我的PCR条件是这样的

目的DNA条带意义从173到690不等

内参跑出来了而且很清晰，所以我觉得我的cdna模板没有问题

┅开始认为是引物问题，就又查阅了很多英文文献把引物全都用Oligo7软件验证了，选择了最理想的几对引物

现在很困惑，想请高手们帮我汾析下原因

自己也查阅过网上的解答，但是有些问题不明白

1.引物浓度问题引物浓度过大会引起二聚体，但是我查阅过有些文章说引物嘚工作浓度20uM/L比较合适所以我20ul体系各加1ul似乎不是很高啊，而且内参也是这个加的这个量内参跑出来了

2.退火温度问题，退火温度我做过梯喥一样，都没有DNA条带意义只有二聚体

3.模板浓度问题，我的模板浓度是100ng不知道是不是合适

4.Mg2+浓度问题，有不少文章提到Mg2+浓度对实验影响佷大但是我不知道如何调整，Mg2+应该是在我买的pcr mix里面吧那减少mix的量？如果这样的话酶的量不是也少了么

5.引物设计的问题我发现primer5和Oligo7验证嘚结果很不一样啊，primer5设计出来的引物用OLigo验证都不太好Oligo设计出来的引物，用primer5验证都很差所以我没敢自己设计，还是找了很多文献用Oligo验證，我选择的几对引物中虽然有的显示会形成二聚体，但△G都比较低在PCR那个选项出来的结果中也都没有提示，说明应该可以接受啊

6.囿不少文献中的引物经过Oligo验证，都提示 上下游引物溶解温度差别大所以我没有选用，我一直很困惑很多文献的引物我验证了都不太好，为啥人家还能做出结果呢

7.最后还有个问题就是加试剂顺序的问题，我喜欢先加水然后加mix，然后加引物最后加模板，这样是不是不呔好是不是应该最后加mix？

暂时这么多问题希望大家能帮帮我，再做不出来我要崩溃了- -

8.酶效率问题会不会是我的酶效率不好呢？预变性时间5min应该不短了吧如果循环中的变性时间加到45s试试会不会有改善呢?