?1250?中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　):1250～
二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞差异表达
基因cDNA文库的建立
黄　琛,梁晓秋,凌　晖,黄幼生,向姝霖,肖晓岚,苏　琦
(南华大学肿瘤研究所,湖南衡阳　421001)
中国图书分类号:R412;R512;
文献标识码:A文章编号:04)11-1250-04摘要:目的　建立二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌细胞
MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库。方法　采用抑
二烯丙基二硫(diallyldisulfide,DADS)有明显的抗
肿瘤作用,并对人胃癌细胞有明显的周期阻滞和诱导分化作用,但其分子调控机制未完全阐明[1～3]。本实验选用抑制消减杂交技术,筛选和鉴定在胃癌细胞与DADS处理过的胃癌细胞差异表达的基因,为鉴定诱导分化的关键基因,发现胃癌相关生物标记物,阐明DADS诱导胃癌细胞分化的分子机制,开拓防治胃癌的新途径奠定基础。1　材料与方法
1.1　材料　人胃癌细胞M制消减杂交技术,筛选DADS处理人胃癌细胞MGC803细胞后差异表达的相关基因。经过抑制消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增,获得富集的差异表达的cDNA文库,PCR检测插入片断的阳性克隆。结果　建立DADS诱导人胃癌
MGC803细胞差异表达基因的cDNA文库,并从消减文库中
随机挑取的100个白色克隆中筛选个阳性克隆,发现插入片断为100～600bp。结论　应用抑制消减杂交方法可有效筛选DADS处理人胃癌细胞MGC803细胞后差异表达的相关基因,其消减cDNA文库的建立,关新基因,深入揭示DADS的重要线索。
关键词:胃癌;;;cDNA文库
公司产品,d428,%,含有10%～)。DADS与Tween80以1,加入体积分数为0190的生理盐水稀释100倍,震荡混匀,作为母液保存于-20℃冰箱中,临用时将此母液稀释至所需浓度。RPMI1640培养基、TRIzolReagent为Gibco公司产品。PolyATtract?mRNAIsolationSystems、pGEM?2TEasyVectorSystems和Wizard?PlusMiniprepsDNAPurificationSystem为Promega公司产品。ClontechPCR2SelectTMcDNASubtractionKit和Advantage?cDNAPCRKit&PolymeraseMix为Clontech公司
　　目前,基因功能研究已成为生命科学研究领域
的重要课题,其核心内容主要是鉴定已知基因的新功能和寻找未知基因两个层面。近年来研究表明,
收稿日期:,修回日期:
基金项目:湖南省自然科学基金资助项目,No02JJY2026;湖南省卫
生厅科研基金资助项目,NoY022064;湖南省重大专项基金资助项目,No04sk1004
作者简介:黄　琛(1979-),女,硕士生,Tel:,E2mail:
1.2　细胞培养及实验分组　人胃低分化粘液腺癌
苏　琦(1946-),男,教授,博士生导师,通讯作者,研究方向:肿瘤病因发病学及防治,Tel:,E2mail:
细胞MGC803细胞(5×106?L-1)用含100U?ml-1青霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃5%CO2培养。取对数生长期MGC803细胞,按所需浓度接种于培养瓶,待培养24h后,加用含有30mg?L-1DADS的培养液,培养24h,为实验组groupTweremoreseverethanthoseingroupPur.Conclusion　Chineseherbpuerarincanprotectlungagainstreperfusioninjuryafterthrompolytictherapyinacutepulmonarythrombembolismwhichmaybeassociatedwithanti2oxidationaction.
Keywords:Ppulmreperfusioninjury
afterembolizationbothingroupTandgroupPur(P
&0105),thecontentofMDAbegantoincreaseat2hafterthrombolysis(P&0105);At2hand4hafterthrombolysis,theactivityofSODwashigher(P&0105,P&0101)andthecontentofMDAwaslower(P&0105,P&0101)ingroupPurthanthoseingroupT.③Histopathologicanalysisshowedthein2juriesofendotheliumsandtypeIIalveolarcellsin
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细胞(DADS803细胞)。未加DADS处理的MGC
803细胞(MGC803细胞)为对照组。1.3　细胞总RNA提取和mRNA分离　总RNA的抽提按照TRIzolTM试剂说明书进行,分别提取实验组细胞(DADS803细胞)和对照组细胞(MGC803细胞)总RNA。细胞mRNA的分离采用Promega公司的PolyATtract?mRNAIsolationSystems分离,提取的mRNA用于合成双链cDNA。
1.4　抑制消减杂交　采用Clontech公司的PCR2SelectTMcDNASubtractionKi,以实验组细胞(DADS803细胞)作为Tester,对照组细胞(MGC803细胞)作为Driver,组成抑制消减杂交(SSH)系统。将Tester和Driver细胞的mRNA逆转录形成cDNA,RsaⅠ酶切消化成短的(400～600bp)片段;将Tester的cDNA分为2管,分别连接Adapter1和2R,然后分别与DrivercDNA杂交;合并2种杂交产
度,结果显示cDNA与接头连接效率大于25
%,见Fig2。
物后再与DrivercDNA同时混合做第二轮杂交。经过两轮杂交后,Tester中高表达的cDNA片段两端分别接上Adapter1和2R。杂交产物通过巢式聚合酶链反应选择性扩增,使TestercDNA或高表达的片段得到特异性扩增1.5　Promega?TeasyVec2torSystems,pGEM?2Teasy后,转化JM109感受态细胞,进行克隆化。从平板上随机挑取100个白色菌落,采用Wizard?PlusMiniprepsDNAPurificationSys2tem提取质粒,以巢式聚合酶链反应引物Nest1和Nest2为引物进行PCR扩增鉴定。2　结果2.1　显微镜观察　MGC803细胞体积大,胞质相
　polyA+RNA
inC803cellsandDADS803cells
Fig2　Resultsoftheligationefficiencyanalysis
对少,细胞核大,染色深,核仁明显,大部分细胞2～5个核仁,可见核分裂。DADS803细胞体积大,胞质丰富,细胞核变小,染色变淡,核仁数量明显减少,大部分细胞为1～2个核仁,可见多个核膜消失,胞浆变红,核内染色加深的分裂前期细胞。2.2　MGC803细胞和DADS803细胞mRNA检测　使用高质量的mRNA是保证cDNA高产量的前提。1%琼脂糖凝胶电泳见mRNA为&015kb清晰慧尾片状条带,见Fig1。
2.3　接头连接效率检测　RsaⅠ酶消化产物cDNA
　　Lane1:PCRproductsusingTester121(Adaptor12ligated)asthe
templateandtheG3PDH3’PrimerandPCRPrimer1;Lane2:PCRproductsusingTester121(Adaptor12ligated)asthetemplate,andtheG3PDH3′and5′PLane3:PCRproductsusingTester122(Adaptor2R2ligated)asthetemplate,andtheG3PDH3′PrimerandPCRPrimer1;Lane4:PCRproductsusingTester122(Adaptor2R2lig2ated)asthetemplate,andtheG3PDH3′and5′Primers.1%agarose/
φX174DNA/HaeIIIdigestsizemarkersEtBLaneM:
2.4　消减效率的PCR鉴定　分别以消减及未消减PCR产物为模板,用G3PDH引物进行PCR扩增,
与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败的最关键步骤。将分别连接Adaptor1和Adaptor2的两组cDNA分别用不同的特异性引物扩增,1%琼脂糖凝胶电泳分析产物,通过对比条带的亮度和宽
分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。Fig3结果显示:与未消减组PCR产物相比,消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少,说明所构建的消减文库
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?1252?中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　
具有很高的消减效率
Fig3　ResultsofthePCRanalysisofsubtractionefficiency
　　PCRwasperformedonsubtracted(Lane1～4)orunsubtracted
(Lane5～8)secondaryPCRproductwiththeG3PDH5′and3′primers.Lane1and5:18Lane2and6:23Lane3and7:28Lane4and8:33cycles.LaneM:φX174DNA/HaeⅢdigestsizemarkers
达。因此,研究DADS诱导人胃癌细胞差异表达基
因谱,对于揭示胃癌发生发展和DADS抗肿瘤作用的分子机制是非常必要的。
目前有很多分离差异表达基因的方法,如差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD2PCR)、消减杂交(subtractivecDNAhybridization,SH)、cDNA代表性差异分析(cDNArepresentationaldifferenceanalysis,cDNA2RDA)和RNA指纹技术(RNAfin2gerprinting)等。1996年Diatchenko等建立的基于抑制PCR基础上的抑制消减杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH),凭借其高水平富集、低背景值和对高、低丰度的目的基因均可有效富集的特性,成为目前快速克隆差异表达基因cDNA的有效方法[13],已经在肿瘤、器官发育、信号转导等
方面有了许多成功应用的范例[14。。
为克隆到细胞不同时相的相关基因,未对细胞进行周期同步化处理。30L处理MGC803h后,化,,但很可能,使提取的polyA+RNA,可能包含了细胞周期阻滞早中晚期的信息。因此在进行消减杂交后,就有可能克隆到各个时相的相关基因,有利于保持差异表达信息的完整性。
抑制性消减杂交中,adaptors的连接是关键步骤,只有连接效率大于25%才能保证实验的成功。连接效率分析结果说明,adaptors的实际连接效率大于25%,高于所要求的最低值。而RasⅠ酶切效果直接关系到adaptors的连接效率,当115h酶切结束后,发现酶切效率不高时,可再次酶切后再进行adaptors连接。消减效率分析结果显示,消减组PCR产物直到28次循环后,才出现少量G3PDH扩增产物,说明所构建的消减文库具有很高的消减效率。质粒DNA提取和PCR检测证明DNA插入片段大小为100～600bp片断,也符合设计要求。本实验首次成功建立了二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞差异表达基因cDNA文库,为从功能基因组层面研究DADS抗肿瘤作用和胃癌发生发展的分子机制提供了重要的分子生物学基础。参考文献:
[1]　张良运,凌　晖,苏　琦etal.二烯丙基二硫对人胃癌
MGC803细胞生长的影响[J].世界华人消化杂志,):1290-3.
[2]　彭　军,苏　琦,宋　颍etal.二烯丙基二硫对胃癌MGC803
2.5　差异带的克隆和酶切鉴定　从平板上随机挑
取100个白色菌落,提取质粒DNA,经PCR反应鉴定发现,插入片段长度100～600bp,与理论设计的
大小符合。测序和分子序列分析将后期报道。3　讨论
流行病学和实验性研究表明,]基二硫(diallyl效活性物质,,对胃癌、白[1,2,4],并可诱导鼠红白血病细胞DS19向红系分化[5],本实验室先前研究发现DADS也可诱导人白血病HL260细胞和人胃癌MGC803细胞向成熟细胞分化[3,6],并对MGC803细胞有G2/M期周期阻滞作用[3]。目前认为DADS抗癌机制可能与防止致癌物的形成与活化,增强解毒酶的功能[7];刺激机体免疫反应,增强抗肿瘤免疫调节机制[8];阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡[3,6];增强组蛋白乙酰化,促进细胞分化[9,10];干扰癌细胞信号传导途径及影响癌基因与抑癌基因的表达[11,12]有关,但是其具体的分子机制尚不清楚。
现代分子遗传学研究表明,胃癌是一种多基因疾病,其发生涉及140多种基因及其相关产物,包括癌基因、凋亡及细胞周期相关基因、生长因子及其受体基因、信号转导相关基因及其蛋白,以及免疫因素等。多种胃癌相关基因以扩增、重排、缺失等方式导致mRNA转录及其产物异常,作用细胞发育的不同阶段的不同环节,引起转导信号紊乱,最终导致胃癌的发生发展。而在DADS诱导胃癌细胞分化和周期阻滞的过程中必然也涉及多种相关基因差异表
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　　1　抑制消减杂交技术
　　1．1　基本原理
　　抑制消减杂交(SSH)主要基于抑制性PCR与eDNA消减杂交(subwaefive hybridization)技术。所谓抑制性PCR就是通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)，使非目的片段两端接上同一接头．该接头具有反向末端重复序列，在退火时链内退火优于链间退火．使非目的序列片段产生类似&锅柄&的互补结构．在PCR时无法与引物配对．从而选择性抑制非目的序列的扩增。SSH的消减富集则运用了杂交二级动力学原理．即高丰度单链在退火时杂交形成双链的速度快于低丰度单链．从而使原来在丰度上有差别的单链相对含量达到基本一致．即低丰度差异表达的基因不会丢失．而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。
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　　1．2　特点
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