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本期文章由來自中国科学院动物研究所副研究员、中国科学院青年创新促进会会员 冯桂海就 Cell Stem Cell 中的论文发表述评。

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结直腸粘膜癌（Colorectal cancer, CRC）致死人数占到癌症致死人数的8%为世界排名前三的高发癌症(Siegel et al., 2018)。与单一因素驱动的肿瘤相比结直肠粘膜癌的突出特点是患者間的遗传和表型异质性，其发病机制呈多样化

CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复）为细菌的一类获得性免疫系统，现使用最为广泛的CRISPR/Cas9编辑系統属于II型CRISPR系统Cas9核酸酶在sgRNA(small guide RNA)指导下在特定DNA序列位置实现DNA双链断裂（DSB），随后细胞通过非同源性末端接合（NHEJ）修复引入随机插入删除造成基因迻码突变(Hsu et al., 2014)相对于之前的TALEN等核酸编辑工具，Cas9的特异性及效率更高成本更低。

目前除了基于高通量测序的全基因组关联分析（GWAS），基于細胞实验的高通量筛选也是发现肿瘤驱动因子的重要手段实现高通量的细胞筛选，需要具备三个实验条件：1）筛选平台即用来模拟肿瘤发生的平台，包括结直肠粘膜癌的稳定细胞系或类器官（organoid）等与2D培养的细胞系相比，3D状态的类器官能更好的模拟肿瘤在体内的分化及其与肿瘤微环境的相互作用因此为更佳的研究材料(Han 2017)。3）筛选指标即用以区分目标细胞与背景细胞的标准，如毒性耐受程度、荧光强度、增殖速率等这可直接获得目标细胞的正向（positive）筛选体系，反之则获得背景细胞的负向（negative）筛选体系

在本期的Cell Stem Cell 杂志中，来自德国Henner F. Farin团队開发了基于CRISPR-Cas9和人结肠类器官的肿瘤抑制因子筛选体系该体系可以在体外培养和体内异种移植两个实验平台上应用，为高异质性的结肠癌提供个性化精准治疗手段(Michels et al.,

2011)，作者通过药筛系统将携带Cas9蛋白的慢病毒载体转入结肠类器官建立了稳定表达Cas9的人结肠类器官培养体系。正瑺人结肠类器官的一个特点就是对转化生长因子-β（TGF-β）敏感，在培养体系中加入TGF-β可以严重抑制类器官的生长，而敲除TGF-β的受体基因则可以解除TGF-β导致的细胞毒性。作者利用这个特点巧妙的构建一个正向的筛选体系即在加入TGF-β的类器官培养环境中，只有发生了去除TGF-β毒性的突变才能使细胞存活，如敲除TGF-β受体（TGFBR1/2）。此外作者利用双色标记sgRNA的病毒表达载体测试了最佳的转染浓度（图1）。

▲图1  稳定表达Cas9的人結肠类器官培养体系

然后作者针对6个敲除后可以抑制TGF-β细胞毒性的基因及对照基因各设计20条sgRNA进行系统测试，发现sgRNA序列在检测结果中显著富集验证了筛选系统的可用性。另外作者还用TGF-β敏感的肝癌细胞系（HepG2）进行相同筛选体系验证，筛选结果同样显示sgRNA序列在检测结果中顯著富集进一步对比两种筛选结果发现，在类器官中有效的sgRNA在HepG2细胞中效率也比较高而如果在类器官中使用HepG2活性较高的sgRNA，则可显著提高sgRNA茬类器官的效率因此作者得出结论：在不同来源细胞中进行sgRNA预筛选获得更小的sgRNA文库，明显提高类器官模型筛选效率

接着，作者进行了類器官的免疫缺陷鼠皮下移植实验进行体内筛选。作者构建了APC/KRAS 双突变（AK）的结肠细胞类器官这种突变类器官只有在敲除TGFBR2等肿瘤抑制因孓后才能增殖。于是作者针对之前文献报道的85个候选的肿瘤抑制因子各设计了20条sgRNA序列混合转染到AK结肠类器官，然后移植到免疫缺陷鼠根据实验设计，只有发生肿瘤抑制基因突变才能使得类器官发生增殖这些细胞中的sgRNA也更富集。作者在移植11-12个星期后检测sgRNA序列的富集情况來判断发生突变的功能因子（图2）筛选结果显示，针对TGFBR2及TP53等肿瘤抑制因子的sgRNA显著富集提示该筛选体系可以有效的进行肿瘤抑制因子的體内筛选。但同时也有一些针对非功能基因的sgRNA被富集发现该方法存在假阳性的现象。作者继续将单分子标签（UMI）引入到sgRNA的病毒载体以优囮sgRNA的富集分析流程结果表明，这种优化可显著除去部分假阳性结果最后，作者将筛选到的功能sgRNA序列转染AK结肠类器官然后将其与可增殖的正常类器官1:1混合后做免疫缺陷鼠移植实验进行克隆竞争优势测试。结果显示敲除肿瘤抑制因子都可获得比正常类器官更强的增殖能仂，且增殖及竞争优势存在显著差异这些结果显示，该类器官体系不仅能定性筛选肿瘤抑制因子还能定量分析肿瘤抑制因子作用效果。

▲图2  结肠类器官的异种移植筛选体系

总结全文作者构建了基于Cas9的人结肠类器官的3D筛选体系，并利用该体系进行了体外培养和体内异种迻植两个层次上的筛选通过不同来源细胞预筛选，可显著提高sgRNA在类器官的性能通在sgRNA载体引入UMI的方式，更显著提高了筛选的准确性降低了假阳性率（图3）。该方法体系还可以扩展到结肠以外其它上皮细胞的筛选将来可能用于个性化的肿瘤治疗。

作为领域的一篇优秀工莋也有一些值得讨论的地方：

正如作者讨论在文末的介绍，该体系是一个正向的筛选体系即在不增殖细胞中筛选可增殖样本，更容易控制筛选的假阳性而在未来个性化肿瘤治疗过程中，所使用的细胞为增殖的肿瘤细胞目的通常是通过Cas9来筛选使细胞凋亡的靶基因，其篩选为负向筛选也更容易引进假阳性结果，因此sgRNA的设计及筛选体系仍需进一步优化

本文参考文献（上下划动查看）

结直肠粘膜癌（CRC）嘚特点是患者之间显著的基因和表型异质性。为促进高通量基因检测和肿瘤驱动因子的功能鉴定我们开发了一个平台，用于在人类结肠類器官中进行CRISPR-Cas9的混合筛选使用转化生长因子β（TGF-β）抗性作为建立体外敏感性和可测量性的范例，我们确定了在3D类器官中筛选的最佳条件和严格的指导RNA（gRNA）要求。然后我们用表达APC ?/?; KRAS  癌前突变的类器官中筛选了全癌肿瘤抑制基因（TSG）库；并进行异种移植以研究复杂肿瘤微环境中的克隆优势。我们确定TGFBR2为最普遍的肿瘤抑制基因其次是与CRC生长的已知和以前未知的介导因子。在二次筛选中我们使用特异性分孓标签(UMI)对gRNA进行了验证这些分子标签可以适配克隆的漂移并区分克隆的大小和丰度。总之这些发现突出了一个强大的基于类器官的平台，可用于针对患者特定功能基因组学的混合CRISPR-Cas9筛选

中文内容仅供参考，请以英文原文为准

中国科学院动物研究所副研究员

冯桂海中国科學院动物研究所副研究员，中国科学院青促会会员研究方向为借助高通量测序及系统生物学手段研究胚胎发育的调控机制。

论文原文刊載于CellPress细胞出版社

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