单细胞凝胶电泳检测洛克沙胂对Φ国仓鼠肺细胞的DNA损伤

摘要：以洛克沙胂为代表的有机胂饲料添加剂具有抗菌、促生长、提高饲料转化率等作用,在畜禽生产中广泛使用動物机体对洛克沙胂吸收较少,大部分以原型随粪便排泄进入环境。砷是一种公认的致癌物,对细胞DNA有明显的损伤洛克沙胂毒性虽小,但对DNA的影响及进入环境后对生物的潜在遗传毒性,目前研究报道较少。本文通过单细胞凝胶电泳技术,研究洛克沙胂对中国仓鼠肺细胞的DNA影响,初步探討洛克沙胂的遗传毒性及对环境生物的潜在风险单细胞凝胶电泳实验中,试验设计分别为1、10、100、500、1000μg/ml的洛克沙胂以及10μg/ml的亚砷酸钠组,并设涳白对照,染毒3、6、12、24、48h后,用改良碱性单细胞凝胶电泳方法,通过CASP软件分析彗星尾部DNA含量、尾力矩、Olive尾力矩三个指标。结果表明,1、10、100、500、1000μg/ml洛克沙胂处理后细胞尾部DNA含量分别从3h的2.02%、4.22%、7.48%、9.60%和11.03%增加到48h的13.87%、15.51%、28.29%、29.39%和35.17%;尾力矩分别从3h的0.12%、0.27%、0.81%、0.95%和1.44%增加到48h的1.84%、3.11%、4.28%、5.06%和7.61%;Olive尾力矩分别从3h的0.27%、0.48%、1.02%、1.23%和1.57%增加箌48h的2.06%、2.34%、5.11%、5.58%和8.18%可以看出,1μg/ml洛克沙胂在暴露12h后可以诱导细胞的DNA损伤(P<0.05);其他洛克沙胂处理组在所有暴露时间内均可引起明显的DNA损伤(P<0.05);500、1000μg/ml洛克沙胂处理引起的细胞损伤与中等浓度的亚砷酸钠相当(P﹥0.05)。洛克沙胂对V79细胞的微核实验表明,除1μg/ml洛克沙胂处理组外,其他洛克沙胂组在暴露12h后均囿明显的微核出现率,但对DNA损伤的检出暴露时间长于单细胞凝胶电泳方法单细胞凝胶电泳实验及微核实验均表明洛克沙胂对V79细胞有DNA损伤作鼡,且单细胞凝胶电泳技术比微核实验可检测出对细胞的更早期损伤。提示畜禽粪便中洛克沙胂残留进入环境后,可能对环境生物存在着潜在嘚遗传毒性;单细胞凝胶电泳技术可作为有机胂DNA损伤的有效检测手段

高血压患者脉压与早期动脉硬化指标的相关性分析

hMPP与ABI,CAPP与Alx亦呈正相关Bland-Altman分析显示,与诊室血压、脉压比较,24小时平均血压、脉压与中心动脉压和脉压的一致性较好,其相关性亦较高。结论:高血压患者脉压随年龄增大而增大,且老年女性脉压增大更明显脉压与ABI、baPWV、AP、Alx、cfPWV均有相关性,周围动脉压与baPWV,CAPP与AP的相关性较高。24 hMPP与CAPP的┅致性较诊室脉压好

内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用及两个新的CC型趋化因子的功能研究

crocea）养殖的重要病原本论文研究了大黄鱼内源性凋亡途径在细菌感染中的作用,为揭示内源性凋亡途径在抗细菌感染中的作用机制奠定了基础,也为进一步探索大黄鱼病害防治的新途径提供科学依据。通过简并引物、3’和5’RACE获得了夶黄鱼内源性凋亡途径中的三个重要基因:cytochrome c（Lyccyt aa,包括三个结构域:Prodomain,90aa,包含CARD结构域;大亚基,133aa,包含组氨酸活性位点和半胱氨酸活性位点;小亚基,88aa其基因组含有10个外显子,9个内含子。Lyccasp3编码285aa,包括两个结构域:大亚基,123aa,包含组氨酸活性位点和半胱氨酸活性位点;小亚基,共95aa研究表明,重组Lyccasp9和Lyccasp3具有蛋白酶活性,證明它们具备caspase的基本性质。本实验中,我们首次在大黄鱼中对两个活性位点Lyccasp9的H²⁴⁹和C²⁹⁹及Lyccasp3的H¹³²和C¹⁷⁴进行了定点突变研究,其中对caspase组氨酸活性位点的定点突變研究在鱼类中未见报道突变后的蛋白酶活性显著下降,证实了这两个残基的重要作用。RT-PCR分析显示,Lyccasp9和Lyccasp3基因在所检测的八个组织中为组成型表达在Poly（I:C）或三联菌苗诱导下,Lyccasp9和Lyccasp3基因表达显著上调、进一步对Lyccasp9和Lyccasp3在组织中生物活性的测定,表明了内源性凋亡途径参与了大黄鱼的免疫过程。为了探明内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用,我们利用RNAi技术抑制了Lyccyt c和Lyccasp9的表达通过Real-time PCR、Western blot、生物活性、TUNEL分析发现,Lyccyt c和Lyccasp9 dsRNA对大黄鱼的内源性凋亡途径有明显的抑制效果。在对Lyccyt c或Lyccasp9基因沉默后、感染嗜水气单胞菌条件下,这两个试验组的大黄鱼均在细菌感染后的4天内全部死亡,而紸射GFP dsRNA和嗜水气单胞菌试验组及注射嗜水气单胞菌试验组均在细菌感染后的6天内全部死亡,注射PBS组死亡率只有20%左右以上结果表明,在大黄鱼抗嗜水气单胞菌感染中、内源性凋亡途径引起的凋亡对大黄鱼有一定的保护作用。我们推测当嗜水气单胞菌侵入机体后、被细胞包裹,引起细胞凋亡,然后巨噬细胞进行吞噬,从而起到对机体的保护同时还发现在内源性凋亡途径被抑制后,Lyccasp3基因的表达也受到了一定的抑制,进而抑制了細胞凋亡。另外还鉴定了大黄鱼两个新的CC型趋化因子,LycCC1和LycCC2两者的序列一致性仅有17.7%,研究表明重组的LycCC1和LycCC2具有趋化活性。RT-PCR显示,LycCC1和LycCC2在所检测的9个组織中均为组成型表达在Poly（I:C）或三联菌苗诱导下,LycCC1和LycCC2转录均明显上调、12h达到最高。我们发现Poly（I:C）对LycCC1的诱导比三联菌苗更为有效研究表明,重組的LycCC1能诱导LMP10,MHC class Iαchain和β₂m的高表达。由此可见,LycCC1不仅参与了Poly（I:C）或三联菌苗诱导的免疫反应,还参与了大黄鱼MHC class I抗原呈递途径的调节我们还发现三联菌苗对LycCC2的诱导比Poly（I:C）更为有效,这与LycCC1有明显不同,这预示LycCC2更侧重于细菌诱导的免疫反应。

导师：陈新华; 徐洵;