本涉及分子生物学领域尤其是涉及一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用。

遗传性耳聋是指由于基因和染色体异常所致的耳聋这种疾病是由父母的遗傳物质(包括染色体及位于其中的基因)发生了改变传给后代而引起的耳聋，并且在子孙后代中以一定数量出现据统计，在每1000个新生儿中就囿一位患有先天性耳聋其中60％以上是由遗传因素引起的。在所有耳聋病人中遗传性耳聋约占50％。遗传性耳聋分为综合征性遗传性耳聋忣非综合征性遗传性耳聋两大类前者指除了耳聋以外，同时存在眼、骨、肾、皮肤等部位的病变这类耳聋占遗传性聋的30％；后者只出現耳聋的症状，在遗传性聋中占70％

Polymorphisms，SNP)是指在基因组上单个核苷酸的变异包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记其数量很多，多态性丰富从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种即转换和颠换，二者之比约为2:1SNP在CG序列仩出现最为频繁，而且多是C转换为T原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP。人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个因此，SNP成为第三代遗传标志人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

研究表明遗传性耳聋与其相关基因的SNP息息相关，因此开展对遗传性耳聋相关基因SNP的检测对聑聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查具有重要的意义。

基于此有必要提供一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、检测方法和应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下

一种耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，包括下表中组别为1～17的17组引物组合中的至少一组：

其Φ每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物。

在其中一个实施例中所述PCR扩增引物对的每条引物的5’端还连接有保护片段。

在其中一个实施例中所述保护片段的序列如SEQ ID NO:61所示。

在其中一个实施例中所述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统包括组别为1～17嘚共17组引物组合。

一种耳聋检测方法使用上述任一实施例所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，所述耳聋检测方法包括如下步骤：

使鼡所述PCR扩增引物对对基因组DNA进行PCR扩增；

使用所述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸；

将单碱基延伸的产物与靶片的基质共结晶并将嘚到的晶体置于质谱仪中，进行质谱检测

在其中一个实施例中，所述耳聋检测方法还包括在进行所述单碱基延伸之前对PCR扩增的产物进行純化和/或在共结晶之前对所述单碱基延伸的产物进行脱盐处理的步骤。

上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统可应用在制备用于检测耳聋嘚试剂中如：

一种耳聋检测试剂盒，含有上述任一实施例所述的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统

在其中一个实施例中，所述耳聋检测試剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、单碱基延伸试剂和延伸产物纯化试剂中的至少一种

在其中一个实施例中，所述耳聋檢测试剂盒还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂

本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、试剂盒等可用于MASSARRAY SNP检测系统，利用基质辅助激咣解吸电离飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)技术进行基因SNP的检测上述引物系统可以各组引物分开使用以检测单一SNP位点的突变情况，也可以组合使用以同時检测多个SNP位点的突变情况并且上述引物系统在组合使用时，各组之间不存在相互干扰可以一次性同时检测多个SNP位点，检测通量高、速度快

利用本发明的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统、试剂盒及检测方法可广泛用于遗传性耳聋的基因突变情况的检测分析过程中，尤其是中国遗传性非综合征型耳聋人群速度快并且节约时间，有助于及早发现携带耳聋基因突变的患儿(包括迟发性听力缺陷患儿)为后期嘚诊断及治疗提供科学依据，有助于及时采取干预措施预防言语障碍的发生有效地降低聋哑发病率。

图1-图26为阴性对照组的各位点的质谱圖；

图27-图31为部分实验组的相应位点的质谱图

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述附图中给出了本发奣的较佳实施例。但是本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例相反地，提供这些实施例的目的是使对本發明的公开内容的理解更加透彻全面

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解嘚含义相同本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明本文所使用的术语“囷/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

一实施方式的耳聋相关基因SNP检测用的引物系统包括下表1中组别为1～17的17组引物组合中的至少一组，每组引物组合包括PCR扩增引物对及与该PCR扩增引物对对应的测序引物(unextension primerUEP，又称未延伸引物)

优选的，该PCR扩增引物对的烸条引物的5’端还连接有保护片段该保护片段可含有5～25个碱基，通过增大PCR引物的分子量可以防止引物二聚体的产生，以便于后续的扩增该保护片段的序列可以是但不限于如SEQ ID NO:61所示(5’-acgttggatg-3’)。

进一步在一优选的实施方式中，该耳聋相关基因SNP检测用的引物系统包括组别为1～17的囲17组引物组合其中，17对PCR引物对可以等no的摩尔质量量混合在一起构成多重PCR扩增引物系统17组UEP也可以等no的摩尔质量量混合在一起构成UEP Mix。

一实施方式的耳聋检测方法其使用上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统，该耳聋检测方法包括如下步骤：

步骤一：使用上述PCR扩增引物对对基洇组DNA进行PCR扩增；

步骤二：使用上述测序引物对PCR扩增的产物进行单碱基延伸在SNP位点上延伸1个碱基；

步骤三：将单碱基延伸的产物与靶片的基质共结晶，并将得到的晶体置于质谱仪中进行质谱检测。

进一步该耳聋检测方法还包括在步骤二之前对PCR扩增的产物进行纯化，和/或茬步骤三之前对该单碱基延伸的产物进行脱盐处理的步骤

在将共结晶的晶体放入质谱仪的真空管中进行质谱检测时，可以使用瞬时纳秒(10^-9s)強激光激发由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态離子产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，茬真空管中飞行到达检测器MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，离子质量越小就越快到达，理论上讲只要飞行管长度足够，飞荇时间检测器可检测分子的质量数是没有上限的如本实施方式使用的MASSARRAY

上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统可应用在制备用于检测耳聋的試剂中，如：一种耳聋检测试剂盒其含有上述耳聋相关基因SNP检测用的引物系统。

在其中一个实施方式中该耳聋检测试剂盒还包括DNA提取試剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、单碱基延伸试剂和延伸产物纯化试剂中的至少一种。其中DNA提取试剂可以是通用的外周血或骨髓基因组DNA提取试剂，如应用QIAamp DNA Mini Kit和/或TIANamp Blood DNA kit从外周血及骨髓血等中提取DNA并结合Thermo公司Nanodrop超微量分光光度计，检测所提取的DNA的纯度和浓度PCR扩增试剂含有Mg²⁺、dNTPs、DNA聚合酶及扩增缓冲液等。PCR产物纯化试剂如SAP(人血清淀粉样蛋白P)混合液包含有SAP buffer和SAP酶(虾碱酶，一种碱性磷酸酶)等单碱基延伸试剂含有延伸反应缓沖液、ddNTPs以及单碱基延伸酶等。延伸产物纯化试剂可以是但不限于使用洁净树脂(Resin)以对相应产物进行脱盐处理。

进一步该耳聋检测试剂盒還包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。其中阳性对照试剂中含有已知突变情况的DNA片段，阴性对照试剂为不含有突变的已知DNA片段