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肿瘤细胞来源的外泌体对肿瘤恶性进展和化疗抵抗的影响
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测序周报·资讯篇：关注外泌体领域的发展
时间： 18:57
摘要：本周关注：关注外泌体领域的发展 Select Biosciences公司近年来一直对外泌体领域的发展保持关注，在GEN Report的这期新闻里，我们从Select Biosciences公司最近的市场报告里摘录外泌体市场前景的摘要。在这篇文章中 ......
Select BiosciencesGEN ReportSelect Biosciences
extracellular vesicles EVEV201991
Select Biosciences2
2/EV——8%
Select Biosciences/EV4/EV
Select Biosciences/EV7
Danaher40CepheidCepheid5354%Danaher2015138Pall
20169 AITbiotech ——NovogeneAIT Genomics SingaporeNovogeneAIT GenomicsSingaporeIlluminaHiSeq X Ten
981.4B20154
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作者：小小测序君
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line-height:50& &今天是3.30国际医生日，然而中国的医师节是6.26，但其实哪天真的并不重要，重要的是对这个职业的尊重！From：Traffic.&IF：4.35大家都已经知道外泌体君无所不在，但却不知道的是外泌体君不仅仅是存在感强，而且出现的时间也是“极早的”，早在我们还在妈妈的肚子里的时候，它就已经作为一个“使者”，忠实的履行着保护我们健康成长的义务。摘要：在妊娠期期间，胎盘在母亲和胎儿之间形成一个界面，胎盘运输的调节对成长中的胎儿的健康发育是至关重要的，由细胞外囊泡介导的从人胎盘运输蛋白和核酸到母体循环中也曾被证明是有据可查的，而且这个运输方式可能是双向的，可能会影响胎盘功能从而对婴儿产生影响，但还没有被完全探索。我们假设胎盘对母体炎症信号的应对能力是由母体免疫细胞外泌体与胎盘滋养层的相互作用介导。使用BeWo细胞系和胎盘移植组织，作者证明了人胎盘通过一个时间依赖性和剂量依赖性的方式内化巨噬细胞来源的外泌体。这个摄取是通过网格蛋白依赖的内吞作用。此外，巨噬细胞分泌的外泌体诱导胎盘释放促炎症细胞因子。总的来说，作者证明了外泌体被积极运输到母体胎盘中，来源于活化免疫细胞的外泌体可以介导胎盘产生细胞因子。这代表了免疫细胞信号传给胎盘单位的新的机制，具有潜在的促进对母体的炎症和感染的反应，从而保护胎儿免受伤害。Figure 1: Isolation of exosomes&from PMA-activated THP-1 cells.THP1&(Human acute monocytic leukemia cell line)&&PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）（用PMA诱导THP-1 能够得到巨噬细胞）作者使用THP1单核细胞源性巨噬细胞作为产生免疫细胞外泌体的模型细胞系，因为它们可以稳定的分化成巨噬细胞，并且释放大量高水平的外泌体。通过纳米追踪分析，说明有连续离心法分离所得的外泌体与之前报道的外泌体的大小一样，平均大小是137.6nM±18.50，和mode size是111.9±15.09(Figure 1A,B).此外，分离所得的外泌体均是跨膜四蛋白CD81阳性（嵌在外泌体膜上的蛋白），和ALIX阳性（定位在外泌体内腔），这些均说明了外泌体的存在(Figure 1C).Calnexin，是作为内质网的标记物，均在细胞提取液中检测到，说明了分离的外泌体并未收到细胞碎片的污染(Figure 1C).而这些巨噬细胞来源的外泌体则使用于随后的实验中。Figure 2: Uptake of macrophage exosomes by trophoblast cells.BeWos：是绒癌细胞系，通常用来研究滋养层的生物学功能。作者证明了外泌体摄取的剂量依赖性和时间依赖性，通过流式分析PKH阳性的BeWos百分比的增加。BeWos在流式分析前先用胰蛋白酶处理过，检测到的荧光表明内化的外泌体不是通过表面结合的。(Figure 2A).共聚焦显微镜进一步说明了细胞间的联系和滋养层细胞摄取了PKH标记的巨噬细胞外泌体(Figure 2D).接着，作者体外培养人胎盘组织，通过共聚焦显微镜可见胎盘组织摄取了标记的外泌体。(Figure 2E）。摄取通常主要发生在滋养细胞层。Figure 3: Active placental uptake of macrophage exosomes by clathrin-mediated endocytosis.在4 ℃，BeWo细胞对外泌体的摄取就停止了(Figure 3A),说明了外泌体的摄取过程是个活动的过程。为了确定这种内吞作用是外泌体常规的进入方式，在加入外泌体之前，将细胞与内吞作用抑制剂细胞松弛素D或Dynasore(发动蛋白抑制剂）先进行预处理，细胞松弛素D会引起肌动蛋白细胞骨架的解聚，从而抑制多种内吞通路。发动蛋白可作为内吞作用的主要调节器，但除外一些网格蛋白和小凹蛋白依赖性内吞摄取途径，且最近被发现可以抑制上皮细胞对外泌体的内吞作用。由图可见，最高浓度的dynasore减少了约45%的外泌体摄取 (p&0·05, Figure 3B)。最高浓度的细胞松弛素D少了约72% 的外泌体摄取(p&0·05)。结合dynasore和细胞松弛素D将协同减少外泌体的摄取量(Figure 3D).但在控制组二甲亚砜(DMSO),则没有任何作用。而使用dynasore和细胞松弛素D对细胞活力则没有任何明显的作用(Figure 3E).这种内吞作用可以是网格蛋白或小凹蛋白介导。正如包含了胎盘母体面的人合体滋养层细胞，表达网格蛋白但不表达小凹蛋白，所以很可能是由网格蛋白介导而不是小凹蛋白介导的内吞作用，作为外泌体的摄取途径。网格蛋白介导的内吞作用还可摄取其他如白蛋白和胆固醇等分子进入胎盘。使用能透过细胞的网格蛋白抑制剂Pitstop2，流式细胞分析显示外泌体摄取完全消失，说明了外泌体摄取确实是网格蛋白依赖性的(Figure 3C).Pitstop治疗可导致细胞活力的下降(Figure 3E),而流式分析外泌体的摄取仅在活细胞中。因此，胎盘摄取外泌体是通过网格蛋白介导的内吞作用，但介导这种内吞作用的受体目前还在研究中。到目前为止，作者详尽介绍了巨噬细胞的外泌体可通过内吞作用非常活跃的进入到胎盘组织中，接着，作者将开始探索，这种相互作用对胎盘功能又会有什么影响。Figure 4: Placental production of IL-6, IL-8, IL-10 and IL-12 in response to macrophage exosomes.因为外泌体是来源于巨噬细胞，而滋养层细胞又有对炎症环境的反应能力，因此，作者检测胎盘对细胞因子的产生。在与巨噬细胞来源的外泌体共孵育24小时后，胎盘释放IL-6明显增加，在最高浓度1 × 10^11/mL外泌体，增加了3.5倍(Figure 4A).胎盘释放IL-8在最高浓度外泌体同样增加了2.4倍(Figure 4B).IL-10在未处理过的细胞中释放量通常很低，常难以检测到，然而用巨噬细胞来源的外泌体处理过后，产生了与IL-6/8相似的效果(Figure 4C).IL-12在移植的上清液中很容易被检测到，但它的结果在用巨噬细胞来源的外泌体处理过后和IL-6/8产生了不同的结果，并没有明显的改变(Figure 4D).。IFN-γ, TNF-α&和 IL-17A在移植的上清液中都无法检测到(&40 pg/mL IFN-γ, n=5; &40 pg/mL TNF-α,n=12; &4 pg/mL IL-17A, n=2).因此，总的来说，巨噬细胞来源的外泌体可诱导胎盘产生IL-6、IL-8、IL-10.虽然胎盘包含了许多可产生细胞因子的免疫细胞，但释放到母体循环中的大多数细胞因子主要来源于滋养层。在摄取了巨噬细胞来源的外泌体后所致的IL-8释放的增加对招募母体免疫细胞到母胎界面是至关重要的。之前许多研究都说明了胎盘来源的微囊泡和外泌体在调节母体免疫细胞的作用，而作者则是反向母体来源的微囊泡和外泌体对胎盘的作用，通过外泌体，在怀孕期间介导一个保护性的胎盘免疫反应。这篇文献也是揭示了一个母体与胎盘之间的新的交流方式，就是通过循环的外泌体。exosomes(exosome-today)　
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外泌体的粒子分布影响细胞对外泌体的摄取
外泌体的粒子分布影响细胞对外泌体的摄取外泌体可以特异性激发一些细胞反应，表明它们可以在作为治疗递送载体方面有巨大的潜力。外泌体的囊泡性质使得它们适合作为用于药物或核酸递送的潜在纳米载体。在这里，研究人员需要解决的问题是，富集外泌体的的不同制备方法是否可以影响它们的细胞吸收和他们的触发细胞反应的能力。12月16日，来自意大利乌迪内大学的研究人员利用从高分级胶质瘤患者分离的胶质瘤相关干细胞的上清液，比较了超高速离心和基于聚合物沉淀方法。研究人员确定了纯化后的粒度分布，及其与培养的胶质母细胞瘤细胞的摄取、增殖和迁移的相关性。研究结果表明，基于聚合物的沉淀表现出更小的粒度分布、更快的目标细胞摄取和增加细胞迁移能力。分离方法依赖的粒子群对细胞迁移性的不同影响表明，它们的大小分布也会影响外泌体的治疗潜力。
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&div&　　十年砥砺同舟路，风华已茂正当时。在您一路陪伴支持和外泌体最新研究进展成像流式的新发现；外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包；外泌体产生过程的示意图：；Ectosomesandexosomes:she；EmanueleCocucciandJacopo；过去研究外泌体的主要工具包括Nanosight、；又具有对海量数据进行快速分析的；统计学功能；一，定量检测样本中的外泌体；过去十年间，外泌体研究成为
外泌体最新研究进展 成像流式的新发现
外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。免疫细胞和肿瘤细胞之间通过外泌体进行信息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用。外泌体既可以通过抑制免疫细胞（DCs、NK细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞等）引发的抗肿瘤反应，以及诱导免疫抑制或调节细胞群（MDSCs、Tregs和Bregs）的免疫抑制。
外泌体产生过程的示意图：
Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles
Emanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi, Trends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.6
过去研究外泌体的主要工具包括Nanosight、Apogee、confocal和传统流式细胞仪。这几种工具各有优点，也都具有其局限性，如Nanosight、Apogee和传统流式细胞仪只能检测外泌体颗粒，测量外泌体的浓度，对外泌体进行定量。无法研究细胞与外泌体的相互作用以及外泌体功能；confocal可以拍摄到细胞分泌和吞噬外泌体，但是因为缺乏合适的量化参数，无法对吞噬过程进行量化分析，也无法定量产生的外泌体。而且confocal的通量太低，结果也可能存在人为偏倚性而不够客观。，很好地解决了上述研究手段存在的问题，是目前为止研究外泌体产生机理及外泌体功能的最佳方法。Amnis能够同时采集12个检测通道中的细胞和颗粒物图像，其中包括明场、暗场，以及10个荧光通道。Amnis每个检测通道都有100余种量化参数，如面积、直径、长度、厚度、细胞短轴与长轴比值、荧光强度等等，这些参数可以提供传统流式和显微成像设备都不具备的量化统计学功能，获得全新的细胞或颗粒物量化统计学数据。Amnis采用最先进的用于航空遥拍的TDI CCD（Time Delay Integrated CCD）收集荧光信号，可以采集到液流中快速移动的细胞和小颗粒物的清晰图像，对数万乃至数以十万的细胞或小颗粒物的荧光信号进行量化分析。Amnis既具有显微成像的功能，可以呈现细胞和小颗粒物的细节，
又具有对海量数据进行快速分析的
统计学功能。因此，Amnis量化成像流式细胞分析技术可以为外泌体的研究提供强有力的技术支持。
一， 定量检测样本中的外泌体
过去十年间，外泌体研究成为新的研究热点，人们意识到微小的外泌体在生物体中扮演了非常重要的角色，例如外泌体参与了从凝血到细胞间信息交流等各种生理过程，而且外泌体与动脉硬化、风湿和肿瘤等疾病相关。因此外泌体有望成为疾病风险预估或者临床诊断的工具。由于外泌体的直径只有几十纳米，而且产生外泌体的样本复杂多样，因此迫切需要开发一种可以精确定量检测样本中外泌体的技术。量化成像流式细胞技术因其灵敏度高、通量高、检测样本量低，并且适合检测全血、血浆、白细胞上清液等复杂的样本，成为定量检测细胞分泌产生外泌体的最佳研究工具。“Cutting-Edge Analysis of Extracellular
Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry”文章中报道了利用Amnis检测到了直径20nm微珠的荧光信号，并拍摄到了直径为100nm的微珠的图像。这个结果也证明了Amnis的灵敏度和图像分辨率足够检测直径范围在30-100nm的外泌体。
此外，文章中还定量检测了嗜中性粒细胞受到TNF-α刺激后产生的微囊泡，以及随着TNF-α刺激时间延长，微囊泡生成的动力学曲线。这些微囊泡中就包含了外泌体。利用荧光抗体标记母体细胞，可以通过微囊泡携带的荧光标记，定量分析微囊泡的来源。文章中检测了6个健康供体血浆中的微囊泡，并对这些不同来源的微囊泡进行了定量分析。
二， 研究外泌体与肿瘤细胞和免疫细胞之间的互作
外泌体因其来源不同而功能各异，有些可以刺激免疫反应，有些可以抑制免疫反应，有些具有诱导免疫耐受的作用。“Exosomes Containing Glycoprotein 350 Released by EBV-Transformed B Cells Selectively Target B Cells through CD21 and Block EBV Infection In Vitro”主要研究了来源不同的外泌体是否可以选择性地被人类外周血中不同的免疫细胞吞噬。文章中分别富集了来源于DC细胞、LCL1细胞以及人奶中的外泌体，并把这些不同来源的外泌体用PKH67标记后，与人外周血单个核细胞孵育。
Amnis具有100多种量化参数，可以定量分析许多显微成像设备无法定量分析的内容，例如细胞的形态变化、细胞内吞等。Amnis的内吞参数（Internalization）主要用来测量细胞内与细胞外的荧光比值，内吞参数值越大，代表细胞吞噬了更多的颗粒物。如上图所示，绿色标记的外泌体主要被HLA-DR+ CD14+单核细胞吞噬，有些外泌体粘附在细胞膜表面，有些外泌体进入细胞后移动到细胞中心位置，Amnis可以准确区分上述两种情况。通过统计分析不同来源的外泌体被单核细胞吞噬的情况，作者发现DC细胞和人奶来源的外泌体更容易被单核细胞吞噬，而LCL1来源的外泌体则与单核细胞亲和度不高。
三， 研究肿瘤细胞对外泌体吞噬功能
膀胱癌是常见的非皮肤源性恶性肿瘤，近年来膀胱癌的发病率呈现稳步上升态势，可是对于膀胱癌的早期检测以及风险分级方面的研究却进展缓慢。此外，膀胱癌的复发和转移也是威胁患者生命的重要因素。因此，迫切需要确认新的生物标志物，研究膀胱癌的转移机制，可以为膀胱癌的治疗指明方向。有文献报道膀胱癌细胞可以产生外泌体，这些外泌体中含有对肿瘤的转移起到重要作用的蛋白。“Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells”文章中利用Amnis检测了膀胱癌细胞对外泌体的内吞，证明了内吞作用是随着外泌体的数量增加和时间延长而增多，而且文章还发现内吞作用受到到肝素钠的阻断。
图中黄色的点状结构是PKH26标记的外泌体，Amnis的计点（spot count）模块可以自动统计特定区域内的点状荧光信号的数量，这些点状荧光信号即可代表外泌体的信号。利用计点模块可以定量膀胱癌细胞中吞入的外泌体的数量。
三， 研究吞噬外泌体后细胞形态功能等方面的变化
除了前文中介绍的Amnis量化成像流式细胞技术的内吞模块、计点模块以外，还具有细胞凋亡、细胞周期、细胞形变、蛋白转位、共定位等智能模块。这些模块可以用于研究外泌体与细胞间的相互作用、细胞形态功能等方面的变化，有利于进一步探索外泌体的作用机理和功能。以细胞周期模块为例，Amnis在研究细胞周期变化时，不仅可以提供G0/G1期、S期和G2/M期细胞的百分比，还可以通过遗传物质在细胞核内形态的变化，根据细胞核面积以及最大荧光强度等特殊的量化参数，分析细胞分裂前期、中期、后期及末期等几个亚期。当分析细胞健康状态时，Amnis可以通过细胞核大小和形态的变化，区分凋亡细胞和坏死细胞。另外Amnis还可以通过蛋白转位模块研究NFkB等蛋白从细胞胞浆到细胞核内的转运情况，从而帮助科学家研究外泌体与细胞信号传导之间的关系。
细胞周期的细化分析：
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