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对HOXA基因表达调控和干细胞分化的研究
年4月17日，生命中心沈晓骅研究组在《Cell Stem Cell》杂志在线发表了题为&Opposing roles for the lncRNA Haunt and its genomic locus in regulating HOXA gene activation during embryonic stem cell differentiation&的研究论文。文章首次报道了一个长链非编码RNA（lncRNA）的表达产物和编码这个lncRNA的基因组区域同时对其下游的HOXA基因簇的表达进行调控，并且起着相反的调控方式。
RNA和其基因组DNA调控HOXA基因表达以及胚胎干细胞（ESC）分化模式图。
RNA是一类长度大于200nt且不编码蛋白质的RNA转录物。近年来，随着高通量测序的普及越来越多的lncRNA被鉴定出来，据估算人和小鼠的基因组中lncRNA基因和蛋白编码基因数量基本相当。但关于lncRNA的功能研究一直是存在争议。到目前为止，只有少数lncRNA被证明是有功能的。
lncRNA的功能，沈晓骅实验室以小鼠胚胎干细胞（ESC）为研究对象，创新性的利用CRISPR/Cas9系统介导的敲除、敲入等策略，系统全面地研究长链非编码RNA Haunt的功能。有意思的是，该研究发现，Haunt的表达产物和其所在的基因组区域均对下游的HOXA基因的表达进行调控。Haunt的基因组区域内部包含&增强子&元件，在维甲酸（Retinoic acid, RA）诱导的分化过程中可以促进HOXA基因的激活。而Haunt的表达产物则起到一个&车闸&的作用，通过抑制HOXA基因的表达来防止其被过度激活，通过这两种调控方式保证了HOXA基因的精确激活以及ESC的正常分化。进一步研究表明Haunt的表达产物通过影响其基因组区域与下游的HOXA基因簇基因组区域的长距离互作来抑制HOXA基因的表达。这是首次证明一个lncRNA的基因组区域和其表达产物同时调控同一基因的表达，并且起着相反的调控作用。同时，通过结合RNA干扰、启动子短片段敲除、基因组长片段敲除、敲入介导的基因原位表达终止或原位过表达以及原位序列替换等策略来系统全面的探究一个lncRNA的功能在之前的研究中也鲜有报道。该研究和之前其他的一些研究同时还表明，之前一直被认为的不具蛋白编码功能的&垃圾DNA&中事实上包含一些潜在的调控元件，这些元件在发育的某些阶段可能对一些基因的调控起着重要作用。而lncRNA作为另外一种调控形式可能在这个基础上进行进一步&微调&。生物信息学分析表明基因组中有很多lncRNA位于潜在的调控元件，Haunt这种调控方式是否广泛存在，以及其调控HOXA的精细机制还有待进一步研究。
联合培养项目2010级博士生尹亚飞为本文的第一作者，论文的其他作者还包括2012级博士生颜丕熙和卢雨阳等，通讯作者是生命中心沈晓骅。该研究得到了国家973计划、国家自然科学基金委和生命科学联合中心的资助。作者：宗华 来源： 发布时间：
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定位转录中的神秘功能
科学家通过多种方法探究长链非编码RNA
直到今天，针对lncRNA的简洁且合理的分类系统仍遥不可及。
长链非编码RNA的概念模型 图片来源：Karissa Y. Sanbonmatsu
2013年，一群研究人员决定更加深入地挖掘一种名为H1的人类胚胎干细胞系，并且获得了一些惊喜。H1是最著名的干细胞系之一，但该团队还是成功发现了2000多个此前未被阐明的RNA片段。更重要的是，其中有146个为人类胚胎干细胞所独有，从而为研究多能性&&变成体内任何细胞类型的能力&&提供了诱人线索。
然而，这些转录并未受到关注，因为它们含有往往会被序列分析器过滤掉的重复性编码片段。
这是一个巨大的盲点。其他实验室曾发现了富含重复性编码并且在人类干细胞中非常重要的RNA存在的初步证据。在主要来自美国加州斯坦福大学的研究人员分析结果时，他们意识到，自己正好找到了此类RNA。团队成员Vittorio Sebastiano介绍说，在一份包含146个RNA序列的清单中，最丰富的3个&&被命名为HPAT2、HPAT3和HPAT5&&似乎对于建立可发育成人类胚胎的多能细胞是必需的。
这些RNA片段是长链非编码RNA（lncRNA）（至少有200个碱基长并且不会编码蛋白的序列）的例证。lncRNA存在于很多不同种类的组织中，而且经常在细胞内特定位置处被发现。不过，大多数lncRNA缺少得到明确定义的功能，并且直到最近，还被认为仅仅是转录噪音。
随着更多数据大量涌入，这种观点开始发生变化。数据表明，lncRNA被转录的基因组区域在进化中要比此前想象的更加高度保守，而这意味着它们具备一些功能。不过，直到今天，针对lncRNA的简洁且合理的分类系统仍遥不可及。
由于lncRNA的清单是如此之长，因此一个关键步骤是决定哪些被优先用于研究。约15年前在研究生阶段发现了lncRNA的John Rinn提议，从那些来自已同疾病联系起来的基因组区域的lncRNA开始。目前，Rinn在麻省理工学院和哈佛大学成立的布罗德研究所内管理一家专注于研究分子的实验室。
另一个想法是研究lncRNA位于哪些地方&&比如，找到靠近转录起始点的lncRNA，这意味着它参与了调控附近的基因。目前，研究人员能相对轻松地追踪到细胞内分子的位置。Rinn和来自布罗德研究所以及宾夕法尼亚大学的其他研究人员利用一种名为单分子荧光原位杂交的技术，成功辨别出61个位于皮肤、肺和宫颈肿瘤细胞内的lncRNA分子的位置。
如今，科学家还能利用CRISPR-Cas9和其他基因编辑技术，干扰lncRNA被转录的部分DNA序列或者指挥其转录的启动子，从而测试lncRNA的功能。一些技术使实验室得以迅速筛选出大量lncRNA。当CRISPR-Cas9被用于研究蛋白编码基因的功能时，逻辑是相同的：将单碱基的删除或替换引入DNA，并且观察被改变转录的效果。
斯坦福大学医学院癌症生物学家Howard Chang介绍说，唯一的问题在于，和蛋白相比，lncRNA因微小改变失去能力的可能性更小，而序列改变通常要更加强烈。
这便是RNA研究人员自己制作CRISPR-Cas9的原因所在。他们扩展了CRISPR工具箱，将阻断或启动特定lncRNA转录的方法包括进来。不过，Rinn及其团队开发了另一种方法：一种名为CRISPR-Display的工具。Rinn将其比作在细胞中任何地方都能运送物品&&在这种情况下是特定lncRNA&&的无人机。如果基因激活中的某项任务受到怀疑，那么它可以通过将lncRNA运送到一个不同的基因组区域并且观察新位点的基因激活而得到测试。
RNA相互作用组
一种完全不同的方法是找到正在同lncRNA发生相互作用的对象。&人们仍然相信，尽管lncRNA很重要，但在没有辅助因素的情况下，最终还是无法执行它们的功能。&RaNA疗法公司共同创始人、马萨诸塞州综合医院分子生物学家Jeannie Lee介绍说，而这些辅助因素几乎总是蛋白。
Lee和其他人已着手利用一种名为Xist的lncRNA揭示其相互作用。研究发现，Xist对于令雌性哺乳动物细胞中的两条X染色体之一失活是必需的，从而阻止雌性拥有很多两倍于雄性的X染色体基因产物。同Xist结合的蛋白通过多种机制令基因表达沉默。不过，去年科学家最终确定了这些&搭档&的身份。如今，研究发现，这些蛋白不仅能吸引令转录沉默的其他分子，还能排斥一些启动转录的分子。
对于探究某个lncRNA的蛋白&搭档&群有很多技术可用：广义地讲，研究人员利用诸如甲醛或紫外线将RNA和蛋白连在一起，然后利用质谱分析法解析谁和谁结合在一起，并且提出了&相互作用组&的概念。通常，这些分析拥有诸多步骤，因此需要科学家作出很多战略性选择。RNA和蛋白应该如何被连在一起？如何将相互作用的真实信号同虚假信号区分开来？笼罩着所有此类研究的是这样一个问题：RNA在试管内的表现通常和在细胞内的表现不同。
这便是为何致力于Xist相互作用研究的科学家聚焦能辨别出同活体细胞内的蛋白结合在一起的RNA的各种技术。最近质谱分析敏感性的改善正在帮助研究人员。去年，Chang的团队将利用甲醛作为连接剂的试验和最新的质谱分析法结合起来，并且发现，Xist在试管内能和81种蛋白结合。
结构中的秘密
探究lncRNA功能的第三种方法是研究它们的结构。虽然该方法不能像预测蛋白的功能那样，直接预言lncRNA的功能，但对RNA的拱起和折叠有更多了解可能会提供一些信息。&这是一个完全开放的领域，需要开展很多工作。&新墨西哥州洛斯阿拉莫斯国家实验室结构生物学家Karissa Sanbonmatsu表示。
建立某个lncRNA二级结构的方法包括化学探测，比如被称为SHAPE的方法。它牵扯到将乙酰基附着到RNA上，并且仅在灵活的区域修改其&支柱&。被修改的地点会阻断&阅读&RNA以创建互补DNA序列的酶，以至于生成的是短的DNA片段而非长链。随后，这些片段能在凝胶上被测序或按大小分类。
2012年，Sanbonmatsu团队最早描述了一种人类lncRNA的二级结构：十几年来一直被认为同雌激素受体存在关联的类固醇受体RNA激活子。
不过，这种结构方法不得不解决RNA在试管内和细胞中表现不同的问题。和结合研究一样，最新技术是在试管内进行的。2012年，一个包括Chang在内的团队描述了能在活体细胞内发挥作用的SHAPE的一个版本，并且从那以后对其进行改善，以同时描绘上千个RNA的结构。
和其他方法一样，结构研究需要大量时间的投入，因此在聚焦最有可能具备功能的lncRNA时，必须作出谨慎的选择。Sanbonmatsu介绍说，幸运的是，研究人员在这种分类上表现得越来越好。她建议在判断功能意义的可能性时，科学家应先从拥有已知表型的lncRNA开始，然后通过化学方法探究它们，以获得二级结构，并且检查它们在多大程度上能在其他物种中被保留下来。（宗华）
《中国科学报》 ( 第3版
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目前已有0条评论摘要 : 来自加州理工学院的研究人员发现了一类丰富的RNA基因——长链非编码RNAs(lncRNAs)是如何调控一些关键基因的。通过研究一种叫做Xist的重要lncRNA，科学家们确定了这种RNA聚集一组蛋白质，最终阻止女性拥有一条额外的功能性X染色体的机制。研究论文发表在4月27日的《自然》（Nature）杂志上。
&来自加州理工学院的研究人员发现了一类丰富的RNA&&长链非编码RNAs(lncRNAs)是如何调控一些关键基因的。通过研究一种叫做Xist的重要lncRNA，科学家们确定了这种RNA聚集一组蛋白质，最终阻止女性拥有一条额外的功能性X染色体的机制。在女性胚胎中多出一条功能性X染色体可以导致早期发育阶段死亡。这是研究人员首次揭示出lncRNA基因的详细作用机制。研究论文发表在4月27日的《自然》(Nature)杂志上。
该研究的领导者、生物学助理教授Mitch
Guttman说：&多年来，我们都只是将基因视作为是编码蛋白质的序列，而这些基因只占大约1%的基因组。哺乳动物基因组还编码了成千上万的lncRNAs。诸如Xist一类的lncRNAs发挥着重要的结构作用，充当了支架&&聚集并组织了参与基因表达和干细胞分化等一些细胞和分子过程的关键蛋白。
2009年在麻省理工学院攻读研究生的Guttman帮助发现了一整类lncRNAs。他说尽管编码在我们基因中的这些基因大多数都是到近期才获得重视，但也有几个已经知道有数十年的特殊lncRNA基因例子。Xist就是一个充分研究的例子，它在X染色体失活过程中发挥重要作用。
所有的女性出生时每个细胞中都有两条X染色体，一条遗传自母亲，另一条遗传自父亲。相比之下，男性只有一条X染色体和一条Y染色体。然而，像男性一样，女性只需要一个拷贝的X染色体基因&&有两个拷贝是一种异常情况，可以导致发育早期死亡。基因组通过&关闭&每个细胞中的一条X染色体绕开了这些问题。
以往的研究表明Xist对于这一过程至关重要，其通过某种方式阻止X染色体上的基因转录做到了这一点。但由于Xist不是一种传统的蛋白质编码基因，直到现在研究人员也难以弄清楚Xist阻止转录及关闭整条染色体的确切机制。
Guttman说：&要开始了解是什么让一些lncRNAs如此特异，以及它们如何控制所有这些不同细胞过程，我们需要去认识lncRNA基因发挥作用的机制。由于Xist是如此重要的一个分子，大家皆知它的作用，试图剖析它和其他lncRNAs发挥作用的机制看起来是一个大的系统工程。&
众所周知，lncRNAs可以聚集和组织细胞过程必需的一些蛋白质，因此Guttman和同事们首先开发出了一项技术来查明它在细胞中与什么蛋白发生了自然互作，开启了他们对于Xist功能的研究。利用一种叫做RAP-MS的新方法研究人员抽提并纯化了Xist
lncRNA分子，以及小鼠胚胎干细胞中直接与Xist互作的蛋白。随后，加州理工学院蛋白质组探索实验室的合作者应用一种叫做定量质谱法的技术鉴别了这些互作蛋白。
哈佛大学干细胞和再生生物学副教授John Rinn
(未参与这一研究)说：&RNA通常只遵守一条规则：与蛋白质结合，RAP-MS就像分子显微镜一样鉴别了RNA-蛋白质互作。RAP-MS将提供有关lncRNAs如何发挥功能组织蛋白质，转而调控基因表达的一些极其重要的认识。&
将这一技术应用于Xist揭示出了10种与Xist相互作用的特异蛋白质。其中有三个蛋白SAF-A (Scaffold attachment
factor-A), LBR (Lamin B Receptor)和SHARP (SMRT and HDAC associated repressor
protein)对X染色体失活至关重要。Guttman说：&在这项实验之前没有人知道Xist沉默X染色体转录所需的单个蛋白，借助这种方法我们立即发现了这三个必需的蛋白。如果你失去其中的一种蛋白，Xist就无法发挥作用&&在发育过程中它将不会沉默X染色体。
这些新研究结果提供了lncRNAs如何在一个细胞过程中起作用的第一个详细图像。通过进一步的分析，研究人员发现这三个蛋白发挥了三种不同但至关重要的作用。SAF-A帮助连接了Xist和所有到达X染色体DNA上的搭便车的蛋白质，在这里LBR重塑了染色体使得它不太可能表达。Guttman和同事们发现实际的&沉默&工作是由第三个蛋白SHARP完成。
要让一条染色体的基因生成功能性蛋白质，首先必须通过RNA聚合酶II将基因转录为RNA。Guttman和他的研究小组发现SHARP将聚合酶排除于DNA之外，因此阻止了转录和基因表达。
这一信息将有可能很快获得临床应用。Xist
lncRNA定位在X染色体上因此沉默了它。以往的研究证实可以利用这一RNA和它的沉默机器来失活其他的染色体&&例如存在于唐氏综合症个体内的第三条21号染色体。
说&&我们正开始理清lncRNAs发挥作用的机制。例如，我们现在知道了Xist是如何定位到X染色体上的一些位点，以及它是如何沉默转录，如何改变DNA结构的。让我们感到真正兴奋的一件事是，我们有可能利用lncRNAs的这一原理，让它们在基因组四处移动，利用它们作为治疗药物来靶向疾病中特异的缺陷信号通路。&
&我认为它之所以对于我们这一领域以及其他领域如此重要，真正的原因在于这是与我们从前在细胞中看到的不同的一种调控&&是我们从前一无所知的一个广阔的世界。&他说。
原文标题：
原文摘要：Many long non-coding RNAs (lncRNAs) affect gene expression1, but the
mechanisms by which they act are still largely unknown2. One of the best-studied
lncRNAs is Xist, which is required for transcriptional silencing of one X
chromosome during development in female mammals3, 4. Despite extensive efforts
to define the mechanism of Xist-mediated transcriptional silencing, we still do
not know any proteins required for this role3. The main challenge is that there
are currently no methods to comprehensively define the proteins that directly
interact with a lncRNA in the cell5. Here we develop a method to purify a lncRNA
from cells and identify proteins interacting with it directly using quantitative
mass spectrometry. We identify ten proteins that specifically associate with
Xist, three of these proteins&SHARP, SAF-A and LBR&are required for
Xist-mediated transcriptional silencing. We show that SHARP, which interacts
with the SMRT co-repressor6 that activates HDAC37, is not only essential for
silencing, but is also required for the exclusion of RNA polymerase II (Pol II)
from the inactive X. Both SMRT and HDAC3 are also required for silencing and Pol
II exclusion. In addition to silencing transcription, SHARP and HDAC3 are
required for Xist-mediated recruitment of the polycomb repressive complex 2
(PRC2) across the X chromosome. Our results suggest that Xist silences
transcription by directly interacting with SHARP, recruiting SMRT, activating
HDAC3, and deacety
lating histones to exclude Pol II across the X chromosome.
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前辈你好，lncRNA你们是选的哪家公司做的？
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你送出去外包？怎么检测lncRNA?求知？
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susu12345 你送出去外包？怎么检测lncRNA?求知？ 做的基因芯片啊
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亲，我也是作了基因芯片的初步分析，现在不知道怎么挑验证基因，感觉很多的LncRNA在文献里都找不到，请问你现在有头绪了吗。
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wangch84 勿忘心安qian92 亲，我也是作了基因芯片的初步分析，现在不知道怎么挑验证基因，感觉很多的LncRNA在文献里都找不到，请问你现在有头绪了吗。建议你在论坛里搜一下我参与的lncRNA讨论帖子。祝实验顺利。怎么搜呀
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