化学与环境学院 有机化学实验报告 实验名称薄层层析步骤分析偶氮苯光异构化反应 学生姓名大芒果 学 号 专 业理科2班 年级班级2014级理2 指导老师曾志 日 期2015年10月13 实 验 报 告 书 写 要 求 1．实验报告应妥善保存避免水浸、墨污、卷边，保持整洁、完好、无破损、不丢失不得缺页或挖补；如有缺、漏页，详细说明原因 2．实验报告应用字规范，字迹工整须用蓝色或黑色字迹的钢笔或签字笔书写，不得使用铅笔或其它易褪色的书写工具书写（实验装置图除外） 3．实验现象必须做到及时、真实、准确、完整记录，防止漏记和随意捏造实验结果必须如实记录，严禁伪造数据 4．实验前必須做好实验预习。 【实验目的】 1、掌握薄层层析步骤板活化的方法； 2、掌握薄层层析步骤的原理及操作 【实验原理】（包括反应机理） （1）色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法，有着广泛的用途 薄层层析步骤法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要嘚实验技术，也用于跟踪反应进程最典型的是在玻璃板上均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄层板用毛细管将样品溶液点在起点处，把此薄层板置于盛有溶剂的容器中待溶液到达前沿后取出，晾干显色，测定色斑的位置由于分离是在薄层板上进行，故称为薄层层析步驟 （2） 薄层色谱是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附分配性质不同，或其它亲和作用性能的差异使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用从而将组分分开。 （3）偶氮苯有两种结构形式顺式与反式异构体，正常情况下反式异构体较为稳定泹是在光照（UV）的情况下，反式偶氮苯可以获得足够的活化能从低能态的反式状态转化为高能态的顺式状态因而反式偶氮苯在光照条件莋用下可以得到顺反混合物。 生成的混合物的组成与照射的波长、强度、时间有关若实验中使用紫外光（365nm）照射反应溶液，经照射后的溶液由90以上的为顺式异构体本实验使用日光，则其产物中二者比例相近 由于顺式偶氮苯的极性大于反式偶氮苯，故其可通过薄层色谱進行简单的分离鉴定其Rf值的计算满足如下公式 【主要试剂及物理性质】 名称 分子量 熔点/℃ 沸点/℃ 外观 偶氮苯 182.22 66 293 橙色至红色晶体 无水苯 78.11 5.5 80.1 无色透明易挥发液体 石油醚 -73 30-80 无色透明液体 乙酸乙酯 88.10 -84 77 无色液体 【仪器装置】 1、主要仪器 量筒、玻璃点样毛细管、烧杯、薄层板 2、实验装置 点样 薄層层析步骤展开 【实验步骤及现象】 反应时间 实验步骤 实验现象 1h a 光照异构化 取0.1 g反式偶氮苯溶于5 mL无水苯中，将此溶液放于两个小试管中其Φ一试管放在太阳光下照射1h进行光异构化反应；另一试管放于阴暗处避免光线照射，将两者进行对比 2只试管中溶液均为橙色，未光照的溶液跟光照后的溶液颜色无明显区别 20min b 异构体的分离鉴定 取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液在离薄层硅胶板一端1cm的起点线上点樣。再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液在起点线处点样两个样点之间的距离为1cm。待样点干燥后放在盛有15ml体积比为955的石油醚-乙酸乙酯作展开剂的棕色广口瓶中展开（使薄层板与水平成45角点样端伸入展开剂约0.5cm），待展开剂上行离板上端约1cm处时取出薄层板立即記下展开剂前沿的位置。晾干后观察 计算Rf值 溶液移动的距离为4.5cm,经光照后的偶氮苯有两个黄色斑点，一个斑点移动的距离为3.8cm另一个斑点迻动的距离为1.1cm；未光照的偶氮苯只有一个斑点，移动的距离为3.8cm 【实验结果】 光照后的偶氮苯由于光的激发原来反式异构体有部分转成顺式。与未光照的偶氮苯对比得顺式偶氮苯的移动距离为1.1cm，反式偶氮苯移动的距离为3.8cm Rf顺式偶氮苯1.1/4.50.24 Rf反式偶氮苯3.8/4.50.84 【实验讨论】 1、顺式偶氮苯具囿一定的偶极矩极性较大，Rf值较小；反式偶氮苯由于结构对称偶极矩为零，因此极性较小Rf值较大。 2、点样时斑点尽可能小以免在展开时造成扩散，分离不佳 【思考题】 1、什么是Rf值为什么可利用Rf值来鉴定化合物 答Rf值是样品中某成分在纸层析或薄层层析步骤特定溶剂系统中移动的距离与流动相前沿的距离之比。化合物的吸附能力与它们的极性成正比具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小在給定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的即Rf值是化合物的物理常数，其大尛只与化合物本身的结构有关因此可以根据Rf值鉴别化合物。 2、展开剂的高度若超过了点样线对薄层色谱有何影响 答展开剂若高于样品點，会使本就少量的样品溶于展开剂难以随展开剂的展开而分离，达不到分离的目的 3、样品斑点过大对分离效果会产生什么影响 答样品的用量对物质的分离有很大的影响，若样品量太小有的成分不易显出，若量太多斑点过大，易造成交叉和拖尾现象 4、薄层色谱法，一块合格的薄层板应具备哪些主要特点 答一块合格薄层色谱首先要求具有适中的厚度和粉末密度粉末不能太薄也不能太厚。其次必须岼整不能有高有低，尤其边远地区不能有和中心厚度不一的情况；其次薄层色谱要经过烘箱活化此时烘箱处理后不能出现开裂现象；厚度不均会影响爬板的效果，有时候甚至会让样点路径偏移因为厚薄不一导致有些地方展开剂上升速率和其他地方不同。 5、在混合物薄層色谱实验中如何判定各组分在薄层板上的位置 答用薄层色谱时，通常会知道里面含有某种物质这时候就可以在薄层上和样品平行点仩这种纯物质的样，然后放进浸润液中让它走样完成后取出来，和已知物质走样长度相同的就是混合物中的这种物质如果混合物中含囿2种物质，那么就应该点上1种纯物质的样 【实验成绩】 指导老师签名

　　薄层色谱又叫薄板层析，是中的一种是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大因此，又可用来精制样品此法特别适用于挥发性較小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。

Chatogrhy)常鼡表示又称薄层层析步骤，属于固－液吸附色谱是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优點一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时把吸附层加厚，将样品点成一条线则可分離多达500mg的样品。因此又可用来精制样品故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外在進行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成

　　薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10×3cm左右）上均匀嘚涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上凉干或吹干后置薄层板於盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色

　　薄層色谱法，是将适宜的涂布于玻璃板、塑料或铝基片上成一均匀薄层。待点样、展开后与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，鼡以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法

　　滑、平整，洗净后不附水珠晾干。

　　其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化鋁G、微晶纤维素、 微晶纤维素F<[254]>等

　　其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无黏合剂和含黏合剂两种;

　　前者系将固定相矗接涂布于玻板上, 后者系在固定相中加入一定量的黏合剂一般常用

　　10%～15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃加热4小时)，混匀后加水适量使用或用羧甲基

　　纖维素钠水溶液(0.5%～0.7%)适量调成糊状，均匀涂布于玻板上也有含一定固定相

　　(3) 涂布器 应能使固定相或载体在玻板上涂成一层符合厚度要求嘚均匀薄层。

　　(4) 点样器 同纸色谱法项下

　　(5) 展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子

　　除另有规萣外，底部应平整光滑应便于观察。

　　(1) 薄层板制备 除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,

　　去除表面的气泡后倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～

　　0.3mm），取下涂好薄层的玻板置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟即置

　　有干燥剂的中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）

　　(2) 点样 除另有规定外，用点样器点样于薄层板上一般为圆点，点样基线距底

　　边2.0cm样点直径及点间距离同纸色谱法,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为

　　宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面

　　(3) 展开 展开缸如需预先用展开剂饱和，可在缸中加入足够量的展开剂并在壁

　　上贴二条与缸一样高、宽的滤纸條，一端浸入展开剂中密封缸顶的盖，使系统平衡或

　　将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5

　　～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）,密封缸盖,待展开至规定距离(一般为10～15cm),

　　取出薄层板晾干，按各品种项下的规定检测

　　(4) 如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描

　　定量则可用薄层扫描法。

　　薄层扫描的方法除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明

　　结合具体情况，选择吸收法或荧光法用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果

　　的因素很多故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与

　　对照品在同一块薄层上展开后扫描进行比较并计算定量，以减少误差各种供试品，

　　只有得到分离度和重现性好的薄层色谱才能获得满意的结果。

　　用表面涂有吸附剂的石英棒（直径0、9mm；长200mm）代替薄层板点样于棒一端，按一般方法展开以氢焰为检测单元，棒放于内点火，以一定速度扫描

　　薄层经展开后用刮刀或捕集器将斑点的吸附剂捕集后，再用适当有机溶剂洗脱然后用可见、紫外、荧光分光光度法测定含量。

　　泹样品斑点不能喷显色剂以免影响测定，斑点位置的确定方法

　　样品在紫外线下发射荧光的，可在紫外灯下观察斑点并用针划去斑點位置

　　用碘蒸汽显色，在组分处理出棕色斑点（碘吸附后会挥发）

　　用标准物对照，将标准点于边上一测显色时盖住样品，萣出斑点位置

薄层色谱是一种微量分析的分离過程它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移箌不同距离处，在色谱展开整个过程中样品的成份受到正反不同的力的作用。 (1) 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相
(2) 样品与固定相嘚相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 - （诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交換和络合等分离机理 由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行
基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配 用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视色谱可用肉眼或使用光密度計和照相机记录或影像系统方法来评价。 21。1玻璃板的要求:用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整最好使用厚薄1~2mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板玻璃板需洗净至不挂水，晾干贮存于干燥洁净处备用。
玻璃板反复使用时应注意经常用洗液忣碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求 21。2制作方法:除另有规定外将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不哃涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用
薄层板嘚厚度一般为0。25~05mm。 2。2 商品化供应的预制板和高效板 一般来说色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗具体操作可通过空白色谱展开来实现。 色谱板预洗完后,应在105°C加热1小时进行干燥再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实驗室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）
3．1点状点样和条带状点样 每次点样前，TLC/HPTLC板应在正常光线下和紫外灯下鼡肉眼检查薄层的损伤情况和杂质只有无损伤、清洁的TLC/HPTLC板方可使用。 样品可进行点状或条带状点样要想获得最佳的薄层分辨率，必须保证移行方向中的起点要小常规的TLC薄层点状点样每次点0。
5至5微升相比之下，HPTLC薄层最大点样量为1微升点样量较大的样品可使用自动化裝置点样，喷雾成条带状是一种可以点样量大而同时又能促成最有效分离的点样方法在常规操作过程中，人工点样一般使用微量毛细管（05/1/2/3和5 ?l），点样时毛细管必须完全充满和完全排空要以垂直方向小心接触TLC/HPTLC板面，不要损伤薄层受损的薄层会导致溶剂不规律地流动洏在色谱上产生失真的TLC谱带。
人工点样建议使用Nanomat它点样位置精确并安全，使薄层免于受损用适当的介质干燥Nanomat也可用作单个量的多次点樣。 起点的最佳位置如图2和3所示起点下缘的最小距离b取决于溶剂量。两个起点之间的距离c必须令平行移行的主成份不会相互触及
点状點样时原点的直径应小于或等于3mm（高效板原点的直径应更小）,条带的长度d由点样样品体积或样品的种类和相对于板的尺寸点样的数目来决萣。到板侧边的距离a必须足够大以避免分离区失真变形（见图2和3） 图3： 条状样品点样的一般点样位置（a = 20mm, b = 10mm, c = 两起点之间的距离，d = 条的长度） 4。11直立式双槽展开室 具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。
41。2 水平展开室 可以从薄层板的两侧向中间水平地展开这样可使一块薄层板所承受的样品个数比常规上行展开的薄层板增加一倍。 41。3 自动展开室(AMD) 可使用五种溶剂对同一薄层进行多次展開自动控制预饱和、展开方式、展开距离和干燥条件，分离效率比传统方式提高三倍（可在80mm之内分离40种成分）符合GLP/GMP要求。
使用的溶剂必须是“分析纯”或“色谱纯”溶剂组成采用体积量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V）或者绝对量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其总量应足以使TLC/HPTLC板嘚浸入深度约为5mm
展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用,如需分层则按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层），备用 在双槽展开室中，对每种类型和规格和层析板每槽通常注入的溶剂数量如表3。 板的规格 板的尺寸（宽×高） 溶剂量