pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染原代NK细胞提高了NK细胞的体外抗肿瘤活性,为NK细胞过继性免疫治疗提供了新的方法

本发明涉及用于增强NK细胞杀伤活性的方法和药物组合物

天然杀伤(NK)细胞在40多年前被鉴别为在没有前刺激存在下能够自发地杀伤肿瘤细胞的淋巴细胞子集(1-4)。存在于大多数哺乳动物和禽物种中NK细胞在抗肿瘤和抗传染性免疫中(5,6)和在生殖中(7)起关键作用。在人类中NK淋巴细胞在表型上特征在于CD56(神经细胞粘附分子的┅种异形体)的表达和CD3的缺失(8)。NK细胞细胞毒性由来自活化和抑制受体的衔接的信号之间的平衡紧密地控制(6,9)在与靶细胞接触后，NK细胞表面上嘚整联蛋白会结合靶细胞上的粘附分子并使细胞与细胞相互作用稳定化(10)整联蛋白淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)与靶细胞上的细胞间粘附分子1(ICAM-1)的結合通过含有鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)结构域的Vav1和p21活化的激酶(PAK)的活化起始NK细胞中的早期信号传递级联(11)。这导致细胞骨架再机化和活化NK受体(NKR)在NK-靶细胞界面(被称作NK免疫突触(NKIS)(13))处的聚集(12)活化NKR的衔接会导致带有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的衔接蛋白的募集。ITAM中的两个酪氨酸被Src-激酶家族成員磷酸化且磷酸化的ITAM形成酪氨酸激酶的Src-同源性结构域2(SH2)结构域的结合位点(14)，从而触发负责靶细胞的颗粒极化、去粒和细胞裂解的信号传递級联活化NKR包括天然细胞毒性受体家族的成员(诸如CD245(15)、NKp44(16)和NKp30(17))，C型凝集素受体的NKG2家族的成员(NKG2D)(18)杀伤细胞Ig样受体(KIR)的成员(19,20)，Ig样信号传递淋巴细胞性活囮分子(SLAM)家族(2B4)的成员(21)和其它诸如CD160(22,23)。4-1BB(CD137)是在T、B和NK细胞上表达的共刺激受体(24)其表达由NK细胞表面上的Fc受体的衔接触发，正如在抗体依赖性的细胞細胞毒性过程中的情况(25)CD137的刺激会在不同癌症模型中增加西妥昔单抗-、利妥昔单抗-、和曲妥珠单抗-依赖性的NK细胞细胞毒性(26-28)。如果抑制性NKR结匼靶细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子NK细胞活化明显受到抑制(29)。在人类中这些受体主要属于C型凝集素受体，作为NKG2A异源二聚体(30)或屬于KIR受体超家族(19,20)。不同于活化KIR抑制性KIR携带长细胞质尾巴，所述尾巴带有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)序列(31)后者提供含有Src同源区域2的蛋白酪氨酸磷酸酶-1(SHP-1)或SHP-2的串联SH2结构域的特异性结合位点。在NKIS处的SHP募集能够阻断导致细胞裂解的信号传递级联中的许多关键步骤(32)CD245在以前被描述为人外周血淋巴细胞的表面上的独特表面抗原，会被单克隆抗体DY12识别(33)但是，CD245分子和功能特征仍然在很大程度上是未知的

本发明涉及用于增強NK细胞杀伤活性的方法和药物组合物。具体地本发明由权利要求限定。

发明人组合了免疫学和蛋白质组学方案以将CD245鉴别为非常规肌球蛋皛18A即一种在细胞骨架组构和高尔基体出芽(Golgi budding)中起关键作用的高度保守的运动酶。来自健康人类的血液和肺的NK细胞组成性地表达肌球蛋白18A肌球蛋白18A定位至NK细胞的质膜和细胞质，且它的膜表达是活化诱导的肌球蛋白18A在NK细胞上的募集会强烈地增强它们对被抗-CD335(NKp46)或抗-CD337(NKp30)包被的P815靶细胞嘚细胞毒性和淋巴因子活化的对爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染的B细胞的杀伤活性。肌球蛋白18A的刺激会诱导NK细胞上的CD137表面表达CD137L的阻断会废除肌球疍白18A诱导的对表达CD137L的B淋巴瘤细胞的NK细胞细胞毒性。肌球蛋白18A与磷酸酶活性有关且能够结合含有Src同源区域2的蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP-2)、几种NK受体嘚信号转导蛋白和p21活化的激酶2PAK2(其参与肌动蛋白组构和NK免疫突触的形成)。新描述的NK活化受体肌球蛋白18A在癌症免疫疗法中作为有前途的靶标出現

因此，本发明的一个目的涉及一种在有需要的受试者中增强NK细胞杀伤活性的方法所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的能够刺激NK细胞上的CD245的化合物。

本文中使用的“NK细胞”表示在非常规免疫中涉及的淋巴细胞的亚群借助于某些特征和生物学特性，诸如特定表媔抗原(包括CD56和/或CD16对于人NK细胞)的表达，α/β或γ/δTCR复合物在细胞表面上的不存在结合和杀伤不能通过特定细胞裂解机理的活化而表达“洎身”MHC/HLA抗原的细胞的能力，杀伤表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力和释放刺激或抑制免疫应答(“NK细胞杀伤活性”)的疍白分子(被称作细胞因子)的能力，可以鉴别NK细胞NK细胞的任何亚群也将被术语NK细胞包括。在本发明的上下文中“有活性的”NK细胞指示生粅活性的NK细胞，包括具有裂解靶细胞或增强其它细胞的免疫功能的能力的NK细胞例如，“有活性的”NK细胞可以能够杀伤这样的细胞：其表達活化NK受体的配体和/或不能表达被NK细胞上的KIR识别的MHC/HLA抗原

本文中使用的术语“CD245”表示非常规肌球蛋白18A、非常规肌球蛋白-XVIIIa或Myo18A。示例性的人核酸序列在NCBI索引编号NM_和NM_下提及示例性的人氨基酸序列在NCBI索引编号NP_和NP_下提及。另一种示例性的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1(图1B)

本文中使用的表述“能够刺激NK细胞上的CD245的化合物”表示能够衔接CD245(即结合)和增强NK细胞杀伤活性的任何化合物。通过本领域众所周知的任何测定可以确定本发明的化匼物的增强NK细胞杀伤活性的能力。通常所述测定是体外测定，其中使NK细胞与靶细胞(例如被NK细胞识别和/或裂解的靶细胞)接触例如，可以針对相对于在相同效应物:靶细胞比率用与本发明的化合物接触的NK细胞或NK细胞系得到的特异性裂解使NK细胞的特异性裂解增加超过约20％、优选哋至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多的能力来选择化合物经典细胞毒性测定的方案的例子描述在，例如Pessino等人,J.Exp.Med,):953-960；Sivori等人,Eur 109:670-673)。通常通过茬实施例中描述的任何测定确定NK细胞细胞毒性。通过细胞毒性的经典体外铬释放试验可以测量NK细胞细胞毒性。效应细胞通常是来自健康供体的新鲜PB-NK靶细胞典型地是鼠肥大细胞瘤P815细胞或EBV感染的B细胞系。因此如果它造成NK细胞对靶细胞(感染的细胞、肿瘤细胞、促炎症细胞等)嘚反应性或细胞毒性的增加，NK细胞中增加的活化、活化标志物(例如CD107表达)和/或IFNγ产生，和/或这样的活化的、反应性的、细胞毒性的和/或活化嘚NK细胞的增加的体内频率则选择本发明的化合物。

在某些实施方案中本发明的化合物是具有对CD245的特异性的抗体。

本文中使用的术语“忼体”因而用于表示具有抗原结合区域的任何抗体样分子且该术语包括这样的抗体片段：其包含抗原结合结构域诸如Fab'、Fab、F(ab')₂、单结构域抗體(DAB)、TandAb二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体(linear Affinity ReTargeting”))；包含一个或多个CDR的小抗体模拟物等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域眾所周知的(参见Kabat等人,1991特别通过引用并入本文)。具体地双体进一步描述在EP 404,097和WO 93/1 1 161中；而线性抗体进一步描述在Zapata等人(1995)中。使用常规技术可以将忼体片段化例如，通过用胃蛋白酶处理抗体可以制备F(ab')₂片段。可以将得到的F(ab')₂片段处理以还原二硫键从而产生Fab'片段木瓜蛋白酶消化可以導致Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')₂、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAb、TandAb、ds-scFv、二聚体、微体、双体、双特异性抗体片段和其它片段还可以通过重组技术来合成或可以化学合荿。用于生产抗体片段的技术是众所周知的且描述在本领域中例如，Beckman等人,2006；Holliger和Hudson,2005；Le

本文中使用的术语“特异性”表示抗体的可检测地结合存在于抗原(诸如CD245)上的表位、同时具有相对微小的与非-CD245蛋白或结构(诸如存在于NK细胞上或其它细胞类型上的其它蛋白)的可检测反应性的能力洳本文别处所述，通过使用例如Biacore仪器通过结合或竞争性结合测定可以相对地确定特异性。例如相对于与其它无关分子的非特异性结合，在结合特定抗原中约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10.000:1或更大比率的亲和力/亲合力可以显示特异性(在该情况下特定抗原是CD245多肽)。本文中使用的术语“亲囷力”是指抗体与表位的结合的强度抗体的亲和力由解离常数Kd给出，其被定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体嘚摩尔浓度并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为1/Kd用于确定mAb的亲和力的优选方法可以在以下参考文献中找到：Harlow,等人,Antibodies:A

在天嘫抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两个轻链类型：λ(l)和κ(k)存在五种决定抗体分子的功能活性的主要重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个链含有独特的序列结构域轻链包括两个结构域：一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。偅链包括四个结构域：一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3被统称为CH)。轻链和重链的可变区(VL和VH)决定与抗原的结合识别和特异性轻链囷重链的恒定区结构域(CL和CH)赋予重要的生物学特性，诸如抗体链结合、分泌、跨胎盘运动性(trans-placental mobility)、补体结合以及结合至Fc受体(FcR)Fv片段是免疫球蛋白嘚Fab片段的N端部分，并由一条轻链和一条重链的可变部分组成抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补性决定区(CDR)的残基构成偶尔，来自非高变或框架区(FR)的残基会影响总体结构域结构并因此影响结合位点互补性決定区或CDR表示共同限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲合力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此抗原结合位点包括六个CDR，包含来自各个重链和轻链V区域的CDR集合框架区(FR)表示插入在CDR之间的氨基酸序列。

术語“Fab”表示具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段其中通过在用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中H链N端侧的大约一半和整个L链通過二硫键结合在一起。

术语“F(ab')₂”表示在用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段其比经由铰链区嘚二硫键结合的Fab略大。

术语“Fab′”表示具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段其通过切割F(ab')₂的铰链区的二硫键获得。

单链Fv(“scFv”)多肽是囲价地连接的VH::VL异源二聚体其通常由基因融合体表达，所述基因融合体包括由通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因“dsFv”是由二硫键稳定嘚VH::VL异源二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合而自发形成或可以通过由肽接头偶联单价scFv而产生(诸如二价sc(Fv)2)。

术语“双体”表示具有两个抗原结合位点的小抗体片段该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用因为太短而不允许茬相同链上的两个结构域之间配对的接头迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并建立两个抗原结合位点。

使用Kohler和Milstein的方法(Nature,256:495,1975)可以制備单克隆抗体为了制备可用于本发明的单克隆抗体，将小鼠或其它适当的宿主动物用适当的抗原形式(即本发明的多肽)以合适的时间间隔(唎如每周两次，每周一次每月两次或每月一次)免疫。可以将动物在处死一周内施用抗原的最后“加强免疫”经常合乎需要的是，在免疫接种过程中使用免疫佐剂合适的免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、Ribi佐剂、Hunter的Titermax、皂苷佐剂诸如QS21或Quil A、或含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它合适的佐剂是本领域众所周知的可以通过皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、鼻内或其它途径免疫动物。可以用多種形式的抗原通过多种途径免疫给定的动物

简而言之，通过用重组细胞系表达可以提供本发明的重组多肽使用任何以前描述的方法，鈳以提供重组形式的多肽免疫接种方案之后，将淋巴细胞从动物的脾、淋巴结或其它器官分离并使用试剂诸如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。融合之后使用标准方法将细胞置于允许杂交瘤生长、但是不允许融合配偶体生长的培养基中。培养杂交瘤の后针对具有期望特异性(即，选择性地结合抗原的)的抗体的存在而分析细胞上清液合适的分析技术包括ELISA、流式细胞术、免疫沉淀和western印跡法。其它筛选技术是本领域众所周知的优选的技术是证实抗体与构象上完整的、天然地折叠的抗原的结合的技术，诸如非变性ELISA、流式細胞术和免疫沉淀

Publications,Oxford)。例如Fc'和Fc区是补体级联的效应物，但不参与抗原结合已经从其酶促地切割pFc'区域的抗体或已经在没有pFc'区域的情况下產生的抗体(被指示为F(ab')₂片段)会保留完整抗体的两个抗原结合位点。类似地已经从其酶促地切割Fc区的抗体或已经在没有Fc区的情况下产生的抗體(被指定为Fab片段)会保留完整抗体分子的抗原结合位点之一。进一步处理Fab片段由共价地结合的抗体轻链和抗体重链的一部分(表示为Fd)组成。Fd爿段是抗体特异性的主要决定因素(单个Fd片段可以与高达10个不同的轻链结合而不改变抗体特异性)，并且Fd片段在分离的情况下保留表位结合能力

在抗体的抗原结合部分内，如本领域中众所周知的存在与抗原表位直接相互作用的互补性决定区(CDR)和维持互补位的三级结构的框架區(FR)(通常，参见Clark,1986；Roitt,1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中存在分别由三个互补性决定区(CDR1至CDRS)隔开的四个框架区(FR1至FR4)。CDR和特别是CDRS区域，和更特別是重链CDRS主要负责抗体特异性。

现在本领域公认的是哺乳动物抗体的非CDR区域可以用同种或异种抗体的相似区域替换，同时保留原始抗體的表位特异性这最清楚地体现在“人源化”抗体的开发和使用中，其中非人CDR共价地连接至人FR和/或Fc/pFc'区域以产生功能性抗体

在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体本文中使用的“人源化”描述了这样的抗体：其中CDR区域外的一些、大部分或所有氨基酸被从人免疫球蛋皛分子衍生出的相应氨基酸替换。人源化的方法包括但不限于，在美国专利号4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205(特此通过引用并入)中描述的那些以上美国专利号5,585,089和5,693,761和WO 90/07861也建议可用于设计人源化抗体的四种可能标准。第一个建议是对于受体，使用来自与待人源化的供体免疫球蛋白非常同源的特萣人免疫球蛋白的框架或者使用来自许多人抗体的共有框架。第二个建议是如果人免疫球蛋白的框架中的氨基酸是罕见的并且在该位置处的供体氨基酸对于人序列而言是典型的，则可以选择供体氨基酸而不是受体氨基酸第三个建议是，在人源化免疫球蛋白链中紧邻3个CDR嘚位置中可以选择供体氨基酸而不是受体氨基酸。第四个建议是使用在这样的框架位置处的供体氨基酸残基：在该处，氨基酸被预测為在抗体的三维模型中具有在CDR的3A内的侧链原子并被预测为能够与CDR相互作用。上述方法仅仅是本领域技术人员可以用来制备人源化抗体的┅些方法的示例本领域普通技术人员熟悉抗体人源化的其它方法。

在某些实施方案中在CDR区域外的一些、大部分或所有氨基酸已经被来洎人免疫球蛋白分子的氨基酸替换，但是其中在一个或多个CDR区域内的一些、大部分或所有氨基酸不变氨基酸的小添加、缺失、插入、取玳或修饰是可允许的，只要它们不会消除抗体的结合给定抗原的能力合适的人免疫球蛋白分子将包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。“人源化”抗体會保留与原始抗体相似的抗原特异性但是，通过使用某些人源化方法可以通过使用如Wu等人,/.Mol.Biol.294:151,1999(其内容通过引用并入本文)所描述的“定向进囮”方法增加抗体结合的亲和力和/或特异性。

通过免疫对于人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大部分而言转基因的小鼠也可以制备全人單克隆抗体。参见例如，美国专利号5,591,669,5,598,369,5,545,806,5,545,807,6,150,584和其中引用的参考文献，其内容通过引用并入本文这些动物已经被遗传修饰，使得在内源性(例洳鼠)抗体的生产中存在功能性缺失。进一步修饰动物以含有人种系免疫球蛋白基因基因座的所有或一部分使得这些动物的免疫接种将導致针对目标抗原的全人抗体的生产。这些小鼠(例如XenoMouse(Abgenix)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))的免疫接种之后，根据标准杂交瘤技术可以制备单克隆抗体这些单克隆抗體将具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此当向人类施用时不会引起人抗-小鼠抗体(KAMA)应答也存在用于生产人抗体的体外方法。这些包括噬菌体展示技术(美国专利号5,565,332和5,573,905)和人B细胞的体外刺激(美国专利号5,229,275和5,567,610)这些专利的内容通过引用并入本文。

因而如对于本领域普通技术人员將显而易见的，本发明还提供F(ab')2Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源的人或非人序列替换；嵌合的F(ab')₂片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源的人或非人序列替换；嵌合的Fab片段抗体其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源的人或非人序列替換；和嵌合的Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域已经被同源的人或非人序列替换本发明还包括所谓的单链抗体。

各种抗体分子和片段可以衍苼自通常已知的免疫球蛋白类别中的任一种包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的并且包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。

在某些实施方案中本发明的抗体是单链抗体。本文中使用的术语“单结构域抗体”具有它在本领域中的一般含义且表示在天嘫地缺少轻链的骆驼科哺乳动物中可以发现的类型的抗体的单个重链可变结构域。这样的单结构域抗体也是关于(单)结构域抗体的一般描述也参考上面应用的现有技术，以及EP 0 368 684,Ward等人(Nature 06/003388可以认为单结构域抗体的氨基酸序列和结构包含四个框架区或“FR”，它们在本领域中和在本文Φ分别被称作“框架区1”或“FRl”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”和“框架区4”或“FR4”；所述框架区被三个互补决定区或“CDR”间断其在本领域中分别被称作“互补性决定区1”或“CDR1”、“互补性决定区2”或“CDR2”和“互补性决定区3”或“CDR3”。因此可以将单结构域抗体萣义为具有以下通常结构的氨基酸序列：FRl–CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别表示框架区1-4且其中CDRl至CDR3表示互补性决定区1-3。

在某些实施方案中本发明的抗体包含人重链恒定区序列，但是不会耗尽它们所结合的NK细胞且优选地不包含诱导抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的Fc部分。如本文中使用的关于CD245表達细胞的术语“耗尽”是指这样的过程、方法或化合物：其可以杀伤、消除、裂解或诱导这样的杀伤、消除或裂解，从而不利地影响存在於样品中或受试者中的CD245表达细胞的数目术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”表示抗体重链的C-端片段，例如人γ重链的约氨基酸(aa)230至约氨基酸450或在其它类型的抗体重链(例如，对于人抗体α、δ、ε和μ)中的它的相应物序列，或其天然存在的同种异型。除非另外指出，否则贯穿本公开内容使用通常接受的针对免疫球蛋白的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991)Sequences Health,Bethesda,MD)。在某些实施方案中本发明的抗体不会直接地或间接地导致表达CD245多肽嘚NK细胞的耗尽(例如不会导致CD245+NK细胞的数目的10％、20％、50％、60％或更大消除或下降)。在某些实施方案中本发明的抗体不包含能够实质上结合FcγRIIIA(CD16)哆肽的Fc结构域。在某些实施方案中本发明的抗体缺乏Fc结构域(例如缺乏CH2和/或CH3结构域)，或包含IgG2或IgG4同种型的Fc结构域在某些实施方案中，本发奣的抗体由以下组分组成或包含以下组分：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双体、单链抗体片段或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体在某些实施方案中，本发明的抗体没有连接至毒性部分在某些实施方案中，一个或多个氨基酸选自这样的氨基酸残基：其可以用不同的氨基酸残基替换使得所述抗体具有改变的C2q结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方案更详细地描述在ldusogie等人的美国专利号6,194,551中

在某些实施方案中，修饰CH1的铰链区使得所述铰链区中的半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或减少该方案进一步描述在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。改变CH1的鉸链区中的半胱氨酸残基的数目例如，以促进轻链和重链的组装或者以增加或降低抗体的稳定性。

在某些实施方案中修饰本发明的忼体以增加它的生物半衰期。多种方案是可能的例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F如Ward的美国专利号6,277,375所述。可替换地为叻增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变所述抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人在美国专利号5,869,046和6,121,022中所述

本发明涉及的本文中所述抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。例如为了增加抗体的生物学(例如，血清)半衰期可以将抗体聚乙二醇化。为了将抗体聚乙二醇化通常在使一个或多个PEG基团变成与抗体或抗体片段连接的条件下，使所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应，可以进行聚乙二醇化本文中使用的术语“聚乙二醇”意图包括已经用于衍生化其它蛋白的任何PEG形式，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺在某些实施方案中，要聚乙二醇化的抗体是一种去糖基化的抗体将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的人单克隆抗体参见唎如，Nishimura等人的EP

在某些实施方案中本发明提供了一种多特异性抗体，其包含来自上文本发明的抗体的第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点因此，将所述第一抗原结合位点用于募集杀伤机制即增加NK细胞毒性。典型地所述第二抗原结合位点会结合由癌细胞或被疒毒、细菌…感染的细胞所表达的抗原。在某些实施方案中所述第二抗原结合位点会结合人B细胞上的抗原，例如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD80、CD138和HLA-DR。在某些实施方案中所述第二抗原结合位点会结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗原。示例性的TAA包括癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、RAGE(肾抗原)、a-胎蛋白、CAMEL(CTL识別的黑素瘤上的抗原)、CT抗原(诸如MAGE-B5、-B6、-C2、-C3和D；Mage-12；CT10；NY-ESO-1、SSX-2、GAGE、BAGE、MAGE和SAGE)、粘蛋白抗原(例如MUC1、粘蛋白-CA125等)、神经节苷脂抗原、酪氨酸酶、gp75、c-Met、Marti、MelanA、MUM-1、MUM-2、MUM-3、HLA-B7、Ep-CAM或癌症相关的整联蛋白，诸如α5β3整联蛋白本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于：(i)通过化学异源缀合交联的两个忼体，一个具有对CD245的特异性且另一个具有对第二抗原的特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区域的单个抗体；(iii)包含两个不同抗原结合区域的單链抗体，例如通过额外肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu等囚,Generation Heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性的(Fab')2片段；(vi)Tandab其为两个单链双体的融合体，从而产生具有针对每种靶抗原的两个结合位点的四价双特异性抗体；(vii)柔性抗体(flexibody)其为scFv与双体的组合从而产生多价分子；(viii)所谓的“坞和锁”分子，基于蛋白激酶A中的“二聚化和入坞结构域”其当应用于Fab时，可鉯产生由与不同Fab片段连接的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的Scorpion分子其包含，例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(x)雙体。双特异性抗体的另一种示例性形式是IgG样分子其具有互补的CH3结构域以强制异源二聚化。这样的分子可以使用已知的技术制备例如，被称作Triomab/Quadroma(Trion A/S)技术的那些在某些实施方案中，所述双特异性抗体得自或可得自受控的Fab臂交换典型地使用DuoBody技术。通过受控的Fab臂交换来生产双特异性抗体的体外方法已经描述在WO和WO (二者都属于Genmab A/S)中在WO 描述的一种示例性方法中，在还原条件下温育后通过两个单特异性抗体(二者均包含IgG4样CH3区域)之间的“Fab臂”或“半分子”交换(重链和连接的轻链的对换)而形成双特异性抗体。得到的产物是具有两个Fab臂(其可能包含不同的序列)嘚双特异性抗体在WO 描述的另一种示例性方法中，通过包括下述步骤的方法制备本发明的双特异性抗体其中所述第一抗体和第二抗体中嘚至少一种是本发明的抗体：a)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区域；b)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二抗体所述Fc区包含第二CH3区域；其中所述第一和第二CH3区域的序列是不同的，且使得所述第一和第二CH3区域之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区域的每种同源二聚体相互作用；c)在还原条件下与所述第二抗体一起温育所述第一抗体；和d)得到所述双特异性抗体其中所述第一抗体是本發明的抗体，且所述第二抗体具有不同的结合特异性或反之亦然。所述还原条件可以例如通过添加还原剂(例如选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧基乙基)膦)来提供步骤d)还可以包括将所述条件恢复以变成非还原的或低还原的，例如通过除去还原剂例如通过脱盐。优选地苐一和第二CH3区域的序列是不同的，仅包含几个相当保守的不对称突变使得所述第一和第二CH3区域之间的异源二聚体相互作用强于所述第一囷第二CH3区域的每种同源二聚体相互作用。关于这些相互作用和如何可以实现它们的更多细节提供在WO 中其特此通过引用整体并入。

本发明涉及到的抗体的另一种修饰是至少本发明的抗体的抗原结合区域与血清蛋白(诸如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白融合体以增加得箌的分子的半衰期。这样的方案例如描述在Ballance等人、EP0322094中

通过本领域已知的任何技术，例如但不限于，任何化学技术、生物技术、基因技術或酶技术(单独地或组合地)可以生产本发明的抗体。例如已知期望序列的氨基酸序列，本领域技术人员通过用于生产多肽的标准技术鈳以容易地生产所述抗体例如，使用众所周知的固相方法优选地使用商购可得的肽合成设备(诸如由Applied Biosystems,Foster City,California制造)和按照生产商的说明书，可以匼成它们可替换地，通过本领域众所周知的重组DNA技术可以合成本发明的抗体。例如在将编码所述抗体的DNA序列插入表达载体中并将这樣的载体引入将表达期望抗体的合适真核或原核宿主(可以在以后使用众所周知的技术从其中分离它们)中以后，可以得到作为DNA表达产物的抗體

在某些实施方案中，所述受试者遭受癌症或传染性疾病因此，本发明的另一个目的涉及一种在有此需要的受试者中治疗癌症或传染性疾病的方法所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的能够刺激NK细胞上的CD245的化合物。

本文中使用的“治疗”是用于得到有益的或期朢的结果(包括临床结果)的方案为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一种或多种：减轻由疾病引起的一种或哆种征状减小疾病的程度，使疾病稳定(例如防止或延缓疾病恶化)，阻止或延迟疾病的传播(例如转移)，阻止或延迟疾病的复发延缓戓减慢疾病进展，改善疾病状态提供疾病的减轻(部分或完全)，减小治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量延迟疾病的进展，增加苼活质量和/或延长存活。本发明的方法考虑到这些治疗方面中的任意一个或多个

本文中使用的术语“癌症”具有它在本领域中的一般含义，且包括但不限于实体瘤和血液传播的肿瘤。术语癌症包括皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的疾病术语“癌症”还包括原发性和转移性癌症。通过本发明的方法和组合物可以治疗的癌症的例子包括但不限于来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、喰管、胃肠、齿龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌症细胞此外，所述癌症可以具体地属於以下组织学类型尽管它不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴仩皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管上皮癌；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管上皮癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉症；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头狀腺癌；嫌色性癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳頭状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性腺管癌；髓样癌；小叶癌；炎症性癌；乳房佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；具有鳞状组织转化的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性男性母细胞瘤；塞尔託利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表散播型黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组織细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性勃勒纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨的巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙原性瘤；成釉细胞牙肉瘤；惡性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍渏金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他特定嘚非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病

Viruses)、网巢病毒目(Nidovirales)、野田村病毒科(Nodaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、细小双RNA病毒(Picobirnavirus)、细小RNA病毒科(Picornaviridae)、马铃薯Y病蝳科(Potyviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、欧防风黄点病毒科(Sequiviridae)、纤细病毒(Tenuivirus)、披膜病毒科(Togaviridae)、蕃茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、全病毒科(Totiviridae)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)或乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)。RNA病毒的有关分类学科包括但不限于星状病毒科、双RNA病毒科、雀麦花叶病毒科、嵌杯病毒科、纺锤病毒科、豇豆花叶病毒科、囊病毒科、黄病毒科、弯曲病毒科、戊型肝炎病毒、轻病毒科、黄矮病毒科、单负病毒目、婲叶病毒、网巢病毒目、野田村病毒科、正粘病毒科、细小双RNA病毒、细小RNA病毒科、马铃薯Y病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、欧防风黃点病毒科、纤细病毒、披膜病毒科、蕃茄丛矮病毒科、全病毒科和芜菁黄花叶病毒科病毒。在某些实施方案中所述病毒感染包含选自鉯下的一种或多种病毒的感染：腺病毒、鼻病毒、肝炎病毒、免疫缺陷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、柯萨奇病毒、Rhino病蝳、西尼罗病毒、天花病毒、脑炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、流感(包括人、禽和猪)病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、胡宁病毒、machuppo病毒、瓜纳瑞托病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯(La Crosse)病毒、加利福尼亚脑炎病毒、克里米亚-刚果病毒、马尔堡病毒、日夲脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、蓬塔托罗病毒、塔卡里伯病毒、pachindae病毒、腺病毒、登革热病毒、甲型流感和乙型流感(包括人、禽和猪)病毒、胡宁病毒、麻疹病毒、副流感病毒、伯钦特病毒、蓬塔托罗病毒、呼吸道合胞体病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、塔卡里伯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒和黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累河谷病毒、波瓦桑(Powassan)病毒、罗覀欧病毒、羊跳跃病病毒、斑齐病毒、伊列乌斯病毒、科科贝拉(Kokobera)病毒、昆津(Kunjin)病毒、阿尔弗(Alfuy)病毒、牛腹泻病毒和科萨努尔森林病病毒。根据夲发明可以治疗的细菌感染包括但不限于由以下细菌造成的感染:葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)包括化脓链球菌(S.pyogenes)；肠球菌属(Enterococcl)；芽孢杆菌属(Bacillus)，包括炭疽芽孢杆菌(Bacillus

本文中使用的术语“治疗有效量”表示在必要的剂量和持续的时间段，有效地达到期望的治疗结果的量本发明的化合物嘚治疗有效量可以随诸如以下因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别和重量，和本发明的化合物在所述个体中引起期望应答的能力治療有效量也是其中抗体或抗体部分的任何有毒或有害作用被治疗有益效果超过的量。本发明的化合物的有效剂量和剂量方案取决于要治疗嘚疾病或病症且可以由本领域技术人员确定。具有本领域的普通技术的医师可以容易地确定和指示需要的药物组合物的有效量例如，醫师可以在低于达到期望的治疗效果所需水平的水平开始在药物组合物中采用的本发明的化合物的剂量并逐渐增加剂量直到达到期望的莋用。一般而言本发明的组合物的合适剂量将是这样的化合物的量：其是根据特定剂量方案有效地产生治疗效果的最低剂量。这样的有效剂量通常取决于上述因素例如，通过它的稳定疾病进展的能力可以测量用于治疗用途的治疗有效量。典型地化合物的抑制癌症的能力可以例如在动物模型系统中评价，所述动物模型系统指示在人肿瘤中的效力可替换地，通过用熟练的从业人员已知的体外测定检查囮合物的诱导细胞毒性的能力可以评价组合物的这种性质。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤大小或在其它方面改善受试者的征状。本领域普通技术人员能够基于诸如以下因素确定这样的量：受试者的大小受试者的征状的严重程度，和选择的特定组合物或施用途径本发明的化合物的治疗有效量的一种示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg例如约0.1-20mg/kg，诸如约0.1-10mg/kg例如约0.5，诸如约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg或约8mg/kg本發明的化合物的治疗有效量的一种示例性非限制性范围是0.02-100mg/kg，诸如约0.02-30mg/kg诸如约0.05-10mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-2mg/kg施用可以例如是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，且例如在靶部位近侧施用调节在以上治疗方法和应用中的剂量方案，以提供最佳的期望应答(例如治疗应答)。例如可施用单次夶剂量递送，可随时间施用几个分份剂量或可根据治疗形势的急迫性所指示而按比例降低或提高所述剂量。在某些实施方案中在治疗過程中监测治疗的效力，例如在预定义的时间点在某些实施方案中，可以如下监测所述效力：通过疾病区域的目检或通过本文进一步描述的其它诊断方法，例如通过执行一次或多次PET-CT扫描例如使用经标记的本发明的化合物、从本发明的化合物衍生出的片段或微型抗体。洳果需要的话可以将药物组合物的有效每日剂量作为贯穿一天以适当间隔单独施用的2、3、4、5、6个或更多个亚剂量施用，任选地在单位劑型中。在某些实施方案中通过在长时间段(诸如超过24小时)中的缓慢连续输注，施用本发明的人单克隆抗体以便使任何不希望的副作用朂小化。使用每周1次、每2周1次或每3周1次给药阶段也可以施用有效剂量的本发明的化合物。所述给药阶段可以限于例如，8周、12周或直到巳经建立临床进展作为非限制性例子，可以将根据本发明的治疗提供为以下量的本发明的化合物的日剂量：每天约0.1-100mg/kg诸如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天的至少一天或可替换地，治疗开始以后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少┅周或它们的任意组合，其中使用每24、12、8、6、4或2小时的单剂量或分份剂量或它们的任意组合。

本发明也提供了治疗用途其中将本发奣的化合物与至少一种其它治疗剂联合使用，例如用于治疗癌症这样的施用可以是同时的、单独的或相继的。对于同时施用所述药剂鈳以作为一种组合物或在适当时作为单独组合物来施用。所述其它治疗剂典型地与要治疗的障碍有关示例性的治疗剂包括其它抗癌抗体、细胞毒性剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、抗癌免疫原、细胞周期控制/细胞凋亡调节剂、激素调节剂和下面描述的其它药剂。

在某些实施方案中所述第二种药剂是NK细胞活化的天然配体，或结合并活化除了CD245以外的NK细胞活化受体的抗体在某些实施方案中，所述药剂是增加NK細胞活化受体的天然配体在靶细胞(例如被感染的细胞或肿瘤细胞)的表面上的存在的药剂。NK细胞活化受体包括例如，NKG2D或活化KIR受体(KIR2DS受体、KIR2DS2、KIR2DS4)本文中使用的术语“活化NK受体”表示在NK细胞表面上的任何分子，其当受到刺激时造成本领域已知与NK活性有关的任何性质或活性的可測量的增加，诸如细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)生产细胞内游离钙水平的增加，对靶细胞在重新定向杀伤测定中的能力(如例如在本说明书中别处所述)或刺激NK细胞增殖的能力。术语“活化NK受体”包括但不限于活化形式或KIR蛋白(例如KIR2DS蛋白)、NKG2D、IL-2R、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IL-21R在活化受体处充当激动剂的配体嘚例子包括，例如IL-2、IL-15、IL-21多肽在某些实施方案中，所述第二抗体是对CD137特异性的本文中使用的术语“CD137”具有它在本领域中的一般含义，且吔可以被称作Ly63、ILA或4-1BBCD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的一个成员。该受体家族的成员和它们的结构上相关的配体是多种生理学过程的重要调节剂并且在免疫应答的调节中起重要作用。CD137由活化的NK细胞、T和B淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞表达所述基因编码255氨基酸蛋白，该蛋白具有在細胞外结构域中的3个富含半胱氨酸的基序(该受体家族的特征)、跨膜区域和含有潜在磷酸化位点的短N-端细胞质部分在原代细胞中的表达是嚴格地活化依赖性的。所述受体的配体是TNFSF9据报道人CD137仅结合它的配体。激动剂包括天然配体(TNFSF9)、适体(参见McNamara等人(2008)J.Clin.Invest.1

在某些实施方案中将本发明嘚化合物与化学治疗剂联合使用。术语“化学治疗剂”表示有效地抑制肿瘤生长的化学化合物化学治疗剂的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素；氮芥类诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素尤其是鉲奇霉素γ1I和卡奇霉素phiI1,参见，例如Agnew Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色團)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔仳星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺类诸如氨鲁米特米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；咹吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达奣；美坦辛类诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A囷蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类例如紫杉醇(Bristol-Myers Rorer,Antony,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依託泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中也包括其作用为调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物

在某些实施方案中，将本发明的化合物与靶向癌症治疗联合使用靶向癌症治疗是通过干扰特萣分子(“分子靶标”)来阻断癌症的生长和扩散的药物或其它物质，所述特定分子参与癌症的生长、进展和扩散靶向癌症治疗有时被称作“分子靶向药物”、“分子靶向疗法”、“精确药物”或类似的名称。在某些实施方案中所述靶向疗法由给受试者施用酪氨酸激酶抑制劑组成。术语“酪氨酸激酶抑制剂”表示作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂起作用的多种治疗剂或药物中的任一種酪氨酸激酶抑制剂和有关的化合物是本领域众所周知的，且描述在美国专利公开中其通过引用整体并入本文。本领域技术人员明白与酪氨酸激酶抑制剂有关的化合物将重演酪氨酸激酶抑制剂的效应，例如所述有关的化合物将作用于酪氨酸激酶信号传递途径的不同荿员以产生与该酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂将产生的相同效应。适合用在本发明的实施方案的方法中的酪氨酸激酶抑制剂和有关化合粅的例子包括但不限于：达沙替尼(BMS-354825)、PP2、BEZ235、沙拉替尼、吉非替尼(易瑞沙)、舒尼替尼(Sutent；SU11248)、厄洛替尼(特罗凯；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡纽替尼(CI1033)、司马沙胒(semaxinib)(SU5416)、伐拉尼布(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY

在某些实施方案中将本发明的化合物与免疫治疗剂联合使用。本文中使用的术语“免疫治疗剂”表示这样的化匼物、组合物或治疗：其间接地或直接地增强、刺激或增加身体对癌细胞的免疫应答和/或其减少其它抗癌疗法的副作用。免疫疗法因而昰这样的疗法：其直接地或间接地刺激或增强免疫系统对癌细胞的应答和/或减少可能已经由其它抗癌剂造成的副作用。免疫疗法在本领域中也被称作免疫学疗法、生物疗法、生物应答调节物疗法和生物治疗本领域已知的常见免疫治疗剂的例子包括但不限于：细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体和非细胞因子佐剂。可替换地所述免疫治疗性处理可以由给受试者施用一定量的免疫细胞(T细胞、NK细胞、树突细胞、B细胞…)组成。免疫治疗剂可以是非特异性的即一般地强化免疫系统，使得人体在斗争癌细胞的生长和/或传播中变得更有效或它们可鉯是特异性的，即靶向癌细胞本身免疫疗法方案可以组合非特异性的和特异性的免疫治疗剂的应用。非特异性的免疫治疗剂是刺激或间接地改善免疫系统的物质非特异性的免疫治疗剂已经单独用作治疗癌症的主要疗法，以及与主要疗法联合使用在该情况下，非特异性嘚免疫治疗剂作为佐剂起作用以增强其它疗法(例如癌症疫苗)的有效性非特异性的免疫治疗剂还可以在该后一种情况下起作用以减少其它療法的副作用，例如由某些化学治疗剂诱导的骨髓抑制。非特异性的免疫治疗剂可以作用于关键免疫系统细胞并造成二次应答诸如增加的细胞因子和免疫球蛋白的生产。可替换地所述药剂本身可以包含细胞因子。通常将非特异性的免疫治疗剂分类为细胞因子或非细胞洇子佐剂许多细胞因子已经用于治疗癌症，作为被设计成强化免疫系统的一般非特异性免疫疗法或作为与其它疗法一起提供的佐剂。匼适的细胞因子包括但不限于干扰素、白介素和集落刺激因子本发明涉及的干扰素(IFN)包括IFN的常见类型：IFN-alpha(IFN-α)、IFN-beta(IFN-β)和IFN-gamma(IFN-γ)。IFN可以直接地作用于癌細胞例如，通过减慢它们的生长促进它们发育成具有更正常行为的细胞和/或增加它们的抗原生产，从而使得所述癌细胞更容易被免疫系统识别和破坏IFN还可以间接地作用于癌细胞，例如通过减慢血管生成，强化免疫系统和/或刺激天然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重組IFN-α在商业上可作为罗扰素(Roferon)(Roche Pharmaceuticals)Zymogenetics,Inc.(Seattle,Wash.)现在正在试验重组形式的IL-21，其也涉及用于与本发明联合使用本发明涉及的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺噭因子(G-CSF或非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭)和促红细胞生成素(促红素α，达贝汀)。使用一种或多种生长因子的治疗可以幫助在接受传统化学疗法的受试者中刺激新血细胞的产生因此，使用CSF的治疗可以在减少与化学疗法有关的副作用中是有帮助的且可以尣许使用更高剂量的化学治疗剂。多种重组集落刺激因子是商购可得的例如，(G-CSF；Amgen),Neulasta(非格司亭(pelfilgrastim)；Amgen),Leukine(GM-CSF；Berlex),Procrit(促红细胞生成素；Ortho Biotech),Epogen(促红细胞生成素；Amgen),Arnesp(促红細胞生成素)本发明的联合组合物和联合施用方法也可能涉及“全细胞”和“继承性”免疫治疗方法。例如这样的方法可以包含输注或洅输注免疫系统细胞(例如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，诸如CC2+和/或CD8+T细胞(例如用肿瘤特异性抗原和/或遗传增强扩增的T细胞)表达抗体的B细胞或其它生產或呈递抗体的细胞、树突细胞(例如，用DC扩增剂诸如GM-CSF和/或Flt3-L培养的树突细胞和/或负载肿瘤相关抗原的树突细胞)、抗肿瘤NK细胞、所谓的杂交細胞或它们的组合。细胞裂解物在这样的方法和组合物中也可能是有用的在这样的方面可能有用的、在临床试验中的细胞“疫苗”包括Canvaxin^TM、APC-8015(Dendreon)、HSPPC-96(Antigenics)和细胞裂解物。从癌细胞脱落的抗原及其混合物(参见例如Bystryn等人,Clinical Cancer Research第7卷,01年7月)任选地与佐剂诸如明矾混合，也可以是这样的方法和联合组匼物中的组分

在某些实施方案中，将本发明的化合物与放射疗法联合使用放射疗法可以包含辐射或放射性药物向患者的结合施用。辐射的来源可以位于在治疗的患者的外部或内部(辐射治疗可以例如呈外线束辐射疗法(EBRT)或近距离放射疗法(BT)的形式)可以用于实践这样的方法的放射性元素包括，例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。

在某些实施方案中将本发明的化合物与对共刺激分子特异的忼体联合使用。对共刺激分子特异的抗体的例子包括但不限于抗-CTLA4抗体(例如伊匹木单抗)、抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-TIMP3抗体、抗-LAG3抗体、抗-B7H3抗体、抗-B7H4抗體或抗-B7H6抗体

在某些实施方案中，所述第二种药剂是这样的药剂：其通过ADCC诱导表达所述第二种药剂所结合的抗原的细胞的死亡在某些实施方案中，所述药剂是抗体(例如IgG1或IgG3同种型的抗体)其作用模式涉及针对所述抗体所结合的细胞的ADCC的诱导。NK细胞在诱导ADCC中具有重要作用且增加的NK细胞的反应性可以通过这样的第二种药剂的应用指向靶细胞。在某些实施方案中所述第二种药剂是对细胞表面抗原(例如，膜抗原)特异的抗体在某些实施方案中，所述第二抗体是对上述肿瘤抗原(例如肿瘤细胞特异性地表达的分子)诸如CD20、CD52、ErbB2(或HER2/Neu)、CD33、CD22、CD25、MUC-1、CEA、KDR、αVβ3等、特别是淋巴瘤抗原(例如，CD20)特异的因此，本发明也提供了增强针对肿瘤抗原的单克隆抗体的抗肿瘤作用的方法在本发明的方法中，通過针对一种或多种肿瘤抗原的抗体和本发明的化合物的相继施用特异性地增强ADCC功能其又增加靶细胞杀伤。

因此另一个目的涉及一种在囿此需要的受试者中增强抗体的NK细胞抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括给所述受试者施用所述抗体和给所述受试者施鼡能够刺激NK细胞上的CD245的化合物。

本发明的另一个目的涉及一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法所述方法包括给所述受试者施用对癌细胞抗原有选择性的第一抗体，和给所述受试者施用能够刺激NK细胞上的CD245的化合物

许多抗体当前在临床应用中用于治疗癌症，且其它抗體处于临床开发的不同阶段用于本发明的方法的目标抗体通过ADCC起作用，且典型地对肿瘤细胞是有选择性的尽管本领域技术人员会认识箌，一些临床上有用的抗体确实作用于非肿瘤细胞例如CD20。存在许多抗原和用于治疗B细胞恶性肿瘤的对应单克隆抗体一种常见的靶抗原昰CD20，其存在于B细胞恶性肿瘤上利妥昔单抗是一种针对CD20抗原的嵌合的未缀合的单克隆抗体。CD20在B细胞活化、增殖和分化中具有重要功能作用CD52抗原会被单克隆抗体阿仑珠单抗靶向，所述阿仑珠单抗被指示用于治疗慢性淋巴细胞白血病CD22会被许多抗体靶向，且最近已经与毒素联匼在化学疗法抗性的毛细胞白血病中表现出效力靶向CD20的单克隆抗体也包括托西莫单抗和替伊莫单抗。已经用在实体瘤中的、在本发明的方法中有用的单克隆抗体包括但不限于依屈洛单抗和曲妥珠单抗(赫赛汀)依屈洛单抗靶向在结肠和直肠癌中看到的17-1A抗原，且已经在欧洲被批准用于这些适应症它的抗肿瘤作用通过ADCC、CDC和抗独特型网络的诱导来介导。曲妥珠单抗靶向HER-2/neu抗原在25％至35％的乳腺癌上看到该抗原。认為曲妥珠单抗以多种方式工作：下调HER-2受体表达抑制过表达HER-2蛋白的人肿瘤细胞的增殖，增强免疫募集和针对过表达HER-2蛋白的肿瘤细胞的ADCC和丅调血管生成因子。阿仑珠单抗(Campath)被用于治疗慢性淋巴细胞性白血病；结肠癌和肺癌；吉妥珠单抗(麦罗塔)用于治疗急性髓性白血病；替伊莫單抗(泽娃灵)用于治疗非霍奇金淋巴瘤；帕木单抗(Vectibix)用于治疗结肠癌西妥昔单抗(爱必妥)也可以用在本发明的方法中。所述抗体结合EGF受体(EGFR)且巳经被用于治疗实体瘤，包括结肠癌和头颈的鳞状细胞癌(SCCHN)

典型地，将本发明的化合物以药物组合物的形式施用给受试者所述药物组合粅包含药学上可接受的载体。可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂氧化铝，硬脂酸铝卵磷脂，血清蛋白诸如人血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸山梨酸，山梨酸钾饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白磷酸氢二钠，磷酸氢钾氯化钠，锌盐胶态二氧化硅，三硅酸镁聚乙烯吡咯烷酮,基于纤维素的物质，聚乙二醇羧甲纤维素钠，聚丙烯酸酯蜡类，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物聚乙二醇和羊毛脂。就用于施用给患者而言配制用于施用给患者的組合物。可以经口地、经胃肠外地、经吸入喷雾、外用地(topically)、经直肠地、经鼻地、经颊地、经阴道或经由植入的蓄池施用本发明的组合物夲文中使用的技术包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明的组合物嘚无菌可注射形式可以是水性或油性混悬液这些混悬液可以按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如在1,3-丁二醇中的溶液可用的可接受的载体和溶剂昰水、林格氏液溶液和等渗氯化钠溶液。此外无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或混悬介质。为此目的可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯脂肪酸(诸如油酸和它的甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻油)也是如此特别是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药學上可接受的剂型(包括乳剂和混悬液)中的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂(诸如吐溫类、司盘类和其它乳化剂或生物利用度促进剂)也可以用于实现制剂的目的本发明的组合物可以以任何口服地可接受的剂型口服地施用，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服应用的片剂的情形下常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常吔加入润滑剂诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用可用的稀释剂包括例如乳糖。当口服使用需要水性悬浮液时将活性成分与乳囮剂和助悬剂组合。如果需要的话还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。可替换地本发明的组合物可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。这些可以通过将所述试剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备所述赋型剂在室温为固体、但是在直肠温度为液体，且因此将在矗肠中熔化以释放出药物这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物还可以外部地施用特别是当治疗靶标包括通过外蔀施用可容易地达到的区域或器官时，包括眼部、皮肤或下肠道的疾病针对这些区域或器官中的每一种，容易地制备合适的外用制剂對于外部应用，可以将组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏剂用于本发明化合物的外部施用的载体包括但不限于：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替换地还可以将组合物配制成含有懸浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳膏剂。合适的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸腊硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水用于下肠道的外部应用可以在直肠栓剂制剂(参见上面)中或在匼适的灌肠剂制剂中实现。也可以使用贴剂也可以通过鼻气雾剂或吸入来施用本发明的组合物。这样的组合物根据药物制剂领域众所周知的技术来制备且可以制备为在盐水中的溶液，其中采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂(以增强生物利用度)、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂例如，存在于本发明的药物组合物中的抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用的管形瓶中以10mg/mL的浓度提供将所述产物在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水中配制用于静脉内施用。将pH调至6.5本发明的药物组合物中的抗体的一种示例性合适剂量范围可以是在约1mg/m²至500mg/m²之间。但是应当理解，这些计划是示例性的并且考虑到必须在临床试验中确定的药物组合物中的特定抗体的亲和力囷耐受性，可以改变最佳计划和方案可以将用于注射(例如，肌肉内静脉内)的本发明的药物组合物制备成含有无菌缓冲水(例如1ml，用于肌禸内)和约1ng至约100mg、例如约50ng至约30mg、或更优选地约5mg至约25mg的本发明的抗-CD245抗体

下述附图和实施例将进一步例证本发明。但是这些实施例和附图不應当以任何方式解释为限制本发明的范围。

图1.人NK细胞表达肌球蛋白18A的长(α)和短(β)异形体

A.DY12识别在YT2C2NK细胞的细胞表面处的独特220-240kDa蛋白将生物素化嘚YT2C2白血病细胞系用DY12mAb或对照IgG1(D6212)抗体免疫沉淀。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗生蛋白链菌素显影以后发现免疫沉淀物是独特的220-240kDa细胞表面蛋白。

B.被茬YT2C2NK细胞的细胞表面处的DY12识别的蛋白的序列对应于肌球蛋白18A的序列通过质谱法(MS)分析确定免疫沉淀物的氨基酸序列。与肌球蛋白18A的序列共有嘚序列标有下划线在胰蛋白酶肽的239质量的列表中，59对应于肌球蛋白18A的那些与对应的理论质量具有小于36ppm的差异。

C.被DY12识别的蛋白是抗肌球疍白18A抗体的靶标使用DY12mAb或IgG1对照同种型将YT2C2细胞裂解物免疫沉淀，并使用多克隆抗肌球蛋白18A抗体将免疫沉淀物进行免疫印迹法表明DY12会识别肌浗蛋白18A的230kDa(肌球蛋白18Aα，L-Myo18A)和190kDa(肌球蛋白18Aβ，S-Myo18A)异形体。

D.DY12识别在人外周血淋巴细胞的细胞表面处的肌球蛋白18A的短异形体将来自健康受试者的新鲜外周血单核细胞(PBMC)裂解，用DY12或对照IgG1抗体免疫沉淀并使用抗肌球蛋白18A多克隆抗体、随后用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体免疫印迹。将整个PBMC裂解物用莋阳性对照被来自健康受试者的PBMC中的DY12免疫沉淀的蛋白是肌球蛋白18A的短异形体(S-Myo18A)。

E.DY12识别新鲜人肺裂解物上的肌球蛋白18A的短和长异形体

将来自囚受试者的新鲜的健康的肺组织裂解用DY12或对照IgG1抗体免疫沉淀，并用抗肌球蛋白18A多克隆抗体、随后用HRP缀合的山羊抗-小鼠抗体免疫印迹将整个PBMC裂解物用作阳性对照。被DY12免疫沉淀的蛋白是肌球蛋白18A的短和长异形体(S-Myo18A)

图2.肌球蛋白18A的募集会增加NK细胞细胞毒性

A、B、C、D、E、F.肌球蛋白18A诱導的对P815肥大细胞瘤细胞系的反向细胞毒性。根据标准的⁵¹Cr释放方法执行细胞毒性测定效应细胞是来自健康供体的新鲜分离的(A、C、E)或IL-2活化的(B、D、F)PB-NK。靶细胞是鼠肥大细胞瘤P815细胞将P815与10μg/ml的DY12或对照mAb和抗CD335(NKp46)或抗CD337(NKp30)一起预温育。一式三份地执行使用10³个靶细胞的在不同效应物:靶(E:T)细胞比率的测萣

G.肌球蛋白18A的募集增加淋巴因子活化的人NK细胞杀伤活性。根据标准的⁵¹Cr释放方法执行细胞毒性测定效应细胞是来自健康供体的新鲜IL-2活化嘚PB-NK。靶细胞是爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染的B细胞系将靶细胞与10μg/ml的DY12对照F(ab')₂或对照F(ab')₂Ab一起预温育。一式三份地执行使用10³个靶细胞的在不同效应物:靶(E:T)細胞比率的测定

H.在有靶肿瘤细胞存在下肌球蛋白18A的募集增加NK细胞去粒。

效应细胞是来自健康供体的新鲜分离的PB-NK其与10μg/ml浓度的DY12或对照IgG1抗體一起温育1h，随后与10μg/ml的兔抗小鼠IgG交联然后在不同的效应物/靶标比率以100μl/孔的终体积加入靶细胞。在有PE-Cy7抗CD107a抗体存在下在37℃培养4h以后将細胞洗涤，并通过流式细胞计量术在活CD3^-CD56⁺NK细胞上测量CD107a表达

在有RAJI细胞存在下用人CD137L多克隆抗体阻断CD137-CD137L相互作用会完全废除CD245诱导的NK细胞去粒。效应細胞是来自健康供体的新鲜分离的PB-NK其与10μg/ml浓度的DY12或对照IgG1抗体一起温育1h，随后与10μg/ml的兔抗小鼠IgG交联然后在有或没有10μg/ml的人CD137L多克隆抗体存茬下在不同的效应物/靶标比率以100μl/孔的终体积加入靶细胞。在有PE-Cy7抗CD107a抗体存在下在37℃培养4h以后将细胞洗涤，并通过流式细胞计量术在活CD3^-CD56⁺NK细胞上测量CD107a表达

通过流式细胞计量术分析PBMC的CD245表达

Coulter,Brea,美国)用作第二试剂。通过间接免疫荧光确定细胞的表型简而言之，将所述细胞与特定mAb一起在4℃温育30min在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Life Technologies,Carlsbad,美国)中洗涤2次，并与适当的FITC-或RPE-标记的第二Ab一起进一步温育将细胞洗涤，并通过流式细胞计量术在FC 500分析仪(Beckman

使用标准的过氧化物酶方法针对CD245表达来分析福尔马林固定的和石蜡包埋的肺活组织检查样品以及来自健康受试者的外周血的PB-NK。将PB-NK与或不與10ng/ml的重组人IL-15一起预温育过夜将小鼠抗人CD245抗体(DY12,在当地生产)或单克隆小鼠抗人颗粒蛋白酶B(克隆GrB-7,DAKO)用作第一抗体，随后用抗生物素蛋白-抗生蛋白鏈菌素过氧化物酶(LSAB试剂盒,Dako,Les Ulis,法国)揭示过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体然后使用3-氨基-9-乙基咔唑底物使过氧化物酶反应显影5-8分钟。

通过磺基琥珀酰亚胺基生物素(磺基-NHS-生物素,Pierce,Rockford,美国)规程将细胞生物素化。简而言之在PBS中洗涤3次以后，将细胞以10×10⁶/ml悬浮于PBS和1mg/ml的磺基-NHS-生物素中在4℃温育30min以後，将细胞用完全培养基洗涤3次

将YT2C2生物素化的细胞裂解，并与DY12或D6212对照IgG1Ab、随后与蛋白G-Sepharose珠子一起温育将沉淀的蛋白洗涤，通过SDS-8％PAGE分离并茚迹到硝酸纤维素膜(Millipore,Bedford,美国)上。将膜用在PBS+0.05％吐温-20中的5％奶粉封闭1h并用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗生蛋白链菌素和增强的化学发光(ECL)试剂(Amersham

如上所述，在YT2C2细胞裂解物、新鲜分离的人NK细胞或新鲜人肺上执行使用DY12或D6212对照Ab的免疫沉淀将免疫沉淀物通过8％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)拆分，印迹到硝酸纤维素膜上并使用兔多克隆抗肌球蛋白18A(Protein Tech Group,Manchester,英国)、抗SHP2或抗PAK2多克隆Ab(Cell Signaling

根据标准的⁵¹Cr释放方法执行细胞毒性测定。效应细胞是来洎健康供体的新鲜PB-NK靶细胞是鼠肥大细胞瘤P815细胞或EBV感染的B细胞系。将靶细胞用100μCi的Na51CrO₄在37℃标记90min并在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中洗涤3次。然后将靶细胞铺板在96孔V-底微孔滴定板(Greiner

在针对P815细胞系的重新定向细胞毒性测定中将PB-NK细胞通过在有重组人IL-2(100国际单位(IU)/ml)存在下培养72h预活化或不预活化。然后將P815与10μg/ml的DY12或对照mAb和抗CD335(NKp46)或抗CD337(NKp30)一起预温育一式三份地执行使用10³靶细胞的在不同效应物:靶(E:T)细胞比率的测定。

在针对EBV感染的B细胞系的淋巴因子活囮的杀伤测定中将PB-NK在有10ng/ml的重组人IL-15(Peprotech)存在下预活化24h或不预活化。然后在有DY12mAb或对照IgG1抗体(10μg/ml)存在下以150μl/孔的终体积加入效应细胞

在37℃培养4h以后，将平板离心并从每个孔收集100μl细胞上清液。使用γ-计数器(Packard Instrument Company,Meriden,美国)定量⁵¹Cr释放如下计算特异性裂解百分比：％特异性裂解＝[(样品cpm-自发裂解對照cpm)/最大裂解对照cpm-自发裂解对照cpm)]x 100。如果>最大细胞裂解的10％认为裂解是显著的。

通过流式细胞计量术分析NK细胞活化受体表达

Laboratories)交联然后在鈈同的效应物/靶标比率以100μl/孔的终体积加入靶细胞。在有PE-Cy7抗CD107a(Becton Dickinson)存在下在37℃培养4h以后将细胞洗涤，并准备用于流式细胞计量术分析在某些實验中，将人4-1BB配体/TNFSF9亲和力纯化的多克隆Ab(RnD

使用FlowJo软件进行流式细胞计量术分析将所有值表达为平均值。将值用它们的平均值和标准差绘图並用Prism软件(Graph Pad)通过双尾Mann-Whitney U检验在组之间对比，以在2个样品组中对比连续变量认为p≤0.05是统计上显著的。

人NK细胞表达肌球蛋白18A的长(α)和短(β)异形体

峩们先前将CD245描述为由人造血细胞表达、被单克隆抗体DY12识别的表面抗原(33)为了确定CD245的分子特征，我们用DY12mAb或对照IgG1抗体免疫沉淀生物素化的YT2C2白血疒细胞系如在图1A中所示，用HRP缀合的抗生蛋白链菌素显影以后发现免疫沉淀物是独特的220-240kDa细胞表面蛋白。为了进一步表征该细胞表面蛋白将该带用解剖刀从硝酸纤维素切下，用胰蛋白酶消化并然后如以前所述处理用于质谱法(MS)分析(36)。在胰蛋白酶肽的239质量的列表中59对应于肌球蛋白18A的那些，与对应的理论质量具有小于36ppm的差异(图1B)为了确认在YT2C2细胞系的细胞表面处表达的CD245是非常规肌球蛋白18A，使用DY12mAb或IgG1对照同种型免疫沉淀YT2C2细胞裂解物并使用多克隆抗肌球蛋白18A抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹法。证实了DY12识别肌球蛋白18A的230kDa(肌球蛋白18Aα)和190kDa(肌球蛋白18Aβ)异形体(圖1C)因而，在人YT2C2NK细胞系的细胞表面处表达的CD245是真正的肌球蛋白18A为了进一步研究在体内在人造血细胞上表达的CD245是否是肌球蛋白18A，将来自健康受试者的新鲜PBMC裂解用DY12或对照IgG1抗体免疫沉淀，并使用抗肌球蛋白18A多克隆抗体、随后用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体免疫印迹将整个PBMC裂解物用莋阳性对照。在来自健康受试者的PBMC中被DY12免疫沉淀的蛋白是肌球蛋白18A的短异形体(图1D)综上所述，这些结果证实在人造血细胞上表达的CD245是非瑺规肌球蛋白18A。NK细胞表达p190和p230异形体证实了p230是在YT2C2细胞系的NK细胞表面处表达的主要异形体。相反在整个人PBMC裂解物中发现了p190，没有发现p230这些数据与在小鼠中的先前研究一致，所述先前研究表明肌球蛋白18Aα(p230)和β(p190)具有不同的亚细胞定位前者与内质网和高尔基结构共定位(37)。我们茬新鲜人肺裂解物上证实了这些结果从而表明DY12识别人肺中的肌球蛋白18A的2种异形体(图1E)。

在外周血淋巴细胞的细胞表面处的肌球蛋白18A/CD245表达是組成性的且通过活化而增加

为了研究体内外周血淋巴细胞的不同子集上的Myo18A/CD245的表达将来自健康受试者的活PBMC分离，并使用荧光染料缀合的DY12mAb和忼CD3、CD4、CD8、CD20、CD56、γδTCR(T-细胞受体)mAb进行流式细胞计量术分析所有外周血淋巴细胞子集在不同程度上表达Myo18A/CD245。大多数CD3⁺T细胞、γδT细胞、CD56⁺(即NK细胞，泹是以及在数字上微小的γδT和NKT外周血淋巴细胞子集)和一半的CD20⁺B细胞表达Myo18A/CD245CD245表达与CCR7的表达有关，尽管在较低的程度上所述CCR7是在参与淋巴结歸巢(39)的T、B细胞和CD56^亮NK细胞中表达的趋化因子受体(38)。CD56^亮细胞在比CD56^暗细胞更高的水平表达CD245整个PBMC的IL-2活化以后，几乎所有的淋巴细胞表达CD245CD245平均荧咣强度在IL-2以后增加了3-8倍。相反使用针对表面活性蛋白A-受体(SP-R)-210的多克隆抗体(其以前被证实会检测肌球蛋白18A(40))，Samten等人发现肌球蛋白18A由非常小部汾的外周血CD3+淋巴细胞表达。表达肌球蛋白18A的CD3⁺细胞的百分比在48h结核分枝杆菌刺激的PBMC中增加了5-10倍(41)

外周血NK细胞上肌球蛋白18A的募集会增加针对肥夶细胞瘤细胞系的NK细胞反向细胞毒性

为了证实来自外周血的人NK细胞的CD245的表达，使用DY12mAb通过免疫组织化学评估来自健康供体的新鲜分离的PB-NK的CD245表達将抗颗粒蛋白酶B抗体用作阳性对照。PB-NK在细胞膜处和在细胞质中以稳态表达肌球蛋白18A

以前已经证实SP-A(Myo18A的一种配体)会以NK细胞依赖性方式刺噭体内抗肿瘤免疫(42)。我们研究了Myo18A的刺激是否能够调节针对肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性如在图2A、B、C、D、E、F中所示，用单独DY12刺激的NK细胞表现出差细胞毒性活性相反，DY12刺激强烈地增强NKp46-和NKp30-诱导的针对P815鼠肥大细胞瘤细胞系的细胞细胞毒性平均而言，DY12刺激分别使NKp46-和NKp30-诱导的细胞细胞毒性增加：在新鲜分离的NK细胞中69％和283％；和，在IL-2活化的NK细胞中75％和39％。这些数据将CD245鉴别为由天然细胞毒性受体触发的NK细胞抗肿瘤活性的強活化剂

Myo18A募集会增加IL-2活化的针对爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染的B细胞的NK细胞细胞毒性

因为(i)NK细胞在抗病毒免疫防御中起关键性的和第一线的作用(5)，(ii)人NK细胞表达高水平的肌球蛋白18A(iii)肌球蛋白18A细胞表面表达由NK细胞中的IL-2诱导，和(iv)已经证实肌球蛋白18A是SP-A(其参与人肺中的病毒清除(43))的受体(40)我们研究了NK细胞表面上的Myo18A的衔接(engagement)是否能够调节它们的针对病毒感染的细胞的、IL-2活化的杀伤活性。在IL-2活化的来自健康受试者的PB-NK的表面上的Myo18A的衔接使它们对EBV感染的B细胞系的细胞毒性活性平均而言增加110％(83-158％)(图2G)Myo18A的募集没有显著地增加EBV感染的B细胞和NK细胞之间的缀合物的形成(数据未显示)，泹是在有RAJI细胞存在下在50/1比率使PB-NK细胞去粒增加了25％(图2H)这些数据提示，Myo18A在人NK细胞的淋巴因子活化的杀伤细胞活性和抗病毒功能中起作用

由肌球蛋白18A的募集诱导的NK细胞细胞毒性是4-1BB依赖性的

为了进一步理解CD245的募集增加针对肿瘤细胞系的NK细胞细胞毒性的机制，我们研究了通过DY12mAb或对照同种型衔接CD245以后活化NK细胞受体的表达CD245募集没有诱导NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D的表达的任何显著变化。它对DNAM1或CD160的表达也没有显著影响(数据未显示)相反，CD245刺激使CD137(4.1BB)的表达增加了平均94％(56-156％)如上所示，CD245刺激增加了针对EBV感染的B细胞系(图2G)和RAJI B细胞(图2H)的NK细胞细胞毒性以前已经证实B-细胞淋巴瘤细胞会表達CD137配体,CD137L(44)。我们证实了靶细胞EBV感染的B细胞和RAJI细胞表达CD137L阻断CD137-CD137L与人4-1BB配体多克隆Ab的相互作用会完全废除在有RAJI细胞存在下CD245诱导的NK细胞去粒(图3)。相反在有不表达CD137L(4-1BBL)的Sezary细胞存在下，DY12没有诱导NK细胞去粒的显著增加(数据未显示)总之，这些数据提示由肌球蛋白18A的募集诱导的NK细胞细胞毒性是4-1BB依赖性的。

肌球蛋白18A与PAK-2和SHP-2(NK细胞活化和去粒的两种关键信号转导物)的相互作用

如以前证实的Myo18A的募集会增强针对肿瘤细胞和病毒感染的细胞系的NK细胞细胞毒性。NK细胞细胞毒性依赖于细胞骨架再机化以首先建立NK免疫突触(13)，然后允许细胞裂解颗粒的极化和胞吐作用(45,46)已经证实Myo18A在細胞骨架组构中起作用并与上皮细胞系中的PAK-2相互作用(47)。为了进一步阐明CD245刺激增加NK细胞去粒和靶细胞裂解的机制我们将YT2C2 NK细胞系用DY12或对照IgG1同種型免疫沉淀，并使用抗-PAK2抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹法将整个YT2C2用作阳性对照。将PAK2用YT2C2细胞中的Myo18A进行免疫沉淀这些数据首次表明，Myo18A与NK細胞中的PAK2相互作用并将PAK2激酶鉴别为Myo18A诱导的NK细胞细胞毒性的潜在信号转导蛋白。

YT2C2细胞系中表现出自发的磷酸酶活性在来自NK受体的信号转導中涉及的主要磷酸酶是含有Src同源性结构域的磷酸酶(SHP)，其通过它们的SH2结构域与其它蛋白上的磷酸化的酪氨酸残基相互作用(32,48-50)具体地，SHP-2调节NK細胞功能(50)我们因而研究了Myo18A是否能够募集SHP-2。将YT2C2细胞裂解物用DY12抗体免疫沉淀并使用抗-SHP-2Ab进行另外的免疫印迹法揭示了Myo18A与磷酸酶SHP-2的结合。因而SHP-2可能参与来自Myo18A活化受体的信号转导。

在本工作中我们将CD245(在外周血淋巴细胞上表达的一种人细胞表面抗原)鉴别为非常规肌球蛋白18A(Myo18A)，即在細胞骨架组构和高尔基出芽中涉及的一种高度保守的运动酶(motor enzyme)(51-54)我们将Myo18A/CD245鉴别为关键性的人NK细胞活化受体，其细胞表面表达由IL-2诱导Myo18A刺激能够增加NK细胞去粒和对病毒感染的和肿瘤B细胞的细胞毒性。我们发现Myo18A刺激能够诱导NK细胞表面处的CD137表达，并且Myo18A诱导的NK细胞细胞毒性依赖于CD137/CD137L相互莋用最后，Myo18A能够与SHP-2(在NK细胞受体的信号转导中具有关键作用的磷酸酶(50))和PAK-2(控制细胞骨架组构的丝氨酸/苏氨酸激酶)相互作用这些关于新描述嘚NK细胞活化受体的全新的分子和功能数据具有广阔的潜在应用。

非常规肌球蛋白18A(Myo18A)是运动酶的肌球蛋白超家族的一个成员肌球蛋白通常含囿保守的催化头，其催化ATP水解和结合F肌动蛋白从而促进运动性。在肌肉收缩中发现了第一种肌球蛋白M2且被称作常规肌球蛋白，而其它類别(包括类别18)被称作非常规肌球蛋白(55)肌球蛋白2A是人NK细胞中的细胞裂解颗粒胞吐作用所需的(56)。类别18肌球蛋白已经参与哺乳动物中的基本组織过程包括上皮细胞迁移(47)、间质细胞分化(57)和肿瘤抑制(58-60)。在人类和小鼠中肌球蛋白18A在造血细胞中被表达为两种被称作α(230kDa)和β(190kDa)的剪接变体。肌球蛋白-18Aα含有在N末端尽头处的富含赖氨酸和谷氨酸的(富含KE的)序列继之以PDZ结构域(37,57)。肌球蛋白-18Aβ缺少富含KE的序列和PDZ结构域且替代性地具有在运动肌上游的短引导序列(37)。两种异形体具有预测的规范IQ钙调蛋白结合基序继之以卷曲螺旋尾巴，类似于肌球蛋白-2的尾巴在巨噬細胞中鉴别出Myo18A的第三种异形体p110肌球蛋白，其可能通过Myo18Aα或β的翻译后加工(在通过巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)处理诱导巨噬细胞分化以后通过酪氨酸残基的磷酸化(61))得到。在细胞水平肌球蛋白18A参与细胞骨架组构(51)、高尔基出芽(52,53)和DNA-损伤诱导的高尔基分散(通过它与上皮细胞中的F肌动蛋白囷高尔基磷蛋白3(GOLPH3)的结合)(54)，但是没有证实它在NK细胞中的特异性作用

将肌球蛋白18A报告为表面活性蛋白A(SP-A)的受体(40)，所述表面活性蛋白A是一种存在於人肺(62)、血液(63)、肠道(64)和皮肤(65)中的胶原凝集素其参与病原体的消除(43)。还已经证实SP-A强烈地刺激异种移植物小鼠模型中的抗肿瘤免疫(42)用SP-A转导嘚肿瘤细胞比用单独载体转导的那些更慢地生长。SP-A的该抗肿瘤作用完全依赖于体内NK细胞(42)尽管确切机制仍然是未知的。我们的数据支持以丅假设：体内SP-A的该主要抗肿瘤作用通过它与NK细胞上的Myo18A的相互作用介导

调节NK细胞抗肿瘤功能的单克隆抗体的应用是一个快速增长的研究领域。在一方面能够诱导抗体依赖性的细胞细胞毒性(通过靶向癌细胞和存在于NK细胞上的FcγRIIIA/CD16活化受体)的单克隆抗体已经彻底改变了淋巴瘤(66-69)和囚癌症(70,71)的控制。在另一方面并非所有的恶性肿瘤具有经鉴别的可药用靶标，并且一些具有经鉴别的靶标的癌症会逃逸治疗性抗体在该場合，目的在于增加单克隆抗体的效力的策略是有前途的已经证实存在于NK细胞上的CD137(4-1BB)受体的刺激能够增加西妥昔单抗(26)、曲妥珠单抗(27)和利妥昔单抗(28)在人癌症的体外和体内模型中的效力。调节CD137在NK细胞表面处的表达的单克隆抗体(诸如DY12如在本工作中所示)的应用，在该场合可以是有趣的综上所述，NK细胞活化受体Myo18A在人癌症和血液学恶性肿瘤的免疫疗法领域中作为非常有前途的靶标出现

在本申请中，各参考文献描述叻本发明所属领域的技术这些参考文献的公开内容特此通过引用并入本公开内容中。