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为何只有二聚体
请教：克隆菌液PCR检测时，所有样品都只有二聚体、无目的带出现。之前纯化回收的PCR产物检测是有目的条带的。难道连接问题，PMD-19连接的效率那么低吗，25个样全是二聚体啊，晕死了，求帮助！
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ＰＣＲ引物二聚体及杂带，why及对策急求助
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这个帖子发布于11年零265天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠：　　在下跑ＰＣＲ时出现较明显引物二聚体，但无所要目地带，或部分有较亮目地带仍伴较明显引物二聚体，我该如何处理？引物二聚体的形成对目地带的产生及产量有多大影响？另在ＰＣＲ时，我所需目地带应为２７０bp,但多次ＰＣＲ产物跑胶时在约５００bp处可见很亮带，而２７０bp处仅有很淡条带或无目地带，Ｗhy?我该如何处理，恳请各大侠．高手指点，在下万份感激，急盼佳音，多谢！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００４.１１.２１
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你可以少加点引物或者提高些退火温度，如果还不行可以考虑换一种引物500bp的带很可能是污染了，出现假阳性关于pcr中遇到的假阳性和假阴性等问题你可以参考以下文章： 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。　(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.　(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.　(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
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污染的监测　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验　1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。　2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。　3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增防止污染的方法(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
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关于丁香园400-666-3332
PCR克隆试剂盒
您现在的位置是：北京康润科技有限公司 &
GenStar产品
T168 EZ-T(TM) Fast Ligation Kit
销售价(RMB)
加入购物车
EZ-T(TM) Fast Ligation Kit是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。EZ-T载体是基于pBlueScript II SK(+) 质粒，在EcoRI识别位点处添加了适当序列，经酶切处理后获得具有突出的3’-端T碱基的线性载体。该载体可与Taq 或Tth 等DNA聚合酶催化的携带3’-端A碱基的PCR产物互补连接，以利于下一步克隆或测序。由Pfu、Pwo、Vent或KOD等高保真DNA聚合酶催化反应的PCR产物，也可经Taq DNA聚合酶添加3’-端A碱基后，与EZ-T载体连接。
EZ-T(TM)载体多克隆位点区插入位点两侧均设计了EcoRI酶切位点，因此既可使用EcoRI单酶切，也可使用其他适当的内切酶双酶切，释放插入片段进行检测或亚克隆。EZ-T(TM)载体不含NdeI或NcoI限制性内切酶位点，故可用于克隆含上述酶切位点的基因。DNA测序建议使用M13 Forward和M13 Reverse或T7 promoter和T3 promoter 通用型引物。
·&&PCR产物测序和亚克隆
·&&利用lac promoter进行基因表达
o 阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10%
o 方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化
o EZ-T(TM)载体含多个常用酶切位点，利于无适当酶切位点DNA片段的亚克隆
o 无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆
o 提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照
o 蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深
o 批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测
EZ-T(TM)载体 (40 ng/μl)
Control Insert（40 ng/μl）
EZ-T(TM) DNA Ligase
2× Ligation Buffer
-20℃恒温保存一年，－80℃长期保存。蓝冰（市内）或干冰（外埠）运输
插入DNA对照与载体连接的摩尔比例为3:1时，蓝斑率低于5%，有90%以上的白色菌落含插入DNA对照片段。经测序确认多克隆酶切位点及T碱基存在。
EZ-T(TM)载体环形图谱
EZ-T(TM)载体的多克隆位点区序列
1．按下表配制连接反应体系：
EZ-TTM Cloning Vector（40 ng/μl）
PCR Product
Control Insert（40 ng/μl）
EZ-TTM DNA Ligase
2 x Ligation Buffer
Sterilized ddH2O
定溶到 10 μl
注：使用EZ-T连接试剂盒应严格遵循无菌操作规程，以防细菌污染造成试剂盒组分失效。
2．混合，短暂离心。
3．25℃反应5分钟。
4．取2 μl连接反应液加入至50 μl感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5．42℃加热45~60秒钟，冰中放置2分钟。
6．加入800 μl SOC或LB培养基，37 ℃250 rpm振荡培养40~60分钟，使β-内酰胺酶基因表达。
7．在含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养过夜。
8．挑选白色菌落，使用质粒快速提取法（EZ-Lyse克隆快速检测试剂盒，Cat No. T171）或菌落PCR法（EZ-PCR重组菌落PCR检
测试剂盒，Cat No. T172）鉴定是否有插入片段。
Q1：TA克隆对PCR产物有何要求？
A1：首先，PCR应使用无校读活性的DNA聚合酶(如Taq或Tth)以确保PCR产物的3’末端有突出的A碱基。使用高保真DNA聚合酶(如Pfu、Pfx、Pwo、Vent、Phusion、KOD等)扩增的平末端PCR产物不能直接进行TA克隆，但可使用Taq DNA聚合酶添加3’-端A碱基后，再与T载体连接。其次，TA克隆最好使用经过纯化的PCR片段。特异性好的PCR产物可不经过切胶回收纯化，但应采用柱纯化或乙醇沉淀的方法去除残留引物、dNTP、引物二聚体等，再与T载体连接，否则影响克隆效率。
Q2：PCR引物设计对TA克隆效率有无影响？
A2：引物的5’-末端设计为G或A更有利于提高TA克隆效果。
Q3：为何有时切胶回收的PCR产物TA克隆效率仍然很低？
A3：经切胶回收纯化的PCR产物具有更高的TA克隆阳性率。然而如果PCR产物在紫外线下暴露的时间过长，会引起DNA变性而降低连接效率。因此切胶时动作要快，尽量减少紫外线下暴露的时间。
Q4：为何有时切胶回收的PCR产物TA克隆后检测发现插入的片段大小不一？
A4：切胶回收应采用新鲜配置的琼脂糖凝胶和电泳缓冲液，否则回收的DNA片段极有可能被凝胶或电泳缓冲液中残留的DNA污染。
Q5：为何有时得到的蓝色菌落也含有插入片段？
A5：1 kb以下的插入片段在没有破坏lacZ基因的读码框的情况下会产生蓝色或淡蓝色的菌落。因此如果观察到整板都是蓝色或淡蓝色菌落时，不妨挑选一些进行筛选。
Q6：EZ-T载体可以克隆的PCR片段大小的上下限是多少？
A6：EZ-T载体推荐用于克隆50 bp~3 kb的PCR片段。经验表明，3 kb以上片段的连接和转化效率比较低，此时可通过加大EZ-T载体用量、适当延长连接时间和使用转化效率高的感受态细胞来提高克隆阳性率。
Q7：EZ-T连接反应产物是否能进行电转化？
A7：使用EZ-T连接试剂盒中提供的2x快速连接反应体系进行连接得到的产物不适于直接进行电转化。连接反应产物须过柱纯化或乙醇沉淀回收后，方可进行电转化。
Q8：EZ-T Ligation Kit应如何保存？
A8：EZ-T Ligation Kit应于-20℃或-70℃保存。2x预混连接反应体系由于含ATP，对温度变化非常敏感，因此融化和使用过程中应置于冰上，单次用量小，应予分装。EZ-T载体和插入DNA对照可耐受10次左右冻融，应避免长时间放置于室温状态以及反复冻融，以免3’-端突出的碱基丢失。
Q9：PCR产物应怎样保存才能保持TA克隆的效率？
A9：PCR产物如不立即用于TA克隆，可于-20℃保存一至两周。长期保存会造成3’-A碱基缺失，造成克隆阳性率下降。也可通过Taq酶加A的方法提高克隆成功率。
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北京昌平区生命园路29号创新大厦B座208室 京公网安备案83号PCR扩增产物的克隆实验方法的比较 - 生物实验室知识 -
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PCR扩增产物的克隆实验方法的比较
本帖最后由 寒枫 于
13:18 编辑
PCR扩增产物的克隆可以：（1）获得目的DNA片段；（2）用于原核表达的研究；（3）广泛应用于分子生物学相关研究。
平端连接法
实验方法原理：
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
实验步骤：
一、PCR反应
1.&&依次混匀下列试剂
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4种dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2.&&将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3.&&用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1.&&酚/氯仿法
（1）取反应产物加100 μl TE。
（2）加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2.&&Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1.&&将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2.&&在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3.&&加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4.&&按前面三中所述，用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
5.&&加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1.&&在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2.&&加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3.&&取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1.&&在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2.&&37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3.&&用酚:氯仿抽提2次。
4.&&乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5.&&质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6.&&取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
注意事项：
1.&&PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。
2.&&PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3.&&吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4.&&加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5.&&应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6.&&纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7.&&PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
一、 PCR反应中的主要成份
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
2.&&4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
（1）dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。
（3）理论上4 种 dNTP各20 μmol/L，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
（1）Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
（3）在PCR反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。
（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5.&&Taq DNA聚合酶
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
（1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6.&&反应缓冲液
（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
（2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。
（3）各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
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实验方法原理：
TA克隆 系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点（MCS）中。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
实验步骤：
一、大肠杆菌感受态细胞的制备
1.&&取大肠杆菌JM109保存液50 μl，接种于4 ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300 rpm振荡培养过夜，第二天取50 μl 转接到新的4 ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中，冰浴10 min。
2.& &4℃，5 000 rpm离心2 min，去上清液。
3.&&加入750 μl预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体，冰浴30 min。
4.& &4℃，5 000 rpm离心2 min，弃上清液。
5.&&加入100 μl 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2 h后，4℃保存备用。
二、重组DNA的转化
1.&&将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。
2.& &于100 μl感受态细胞中加入10 μl连接产物，冰浴30 min。
3.&&将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2 min。
4.&&在离心管中加入SOC培养基300 μl，枪头混匀，37℃、150 rpm温和摇振60 min。
5.&&将200 μl 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
三、重组质粒的鉴定
方案一： 菌落PCR
（1） 制备PCR混合液。
（2） 用经灭菌的10 μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
（3） 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。
（4） 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
（5） 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。
（6） 取5 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二： 质粒PCR
1.&&碱裂解法少量制备质粒DNA
（1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。
（2）用250 μl已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。
（3）加入250 μl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。
（4）加入400 μl Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2 min，14 000 rpm离心10 min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。
（5）将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm离心1 min。
（6） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 μl Buffer W1，5500 rpm离心1 min。
（7）弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm离心1 min，以同样的方法再用700 μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
（8） 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm离心1 min。
（9）连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30 μl Eluent或去离子水。
（10）室温静置2 min，14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。
（11） 取5 μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
2.&&抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。
（1） 加TE稀释质粒DNA溶液至300 μL。
（2）加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3 min。
（3）14 000 rpm 离心5 min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3 min。
（4） 14 000 rpm离心5 min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3 min。
（5） 14 000rpm离心5 min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15 min，沉淀质粒DNA。
（6） 14 000rpm离心13 min，弃上清液，沉淀加入200 μL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。
（7） 取5 μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
3.&&质粒PCR
（1） PCR反应体系如下：
（2）PCR 扩增反应条件：94℃预变性3 min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：
94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。
（3） 取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。
注意事项：
1.&&要获得目的基因的TA克隆 ，PCR 产物的特异性要好。
2.&&PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。
3.&&在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
4.& &制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。
5.&&42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。
6.& &菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
8.&&Ligation Solution I 请于冰中融解。
9.&&在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。
10.&&克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。
11.&&按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。
12.& &连接反应请在16℃下进行，温度升高 (&26℃) 较难形成环状DNA。
13.& &连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。
14.& &感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。
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