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求助：我的PCR扩不出目的片段，有谁有办法
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求助：我的PCR扩不出目的片段，有谁有办法
求助：我的PCR扩不出目的片段，有谁有办法 [转载]
各位大哥，大姐，我的PCR老是扩不出来目的片段，总是smear带，试过不同的Mg离子浓度，和模板浓度，以及复性温度，要怎么办呢，请帮帮我吧。
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检查一下引物，或者用新的（将保存的母液稀释一点），有的时候，引物反复冻融就不行了，还有就是作一下递减PCR，将退火温度改变成几个循环一个温度
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我前个星期也是，P出来很浅，且回收不到，后来增加了5个循环，条带就变得很亮了，不妨试试。
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你做的是什么PCR? RT-PCR还是常规的PCR. 做RT的话，模板也很重要啊。是不是降解了？
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另外，TaqE也很重要，加多了也会产生smear, 就买点儿好的吧，少加点。
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你可以试一下用68度延伸。1min/1kb
我曾经在72度延伸下p不出来的在68度延伸下得到产物，而且比较亮
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我觉得应从以下几方面找原因：
1.模板，内参能批出来吗？
2.还要调整退火温度，它甚至比镁离子浓度还药重要，递减再批。
3.引物能保证很好吗！
4.酶一般不会有问题。
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你不要老是去试太多条件了。
镁离子就用1.5 mM,
退火温度：60度
引物TM值： 高于60度
dNTP: 2.5mM (1ul/25ul)
酶：0.2ul / 25 ul (1U)
PCR扩30，35，40循环。你可以同时做3管，中间分别拿出来就是。
跑电泳看看，如果还是弥散，将产物稀释100倍后在扩20－25循环。
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我的理解你的PCR是P出来杂带多吧？我遇到过这种问题。我的经验是首先在这个时候提高退火温度，降低Mg浓度。我的做法是，在试用一个退火温度时，设计三种Mg浓度，1.0、1.5及2.0，每一种Mg浓度做两管，根据条带明亮程度、杂带情况可以找出一个较理想Mg浓度。然后用同样的方法摸索另一个退火温度。只要试剂没问题，经过这样的实验，可以得到一个较理想的Mg浓度和退火温度。若有必要再可对循环次数、dNTP浓度、模板进行调整。这里想说的是，在摸索条件时，一次可对几个条件进行组合（但不能太多，否则一组合下来，每一次的管数就太多了），同时进行，比如刚才在同一个退火温度、三种Mg浓度时，还可以在每一种Mg浓度用两种不同的dNTP浓度。顺便提醒：有一次，运行正常的PCR，换了另一厂家的dNTP后，N多杂带。调换后，又回复正常。
我觉得这样摸条件，效率会比较高。这是在认定试剂正常的情况下，至于怎样确定试剂的有效性，相信你会做得比我好。希望对你有帮助！
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我买的都是KIT，我的标本放置时间很久，降解得很厉害，但我第一次就做出来了，而且目的条带很清晰，如果是RT－PCR，反转录这一步很重要，要尽量买好一点的反转录酶。而且不同批次的Buffer是不能混用的。为何用纯化的PCR产物就扩不出来？？？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 为何用纯化的PCR产物就扩不出来？？？
摘要: [为何用纯化的PCR产物就扩不出来？？？] 各位大侠们好，请教一个问题，同样的基因，用未纯化的PCR产物和克隆质粒做模板都能P出目的片段，可是用胶回收纯化的PCR产物做模板却P不出来，请问是什么原因？望赐教 关键词:[回收 乙醇 稀释 条带 模板]……
各位大侠们好，请教一个问题，同样的基因，用未纯化的PCR产物和克隆质粒做模板都能P出目的片段，可是用胶回收纯化的PCR产物做模板却P不出来，请问是什么原因？望赐教回复是不是有可能在胶回收的时候，乙醇没有晾干或者纯化后模板浓度变的太低了？没遇到过这种情况，只是猜测。回复最大可能 乙醇残留了。
其次其他操作失误。回复我也遇到过同样的情况，能P出来，但是量很少。
恳请大虾赐教回复如果完全没有条带有可能根本就没回收回来，或者回收回来的条带不对，一般纯化回收的样本要稀释后才能够做普通PCR的样本来使用，否则样本浓度太大了，也扩不好的。乙醇残留也会有影响啦。
你中间有酶切的步骤没，看看是不是酶切的时候酶不好，有核算外切酶活性，把末端切掉啦回复4楼正解 有可能因为 你的目的片段含量低 片段不亮 回收后都有可能会有损失
导致你回收后什么都没有回复
如果完全没有条带有可能根本就没回收回来，或者回收回来的条带不对，一般纯化回收的样本要稀释后才能够做普通PCR的样本来使用，否则样本浓度太大了，也扩不好的。乙醇残留也会有影响啦。
你中间有酶切的步骤没， ... 谢谢指教。我的片段是很亮的，而且没有杂带，回收之后的样本也稀释了十倍才做模板的，但是P出来的是弥散带，这么说来，应该是乙醇残留？？再次谢谢指教回复同意四楼说的，如果条带很亮，我会稀释倍回复我也遇到过这样的问题，稀释不管用，乙醇残留根本不可能，我都在37度烘箱烘了几个小时。
期待高手解答。回复
谢谢指教。我的片段是很亮的，而且没有杂带，回收之后的样本也稀释了十倍才做模板的，但是P出来的是弥散带，这么说来，应该是乙醇残留？？再次谢谢指教 如果是乙醇残留应该是对PCR有抑制，不会条带很亮的。
弥散多半是温度不对，温度低了会出弥散，不知道你的是不是这个情况，我原来是模板稀释一百倍的回复或者胶回收的带是杂带也说不定，总之多做几次回复先测下OD值，确认下回收到了回复其实主要貌似不是乙醇残留的影响，而是PCR产物其实不适合作为模板进行扩增，最好还是从载体载体上扩，而且，你如果是PCR用来以后的连接用的，PCR条带不亮，以后很多后续工作无法完成的，具体PCR产物不适合做PCR模板的原因可能是因为PCR酶的问题，我也没深究，回头找一个很牛的师姐问问，帮你解释下
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合成的引物第一次拿来做PCR能扩的出来,可是后面拿来扩怎么也扩不出来了,是什么原因?
引物出问题的可能性不大,一般是模板或者pcr试剂出问题的可能性较大.1.可能是你第一次pcr污染了或者第一次的模板较好,或者第一次的试剂没有问题.2.引物即使是用水溶解放在4度,在一个月之内也不会出问题.如果是用TE溶的,放在-20,大半年也不会出问题.
我用别的引物做对照，模板和PCR试剂都一样，可是也只有对照有目的条带出来。
那就是引物降解了或者引物没设计好。
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做阳性对照，一项一项排除吧。也许是溶解引物的水有问题。虽然引物出问题的可能性不大，但是……引物4度十天就降解的可能性是客观存在的。。
如果对照组能做出来，说明引物和试剂都没有问题，一定是你的模板出现问题了，你可以将模板第一轮扩增的产物（尽管看着啥都没有）做为模板用同样的引物和条件再做一次PCR，如果你第一轮的PCR跑电泳结果是干干净净的啥都没有话，那么第二次PCR就有九五成的把握扩增出目的条带。实在不行那就再来一轮。...
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