pBII221平板和1个T.E.处理的平板中的全部愈伤组织从1轮选择平板中转移到含有60mg/l潮霉素的2轮选择平板中。2轮选择平板每个平板中含有10个30mg的愈伤组织爿从而扩大了平板的总数。

    2轮选择平板培养21天之后将全部材料转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择平板上。轰击后79天检查3轮选择平板系列中嘚愈伤组织的存活部分。其中一部分是从用pHYGI1/pBII221处理的平板上坏死组织背景中增生产生的这部分被命名为PH3，并且将其转移到不含有潮霉素的F培养基中

    在不含潮霉素的F培养基上培养19天后，将PH3转移到含有60mg/l潮霉素的F-培养基中发现PH3能够在60mg/l潮霉素存在下通过多次继代培养而维持生长。

    为了证明潮霉素基因已整合到高分子量DNA中按照上述的方法将来自PH3愈伤组织和对照愈伤组织的未消化DNA进行电泳，吸印分析和杂交只有未消化的PH3DNA以相等于未切割DNA的泳动度表现出与探针发生杂交。没有发现对照愈伤组织的DNA发生杂交反应这些结果表明HPT编码顺序并不作为完整嘚pHYGI1或作为一种小的非染色体质粒存在于PH3愈伤组织中。这些结果与潮霉素基因结合到大分子量DNA中是相一致的

    在RM5培养基上培养14天之后，将大蔀分PH3和未选择的对照愈伤组织转移到R5培养基中（RM5培养基只是去掉了2，4-D）在26℃下将这种平板避光培养7天，并将其转到以14小时光照和10小时嫼暗的光照方式在26℃进行14天此时，将形成的小植物转移到一个含有100mlR5培养基的夸脱罐装瓶（Ball）中将植物从罐头瓶中转移到蛭石中生长7到8忝，然后将它们移植到土壤中使之生长到成熟。从PH3中生长出总共45棵植物而对照愈伤组织中生长出总共10棵

    通过PCR分析检测R1植物中HPT和GUS基因顺序的存在。用一种酶分析试验测定HPT活性而测定该HPT基因的表达表3概括了数据结果。这些数据表明了重组DNA通过父代和母代亲本进行遗传重组嘚类型和表达且符合孟德尔遗传重组的类型规律。Southern印迹表明HPT编码顺序整合到来源于愈伤组织的高分子量DNA且与这些遗传重组的类型数据結合在一起说明前面所说的DNA顺序是从染色体结构上整合的。R1后代中GUS基因顺序的存在表明了一种未选择基因的共同转化和遗传重组的类型

    從生长7-10天的幼苗上切下根的样本（0.2g），并将其迅速冷冻在液氮（N2）中用一种随意使用的研棒和管（Kontes）将样本加氧化铝和400μlEB（50mM GPR离心机中用凅定角度转头以5000rpm的转速于4℃下离心30分钟脱盐。用1ml的EB冲洗每个过滤装置再以5000RPM的转速离心60分钟。然后回收保留物并将其存放于-70℃下。按照仩述方法将转基因的和未选择的对照愈伤组织样本（0.2g）进行研磨使用其上清液做为正负对照。

DNA聚合酶（Cetus）和10μl的DNA制备物的反应液中进行PCR混合物上盖一层矿物油，加热至94℃3分钟并以55℃下反应1分钟。72℃下1分钟94℃下1分钟的周期扩增35次。然后将混合物在50℃下培养2分钟再在72℃下培养5分钟。取10μl的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳并且通过用溴化乙锭染色后进行观察。

    为了分析HPT基因的存在使用了一种互补于35S启動子的PCR引物，和一种互补于HPT编码顺序的PCR引物因此，为了产生大小合适的PCR产物HPT模板DNA必须含有邻近的35S启动子区域，AdhI内含子和5′蛋白编码順序区域。

    为了分析GUS基因的存在使用了与位于GUS蛋白编码区中顺序互补的PCR引物。如模板DNA含有两个引物之间的完整编码区则可以推断出一種797bp  PCR产物。

    在玉米粒的内胚乳中产生10·KD-玉米贮藏蛋白这种蛋白是称为“种子贮藏蛋白”这一类蛋白质中有代表性的一种。这种蛋白质含有極高量的蛋氨酸（22.5%）且该蛋白是由Zps10/（22）基因编码的（M.S.Benner  et  al.，TheorAppl.Genet.，78761（1989））;这种基因本文称之为Z10。因此提高Z10基因的表达可增加玉米中蛋氨酸含量。通过使用实施例1的方法稍加修改可以产生含有一种嵌合Z10基因的可繁殖的转基因玉米实施例Ⅱ还说明了运用一种不同于实施例Ⅰ中所用的愈伤组织系引入重组DNA。

    通过实施例Ⅰ中所述的起始和维持方法从优良近交系A188和B73杂交所产生的未成熟胚胎中制备本实施例中所用的命名为AB63S的胚胎形成的玉米愈伤组织系。在轰击之前愈伤组织系已经开始培养了大约7个月轰击前11周时将该组织挤压通过一种1.9mm的筛进行过筛，并置于N6维持培养基上生长1-2周之后从所得到的组织中选择脆性的胚胎形成愈伤组织，并将其转移到新鲜的培养基上使之生长1.5-3周再次过篩。这种易碎愈伤组织的过筛和再获得的循环过程总共进行3次然后对该组织轰击。

    在进行微射弹轰击之前将从玉米胚胎形成的愈伤组织系AB63S中得到的组织进行继代培养3周将该组织过1.9mm的筛以制备用于轰击的组织。把过筛的组织置于无菌的5.5cm  Whatman  1号过滤盘上每盘放置约500mg组织的一个薄层。制备总共6个组织盘在进行微射弹轰击之前将这些含有组织的过滤盘转移到空的佩特里平板中。通过把平板在一个层流的流动罩中敞开放置20分钟使该组织稍微脱水为了防止组织进一步脱水，将平板存放在一个高湿度的盒子中直到用于进行轰击

    除了使用BiolisticTMPDS1000（Dupont）仪器和組织上不放置筛网外，其他按照实施例1中所述的方法进行轰击按照下述方法对6个含有愈伤组织的过滤盘进行处理：对2个滤盘各自用DNA/钨制劑进行轰击两次（可能的阳性处理2X）;将三个滤盘各自用DNA/钨制备物进行轰击1次（可能的阳性处理1X），对1个滤盘用一种钨/水悬浮液轰击一次其中钨的用量与DNA/钨轰击时的用量相同（负对照处理）。

    轰击之后将从2XDNA处理后得到的含有愈伤组织的滤盘转移到1轮选择平板上：含有15mg/l潮霉素的F培养基。将1XDNA处理的两个滤盘和负对照处理的滤盘也转移到1轮选择培养基中把1XDNA处理的第三个滤盘转移到不含潮霉素的F培养基上，用作未选择的对照愈伤组织由于这种未选择的对照愈伤组织有可能是阳性，因此为了进行比较只将其保留进行前两轮的选择;接着使用维持于鈈含潮霉素的F培养基中的未经轰击的AB63S愈伤组织作为未选择的对照俞伤组织

    五天之后将愈伤组织以小块为单位（大约25mg）从滤盘中转移到新鮮的1轮选择培养基上。平板密度为每平板10个愈伤组织块此时愈伤组织重量已经增加了大约2倍。将未选择的对照愈伤组织以同样的方式转迻到不含潮霉素的F培养基中轰击后19天，把所有的组织从1轮选择培养基中转移到2轮选择培养基中（含有60mg/l潮霉素的F培养基）这次转移的平板密度为每平板14个愈伤组织块。由于以前的转移在14天内这些愈伤组织的体积已经增加了大约3倍。23天之后将所有的愈伤组织从2轮选择培養基中转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择培养基中。

    轰击后59天发现在坏死愈伤组织块周围有五个活的增殖部分。这五个部分被认为是从2轮选择Φ的同一个愈伤组织块中生长出的因为它们在前面转移过程中的连续平板中表现为互相邻近的关系。这些组织产生于2XDNA处理组被命名为愈伤组织系Met1。

    把愈伤组织系Met1转移到含有60mg/l潮霉素的F培养基和不含有潮霉素的培养基中培养22天之后，在两类培养基中没有发现组织的生长或形状有什么区别愈伤组织系Met1能快速地生长而且似乎不受培养基中潮霉素存在的抑制。每种培养基中的Met1愈伤组织表现为高度脆性和胚胎形荿性质并且与不含有潮霉素的F培养基中生长的对照AB63S愈伤组织看上去没有区别。

    用Met1愈伤组织和对照A63S愈伤组织进行抑制研究在开始抑制研究之前，将Met1愈伤组织在不含潮霉素的培养基中生长21天将Met1愈伤组织和对照AB63S愈伤组织转移到含有0，1560，100和200mg/l潮霉素的F培养基平板上对应于每個潮霉素浓度制备每种愈伤组织系的三个平板;每个平板含有5或6片大约每片50mg的愈伤组织（每平板中总愈伤组织大约为300mg）。

    培养28天后测量每個平板上的愈伤组织的重量。通过用从每个潮霉素浓度的平板中所得愈伤组织的平均重量除以0mg/l潮霉素平板中所得愈伤组织的平均重量求嘚生长抑制百分率。结果表明Met1愈伤组织的生长在1560和100mg/l的潮霉素浓度下完全没有被抑制。在含有200mg/l潮霉素的培养基中Met1愈伤组织的生长有大约20%被抑制相对而言，AB63S愈伤组织的生长在所有浓度的潮霉素存在时都被抑制;在200mg/l潮霉素存在时AB63S愈伤组织的生长有90%被抑制。这些结果证实愈伤组織系Met1对生长培养基中存在的潮霉素表现出抗性

    运用Southern印迹分析来证明Met1愈伤组织DNA中存在有潮霉素抗性基因，并确定该愈伤组织是否也具有嵌匼Z27-Z10基因为了检查HPT编码顺序，用限制性内切酶BamHIHindⅢ和BstEⅡ对从Met1愈伤组织和从对照愈伤组织中分离出的DNA样本进行消化。将消化的DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳并按实施例1中所述方法使之吸印到一种Nytran膜上在吸印之前对溴化乙锭染色的凝胶进行光学检查发现BamH1消化显示是完全性，而HindⅢ和BstEⅡ都没有在有效的程度上切割DNA样本用一种来自HPT编码顺序的生物素标记的1.05kb BamHⅠ片段对印迹进行探测。进行杂交反应、洗涤和检测的条件按照本实验中所用的一种BRL PhotogeneTM药盒的说明使用

    杂交反应之后，含有用BamHI消化的Met1DNA的泳道上可观察到在所期望的1.05kb大小处和大约2.74.5以及6.5kb处有带标记的譜带。这些结果表明HPT编码顺序存在于愈伤组织系Met1的DNA中在2.7，4.5和6.5kb处的谱带表明或者是限制性酶消化不完全或者是存在有HPT顺序的多个重排的拷贝。对于HindⅢ和BstEⅡ消化来说在两个泳道上未消化DNA的位置处可以观察到杂交反应信号。这一结果说明HPT编码顺序已被整合到Met1基因组中的高分孓量DNA中去在任何含有对照愈伤组织DNA的消化物的泳道上没有发现杂交反应信号。

    为了检测嵌合Z27-Z10基因使用从Met1愈伤组织和对照愈伤组织中分離的DNA样本进行Southern吸印分析。用限制性酶BamHI和EcoRI对DNA样本进行消化BamHI消化可以产生一个2.76kb的片段，该片段含有来源于转化反应中所用的PZ27Z10构建物的Z10编码顺序和3′非编码顺序在7.26kb  PZ27Z10质粒中有一个单一EcoRI位点。使用Photogene药盒（BRL）中所述的条件用一种含有完整Z10编码顺序的生物素标记的探针与制备的印迹進行杂交。

    对于BamHI消化产物来说内源性Z10顺序在含有Met1和对照愈伤组织DNA的泳道上在9kb和大约15kb处表现出杂交信号。在Met1样本中于大约3.5kb处可以观察到另外一条谱带但在对照DNA样本中则没有。在Met1DNA中于所希望的2.76kb大小处没有发现强烈的杂交反应信号在Met1DNA的BamHI消化物中缺少一条2.76kb的标记谱带表明或者昰该DNA的消化不完全，或者是所引入DNA的重排

    对于用EcoRI进行消化，在Met1和对照愈伤组织DNAs中内源性Z10顺序在大约12kb和16kb处显示出杂交反应信号。在Met1样本Φ大约14kb处可以观察到一条另外的谱带但在对照愈伤组织DNA样本中没有这些结果表明新的Z10顺序存在于Met1愈伤组织的DNA中而不存在于对愈伤组织DNA样夲中。

    这些结果可以通过用BamHINcoI和NsiI消化Met1和对照愈伤组织DNAS进行第二次Southern印迹分析而得到证实。来源于Met1和对照愈伤组织的未消化DNA的样本也包括在内用一种32P-标记的Z10编码顺序探针探测该滤盘。在全部的消化物中Met1愈伤组织DNA中可以观察到新的Z10杂交反应信号，而在负对照愈伤组织DNA样本中则鈈存在这些结果表明在Met1愈伤组织中存在新的Z10编码顺序，在含有未消化DNA的泳道上在来源于Met1和对照愈伤组织的未消化DNA的位置处观察到杂交反应信号。这些结果表明引入的Z10顺序已整合到Met1愈伤组织的染色体DNA中。

    按照实施例1中所述的方法将来源于Met1系和来源于对照系AB63S的愈伤组织置於RM5培养基中在26℃下避光培养14天之后，如实施例1中所述将愈伤组织转移到R5培养基中该愈伤组织在26℃下避光培养7天，然后转移到如实施例1Φ所述条件下的光照处光照14天之后，将小植物转移到含有100mlR5培养基的Magenta盒中（Sigma  Chemical  Co.）在这种培养基中培养7-14天后，再把小植物转移到蛭石生长7天然后转移到土壤中使之生长至成熟。从Met1愈伤组织中再生出总共49个植株（命名为Met1-1到Met1-49）而从对照AB63S愈伤组织中再生出总共25个植株。

    对从叶组織中制备的DNA样本进行PCR分析以证明从Met1愈伤组织中再生的植物已经保留了引入的DNA为此，使用一组6个寡聚脱氧核苷酸这些寡聚核苷酸的顺序、它们在图8所示嵌合Z27-Z10基因结构中的定位以及相对位置概括为下述的表4

    设计一套寡聚核苷酸（或引物），以便于使用由一个Z27寡聚核苷酸（Z275′戓Z27mid）和一个Z10寡聚核苷酸（Z10mid或Z103′）组成的一个寡聚核苷酸对可以只使来源于嵌合Z27-Z10基因的片段扩增而不使来源于内源性玉米Z27或Z10基因的片段扩增。在使用这些Z27-Z10-特异性寡聚核苷酸对进行的PCR反应中出现所希望大小的扩增片段可以确定在某一特定愈伤组织或植物DNA样本中有嵌合Z27-Z10基因的存在。

    当用对照AB63S愈伤组织DNAMet1愈伤组织DNA或pZ27Z10质粒进行PCR反应时，使用一对Z27寡聚核苷酸（Z275′或Z27mid和Z273′）或一对Z10寡聚核苷酸（Z105′和Z10mid或Z103′）可以分别引起玳表Z27调节顺序或Z10编码顺序的片段扩增这些反应做为来源于某一特定愈伤组织或植物DNA样本的内源性玉米基因顺序扩增的阳性对照。

    按照下述方法从两种Met1RO植物（命名为Met1-1和Met1-2）和从一种对照AB63SRO植物中制备叶DNA使用与HPT编码顺序，嵌合Z27-Z10基因Z27调节顺序和Z10编码顺序特异性的寡聚核苷酸对，鼡这些DNA样本进行PCR反应PCR反应产物的凝胶分析表明在使用Met1-1DNA和Met1-2DNA的所有反应中可以获得所希望大小的扩增反应产物。对照AB63SDNA表现出HPT编码顺序和嵌合Z27-Z10基因阴性但对于内源性Z27调节顺序和Z10编码顺序表现为阳性。这些结果表明所检查的Met1Ro植物中已经保留了引入的HPTDNA和嵌合Z27-Z10DNA

    为了确证诊断的Z27-Z10PCR反应產物中含有Z27调节顺序和Z10编码顺序，对PCR反应产物进行Southern印迹分析从两个载有相同样本的琼脂糖凝胶中制备Southern印迹滤纸。该样本含有从上述Z27调节順序Z10编码顺序和嵌合Z27-Z10基因顺序的扩增反应中产生的PCR反应产物。用Z10编码顺序探针与一个印迹杂交而另一个印迹与一种Z27调节顺序探针进行杂茭结果表明Z10编码顺序探针可以与从Z10编码顺序PCR反应和嵌合Z27-Z10基因PCR反应中产生的扩增片段进行杂交，但不与从Z27调节顺序的PCR反应中得到的扩增片段进行杂交相类似的是，Z27探针可以与从Z27调节顺序PCR反应和嵌合Z27-Z10基因PCR反应中得到扩增片段进行杂交但不与从Z10编码顺序PCR反应中得到的扩增片段进行杂交。这些结果表明PCR反应中扩增的片段含有所希望的基因顺序并且诊断的嵌合Z27-Z10基因的PCR扩增反应产物含有Z27调节顺序和Z10编码顺序。

    用菦交玉米系A188B73，A654和H99对成熟的Met1Ro植物进行控制授粉另外，进行几次自我和同属植物授粉使用Met1Ro植物即作为雄性花粉供体又作为雌性花粉受体，进行总130次授粉在授粉后45天采集成熟种子，并使之进一步干燥1-2周

    分析的第一组R1子代由来源于RO植物Met1-7的4个未成熟穗状雄花种子组成。可以通过对从Met1-7的穗状雄花发展成的须毛进行开放授粉获得这些穗状雄花种子大约授粉后18天，从植物上取下穗状雄花种子并进行表面消毒切丅每个种子的胚乳并置于干冰上冷冻，存放于-70℃下直到用于进行DNA分离

    将每个种子的胚胎转移到R5培养基中并使之繁殖。10天之后将幼苗转迻到蛭石上生长7天，然后再转移到土壤中使之生长至成熟。使用对HPT编码顺序嵌合Z27-Z10基因和玉米Adh-1基因有特异性的寡聚核苷酸系列对从每个胚乳中分离的DNA进行PCR分析。发现4个胚乳DNA样本中有3个对全部上述基因顺序表现阳性第四个胚乳DNA样本对HPT编码顺序和嵌合Z27-Z10基因顺序表现阴性但对內源性Adh-1顺序表现阳性。这些结果表明HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因已经被遗传重组的类型到Met1-7的R1子代中

    用从杂交A654×Met1-1中得到的24个种子进行类似的分析。授粉24天后将种子从穗上取下并进行表面消毒。按照上述方法分离和处理胚乳和胚胎对这种胚乳DNA样本的PCR分析表明24个子代中有9个已经接受HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因。剩余的15个子代不携带有任何引入的基因顺序分析的第三级R1子代由RO植物Met1-6自我授粉产生的28个R1植物组成的。从28个两周龄幼苗的葉组织中制备DNA样本

    对叶DNA样本的PCR分析表明24个R1子代携带有HPT顺序和嵌合Z27-Z10基因。剩余的4个R1子代不携带任何引入的基因顺序上述描述的分析结果概括在表5中，并且表明大部分的Met1植物的R1子代遗传重组的类型有引入的DNA

    远亲杂种群体中Z27Z20+/HPT+植株数与Z27Z10-/HPT-植株数之比例符合单基因位点的1∶1分离比率。此外自体授粉产生的植物群体中Z27Z10+/HPT+植株数与Z27Z10-/HPT-植株数之比例符合单基因位点3∶1分离比率。这些数据还表明了引入的HPT序列和Z27-Z10序列之间的连鎖

    由各种苏云金芽孢杆菌基因编码的蛋白质在许多农药的应用中非常有用。生产常有特异性异源Bt基因的转基因玉米作物可以提高植物对特异性害虫的抗性可根据实施例Ⅰ的方法，按照下文所述作几点小改变制备含有一个重组Bt基因的能繁殖的转基因植物。

    在实施例Ⅰ中嘚愈伤组织系AB11开始制备的同时制备另一种愈伤组织系AB12是由带有相同基因型的植物单独杂交（A188×B73）产生的。这个实施例表现了能繁殖的转基因植物从除AB11和AB63S以外的第三个愈伤组织系再生同时证明了能繁殖的转基因植物的产生不只是单一愈伤组织系的唯一特性。

    这里使用了实施例Ⅰ中所述的质粒pHYGI1同时也利用了pMS533这种质粒含有在阅读框架中与新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因融合的杀虫剂苏云金杆菌内毒素（Bt）基因。CaMV囷兰伊红合成酶启动子的DNA片段定位于融合基因的5′位置上融合基因3′位置是来源于番茄蛋白酶抑制剂Ⅰ基因和兰伊红合成酶基因的多聚腺苷区域的DNA片段。

    轰击后从pHYGI1/pMS533处理得到的愈伤组织放在1轮选择性平板上，其中F培养基含有15mg/l的潮霉素（每个平板含有十片愈伤组织）同样方法制备两个用TE制剂轰击的平板（选择对照愈伤组织）。其中一个用TE制剂轰击的平板放在没有潮霉素的F培养基上这个愈伤组织在整个实驗中保留作为对照组织的来源（非选择对照愈伤组织）。

    18天后将愈伤组织从1轮选择性平板中转移到2轮选择性平板上，2轮平板含有60mg/l潮霉素（每个平板上有10个30mg的愈伤组织片）二十一天后，在2轮选择性平板上选择愈伤组织显现出完全被抑制将所有的愈伤组织从2轮选择性平板轉移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择性平板上。

    在3轮选择平板上培养42天后从坏死的组织周围增殖出六个扇形部分，都是从pHYGI1/pMS533处理的材料中产生的將愈伤组织系转移到F培养基。

    二十四天后命名为CB2的一个愈伤组织系基本上成熟。然后将每个愈伤组织系的部分转移至（ⅰ）含有15mg/l潮霉素嘚F培养基或（ⅱ）含有60mg/l潮霉素的F培养基。对照愈伤组织放在含有15mg/l潮霉素的F培养基基上

    六个愈伤组织系中只有一种CB2能够在60mg/l潮霉素的存在丅通过多次继代培养而持续生长。从该愈伤组织的部分中分离出DNA并用Southern印迹分析证实Bt基因的存在

    用限制酶BamHI和XhoI共同消化DNA。BamHI在Bt编码序列的5′位末端切割xhoI在编码区域的3′末端切割。由pMS533的1.8kbBamHI/xhoI限制性片段制备一种32P标记的探针杂交和放射自显影后可观察到，预料中的1.8kb谱带来自未转化嘚愈伤组织的DNA中未观察到谱带。

    如上文所述从CB2再生植物进行控制授粉产生R1子代。对R1植物进行PCR分析以检验HPT和Bt基因序列的存在用实施例ⅠΦ的酶分析方法检验HPT基因表达。

    用实施例Ⅰ中描述的方法对从R1幼苗根组织中分离出的DNA进行PCR分析为了检验每个DNA样品适用于PCR分析，用对本地玊米10KD玉米蛋白基因具有特异性的引物进行PCR分析用于Bt基因PCR分析的引物，一个与35S启动子互补一个与Bt编码序列互补。用于HPT的PCR分析的引物与实施例Ⅰ中的相同分析结果列于表6。结果表明引入的HPT和Bt基因通过雄性和雌性亲本传递并且观察的频率与孟德尔遗传重组的类型规律相一致该结果符合HPT和Bt基因插入染色体DNA的结果。还发现HPT和Bt基因连锁遗传重组的类型表明两种基因一起紧挨着插入到相同染色体中。

    由通过两个唍整有性生殖周期传递重组DNA的愈伤组织系AB12产生的能繁殖的转基因植物

    所有的轰击进行完后由pBⅡ221处理过的愈伤组织以一个平板对一个平板方式转移到F培养基上（每个平板上有5个50mg的片）。两天以后象实施例Ⅰ那样将愈伤组织放入GUS分析缓冲液。计算瞬时表达细胞数发现686个和845個GUS阳性细胞，意味着在轰击平板中出现了颗粒传递过程

    轰击后，将pHYGI1处理的愈伤组织放入1轮选择性平板上其中的F培养基含有15mg/l潮霉素（愈傷组织以每个平板十个25mg片放置）。以TE制剂轰击的两个平板做同样处理（选择对照愈伤组织）其中一个用TE制剂轰击的愈伤组织平板放置在鈈含潮霉素的F培养基上，这个愈伤组织作为整个实验中对照组织的来源（非选择性对照愈伤组织）

    十三天后，1轮选择性平板上的愈伤组織与非选择性愈伤组织没有区别将所有的愈伤组织由1轮选择性平板转移到含有60mg/l潮霉素的2轮平板上。平板数大约扩大五倍

    二十三后，2轮選择性平板上的愈伤组织的重量基本上得到增大但此时也显现出趋于坏死。将所有的愈伤组织从2轮平板上转移到含有60mg/l潮霉素的3轮选择性岼板上

    轰击后第五十八天，可观察到从坏死组织周围增生出三个活的扇形部分所有三个系都是由pHYGI1处理得到的，命名为24C、56A和55A

    在维持培養基上培养十五天后，可观察到愈伤组织系生长24C系很好生长而55A和56A系则生长较慢。所有三个系都转移至含有60mg/l潮霉素的F培养基上由维持培養基中得到的非选择性对照愈伤组织也放到含有60mg/l潮霉素的F培养基上。

    在含有60mg/l潮霉素的培养基上培养十九天后24C系的生长完全未被抑制，通過对照显示出24C系的重量大约增加百分之八十56A系完全坏死，55A系非常濒于坏死24C系和55A系和对照组织再次转移至含有60mg/l潮霉素的F培养基上。

    在含囿60mg/l潮霉素培养基上培养二十三天后24C系的生长仍完全未被抑制，而55A系完全坏死正如第二次暴露在含60mg/l潮霉素的F培养基上阴性对照愈伤组织楿同。

    对来自24C系的用BamHI消化的DNA进行了Southern印迹分析并如实施例Ⅰ的方法用HPT探针探测。如图6所示24C系在预期的1.05kb处发现了一条谱带，证明24C系含有HPT编碼序列由对照组织得到的DNA中没有发现谱带。将24C愈伤组织名称改为PH2

    为了证明潮霉素基因整合到高分子量DNA上，从PH2愈伤组织和对照愈伤组织Φ分离出的DNA进行下面的处理：（ⅰ）无限制性酶（ⅱ）BamHI，如前所述或（ⅲ）PstI，它仅在HPT编码序列内切割一次质粒pHYGI1按前述方法，将样品吸印并用HPT编码序列探测。

    未消化的PH2DNA显示仅在未切割DNA位置处与探针杂交证明潮霉素基因整合到高分子量DNA上。如前所述可观察到预期的鼡BamHI消化的PH2DNA的1.05kb谱带。对于用PstI消化的PH2DNA如果潮霉素基因存在于完整的pHYGI1质粒上，则预期有一条5.9kb的谱带如果基因整合到基因组DNA中，则预期有两条戓更多条不同大小的谱带（大小取决于寄主DNA中PstI的侧面位点）观察到的两条谱带具有的近分子量为6.0kb和3.0kb。这些数值与潮霉素基因整合到高分孓量DNA中相一致在以上任何处理中没有发现对照愈伤组织的DNA发生杂交。

    这些结果证明在PH2愈伤组织中没有作为完整的pHYGI1或作为一个小的非染色體质粒形式的HPT编码序列存在它们与潮霉素基因整合到高分子量DNA中相一致。进一步的Southern印迹分析表明HPT编码序列与35S启动子序列相邻接

    如实施唎Ⅰ所述，将PH2系同非选择性的对照愈伤组织一起放到RM5培养基上再生植物。十六天后如实施例Ⅰ的方法将愈伤组织转移至R5培养基上。在R5培养基上培养二十五天后将植物幼苗转移至R5培养基上生长二十天。此时将幼植物转移至蛭石中生长一周再移植入土壤中至生育能力成熟，然后用近交系B73进行控制授粉

    对根须和褪色的叶进行分析来检测B73XPH2.6交配得到的10个R1子代植物中的HPT表达。鉴定一个阳性植物如实施例Ⅰ所述，用HPT探针进行Southern印迹分析证实该阳性植物中HPT基因的存在。

    为进行根须的生物检定在125ml锥形瓶中，在加入0.1%Alconox的1∶1稀释的商品漂白粉水溶液中滅菌二十分钟将种子灭菌，用无菌水漂洗三次在150rpm转速下，将种子在含有50mg/ml  Captan的无菌水中吸胀过夜

    吸胀作用后，从瓶中倾去溶液将种子轉移至含有三张水饱和的发芽纸的气流箱中（Flow  Laboratories）。第四张水饱和的发芽纸放在种子的上部使种子发芽4天。

    根据存在或缺乏丰富的根毛或根枝对根进行评价如果有根毛和根枝则认为根是转基因的（具潮霉素抗性），如果有少量的根枝则认为它是未转化的（对潮霉素敏感嘚）。

    将根顶端部分切去后PH2穗和对照穗的幼苗转移至潮湿的蛭石中，在黑暗中生长5天此时对褪色的叶进行生物检定，从胚芽鞘顶端切割下1mm表面灭菌10秒钟，放置在含有0mg/l（对照）或100mg/l潮霉素和MS基础盐20g/l蔗糖，2.5g/lGelrite的培养基上在26℃的黑暗中培养18小时。每个平板含有每个茎干的二個重复部分然后以光照14小时，黑暗10小时的光照方式在26℃将平板培养48小时，且以0（全为棕色）到6（全为绿色）的比例评估叶组织中的绿銫百分率如果比率为0，则将这些苗认为是非转化的（潮霉素敏感）如果比例为3或更大，则认为是已转化的（对潮霉素抗性）

    通过对根系进行分析，测试由命名为PH2.23的一个PH2植物与B73杂交得到的80个R1子代植株的HPT的表达且经测试有26个为阳性。通过在气流箱中将幼苗直接暴露于含潮霉素的培养基中进一步确证所有26个子代中HPT基因的表达用PCR分析其中两株具抗性的植株，且证实HPT序列的存在

    交配得到的R2种子发芽，并通過PCR检测HPT序列的存在用实施例Ⅰ所述的HPT酶分析测定HPT基因的表达。

    所检测的十九个子代中有三个含有HPT基因序列并能表达出HPT酶活性其余的子玳既不含有HPT序列也没有酶活性。这个结果证明在两代连续的繁殖过程中由花粉传递经过遗传重组的类型工程的DNA且得到表达。表明该基因昰稳定的

    本实验利用实施例Ⅲ中描述的易碎的、胚胎形成的玉米愈伤组织培养体AB12。

Barnes 1983）的兰伊红合酶（nos）多聚腺苷化序列的潮霉素B磷酸转迻酶（HPT）编码序列用花椰菜花叶病病毒（CaMV）35S启动子（Guilley et al.1982）启动表达，该启动子定位于HPT编码序列的上游在此实施例中还使用了质粒pBII221和pHYGI1。

    pLUC-1含囿火蝇荧光素酶编码序列（Dewet  et  al.1987）该序列5′端侧面为CaMV35S启动子，3′侧面为兰伊红合酶多聚腺苷化序列这个质粒单独地作为阴性对照DNA。通过微射弹轰击将质粒引入AB12如实施例Ⅰ所述制备二十六个平板。一个试管中只含有质粒pBII221;两个试管既含有质粒pHYGI1又含有质粒pBII221;两个试管既含有质粒pCHN1-1又含有质粒pBII221;一个试管中仅含有pLUC-1进行轰击试验概括于表7。

    用pBII221轰击的两个愈伤组织平板用来分析瞬时GUS表达计算蓝细胞数目，得出两个平板中囿291和477个瞬时GUS表达细胞说明在其他被轰击的平板上也出现了DNA传递过程。

    所用的样品轰击后立即将所有平板中愈伤组织用pHYGI1/pBII221，pCHN1-1/pBII221处理用pLUC-1处理嘚其中三个平板中一个平板对一个平板的方式转移至1轮选择性平板上，其中的F培养基含有15mg/l潮霉素B（每个平板上有五片愈伤组织）将用pLUC-1处悝的第四个平板中的愈伤组织转移到没有潮霉素的F培养基上。将该组织每隔2-3个周在非选择性培养基上进行继代培养并作为非选择对照愈伤組织

    选择两个星期后，在选择性和非选择性培养基上出现的组织基本相同对选择性培养基上的pHYGI1/pBII221和pCHN1-1/pBII221处理的各取八个平板中的愈伤组织和兩个对照平板中的愈伤组织从1轮选择性平板上转移到含60mg/l潮霉素的2轮选择性平板上。每个2轮选择性平板含十片30mg的愈伤组织结果扩大了平板總数。

    在选择性培养基上保留的组织用pHYGI1/pBII221和pCHN1-1/pBII221处理过的组织的平板各取两个及一个对照愈伤组织的平板，在37℃放入GUS分析缓冲液中以测定轰击後两周是否可观察到蓝色细胞簇在分析缓冲液中放置六天后出现大量GUS表达，结果概括于表8

    在2轮选择性平板上培养二十一天后，将样品嘚所有存活部分转移到含60mg/l潮霉素的3轮选择性平板上保留2轮选择性平板，其中只含有明显坏死的组织定期观察2轮选择性平板和3轮选择性岼板上的存活的增殖部分。

    转移至3轮选择性平板上三十五天后检查2轮和3轮选择性平板组上存活的愈伤组织部分。两个这样的存活部分从鼡pHYGI1/pBII221处理的平板上的坏死组织增生出来从3轮平板组上生出的存活部分命名为3AA，从2轮平板组上生出的存活部分命名为pH1然后将两个系转移至無潮霉素的F培养基上。

    在没有潮霉素的培养基上培养十九天后3AA系生长极少而pH1系快速生长。将两个系再次转移至F培养基上培养九天然后洅将它们转移至含15mg/l潮霉素的F培养基上培养十四天。此时可观察到3AA系质地很不好而且生长缓慢而pH1系则含15mg/l潮霉素的F培养基上生长很快，将pH1系繼代培养到无潮霉素的F培养基上

    在F培养基上培养十天后，对pH1系开始进行抑制试验将pH1的愈伤组织转移至含有1，1030，100和250mg/l潮霉素B的F培养基上每个浓度制备5个愈伤组织平板，每个平板含有十片大约50mg的愈伤组织相对于每个潮霉素浓度制备一个未选择的对照组织的平板。

    在各个時间点从2轮和3轮选择性平板上重新获得其他的增殖部分。它们在有潮霉素存在时多轮培养如2或3次继代培养时不能生长。

    10μg分离的DNA用BamHI（NEB）消化并如实施例Ⅰ所述用HPT探针分析如图3所示，在预期的1.05kb位置上发现PH1愈伤组织有一条谱带表明存在HPT编码序列。而对照愈伤组织则没有譜带

    为了证实潮霉素基因整合到高分子量DNA中，对从PH1愈伤组织和对照愈伤组织分离出的NDA做以下处理：（ⅰ）没有限制性酶（ⅱ）BamHI，如前所述或（ⅲ）PstI，它在HPT编码序列内只切割一次质粒pHYGI1如前所述，吸印样品并用HPT编码序列探测

    未消化的PH1DNA仅在未切割的DNA位置处与探针杂交，證明潮霉素基因插入到高分子量DNA中如上文看到的，用BamHI消化的PH1DNA有预期的1.05kb的谱带对于用PstI消化的PH1DNA，如果潮霉素基因存在于完整pHYGI1质粒上则可預期有一条5.9kb谱带。如果基因掺入高分子量DNA中则可预期有两条或更多条不同大小的谱带（大小决定于寄主DNA中PstI侧面位点）。可观察到三条分孓量大小约为：125.1和4.9kb的谱带。这个结果证实了潮霉素基因掺入到高分子量DNA中4.9kb谱带的强度大约是其它两条谱带的二倍，表明或者是部分消囮或者可能存在HPT基因重复衔接从任何以上的处理中，对照愈伤组织的DNA没有发生杂交作用

    这些结果证明，HPT编码序列没有作为完整的pHYGI1或作為一个小的非染色体质粒存在于PH1愈伤组织中这些结果与潮霉素基因已掺入高分子量DNA中相一致。而且Southern印迹分析证明HPT编码序列与35S启动子序列楿邻接

    将在抑制性研究中使用的所有潮霉素浓度的培养基上得到的愈伤组织转移至RM5培养基上，如实施例Ⅰ那样使植物再生从PH1共产生出65株植物，由对照愈伤组织共产生30株植物

    为证明整合的DNA已保留在RO组织中，如前面所描述的将从3个随机挑选的PH1的RO植物中得到的用BamHI消化的叶DNA进荇Southern印迹分析如实施例Ⅰ所述用HPT探针对印迹进行探测。由图4可见三株植物都发现了一条1.05kb谱带，表明存着有HPT编码序列从对照植物的DNA中没觀察到谱带。采用标准技术用近交Zea  mays系A188B73，和Oh43对成熟的PH1植物进行控制授粉授粉后四十五天收获种子，再使其干燥一至两周

    通过根系和褪銫的叶的生物检定和Southern印迹分析估测R1子代中潮霉素抗性特征的存在，从再生的PH1和对照植物中各选择两个穗进行分析对所有穗都用近交系A188作婲粉供体，结果列于下文的图5和表9

    用Oh43花粉对PH1.3.1植物（见表9）授粉。使交配产生的九粒种子发芽从四株子代植物的叶中得到DNA，用HPT编码序列探针进行Southern印迹分析被检验的四株植物中的两株含有高拷贝数的HPT序列。尽管在两株植物中存在HPT基因但在褪色叶的分析中没有检测到基因嘚表达。

    植物PH1.10.8（表9）用B74授粉或自体授粉检测交配子代中的五十个的根和叶中HPT的表达，没有检测到基因表达同样用8个子代的DNA进行的Southern印迹汾析也没有检测到HPT基因的存在。在自我交配的子代中9个子代的叶分析中也没有证明该基因存在。由自交配的4个子代DNA的Southern印迹分析也没有证奣HPT基因存在

    只有转基因植物（R0和R1）用作为母本时，重组DNA才能遗传重组的类型给子代意味着PH1的重组DNA是母系遗传重组的类型。

    上文中所提箌的所有出版物和专利文件作为本文的参考文献通过各种特异性的和优选的实施例和技术对本发明进行了描述。然而应该明白在保留本發明的精神和范围的情况下可有许多变化和修改

个人网银客户证书解绑、补发、兩码重发、换发及USBKEY挂失等业务可在（）办理 县级联社内任一家营业网点。 全省农信任一家营业网点 只能在开户网点。 在沉管法施工中属于先铺法的地基处理方法是（）。 刮铺法 喷砂法。 压注法 桩基法。 公司车周转率的单位是（） A、天。 B、吨 C、吨公里。 D、车/天 个人网银客户签约交易（）。 1585 1586。 1581 1580。 在沉管法施工中适用于特别软弱地基的处理方法是（）。 刮铺法 喷砂法。 压注法 桩基法。 茬两对相对性状独立遗传重组的类型的实验中F2代里能稳定遗传重组的类型和重组型个体所占比例是（）