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柿单宁聚合相关基因的克隆、表达分析及功能验证
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分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 柿单宁聚合相关基因的克隆、表达分析及功能验证 EXPRESSIoN MoLECULAR ANALySESAND CLoNING FUNCTIoNALCoNFIRM随LTIoNoFrII．删IN PoL蜘ⅥERIZATIoNGENED呵PERSIMMoN 研究生：胡倩妮 指导教师：罗正荣教授 指导小组：李国怀教授 李春美教授 j 程运江教授 。 胡春根教授 刘继红教授
专 业：果树学 研究方向：种质资源
获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2011年6月 华中农业大学园艺林学学院 园艺植物生物学教育部重点实验室 二O――年六月 ’＼1黜嬲 华中农业大学学位论文独仓lj性声明及使用授权书 ’? 学位论文 是否保密 岔 l如需保密，解密时间 年
月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得畴研究成
果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发
表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机梅的学位或证书
而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一筒工作的嚼志对本研究所做的任
何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．
’毗签名删砖p 帆删年石M旨 学位论文使用授权书 ’本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，审学生必须按照学
校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的审刷版和电子版，
并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存。￡编学位
论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不雨媒体上发表、传播学位论文的全
部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力．
注：保密学位论文 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专科等
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薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究.pdf56页
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内蒙古农业大学
硕士学位论文
薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研
姓名:张雪荣
申请学位级别:硕士
专业:林木遗传育种
指导教师:慈忠玲
通过方法用兼并引物从薰衣草中克隆了一个的序列.在
里进行序列比对后与芳樟醇合成酶具有最大的相似性,为%。通过’
和’技术克隆到了基因的全长序列,为,其蛋白序列
为个氨基酸。蛋白序列与单萜类合酶基因的蛋白序列进行比对,此序列具有单
萜类合酶的所有保守氨基酸功能序列以及端的功能基团。核酸及蛋
白序列功能分析表明所克隆的基因属于芳樟醇合酶基因家族,命名为。设计全
长引物,得到了的全长。用全长引物从薰衣草中克隆到了基因组全长序
列,为。对其进行分析表明,基因组序列含有个内含子,个外显子。
结果表明在薰衣草中可能存在个拷贝数。构建了的原核表达载
体、植物转基因表达正义及反义载体。原核表达结果表明表达出来的蛋白与所预期
的蛋白大小是一致的,约为。用植物表达载体经烟草叶盘转化法侵染了野生型
烟草。通过的筛选以及提取烟草基因组,用的方法得到了转基因烟草的阳
结果分析表明转基因烟草的正义和反义植株都有了表达,
有些没有表达可能是发生了基因沉默。
以百合为材料,摸索了百合的生长愈伤以及分化的条件,为下一步的百合转基
因做好了基础。
关键词:薰衣草:单萜;芳樟醇合成酶;
.内蒙古农业大学
研究生学位论文独创声明
本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究
工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的
地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究
正在加载中，请稍后...合成大片段基因的瓶颈是什么？我们离人工制造一个生物还有多远？
我们已经得到了许多物种的完整碱基序列，却仍然无法将其基因人工合成，目前也仅成功了序列较短的酵母菌基因。为什么基因合成做不到像3D打印一样？大片段基因合成的难点是什么？我们离人工制造一个生物还有多远呢？
按时间排序
谢邀，我的答案就作为
的补充。最大的瓶颈就是error rate还是太高，生物体内合成，拿人的DNA polymerase II来讲，出错率是10^-10（AT，GC配对10^-3，长链歧视其他配对10^-2，proofreading10^-2，之后的 修复10^-3），这样的精确度确保了合成1mbp 或1000kbp都有99.9%的正确率，自然不是问题。但是人工合成的现在还基本依赖PCR技术，而最初用到PCR的Taq酶有10^-5的出错率（配对和长链歧视）。现在改进的我就不清楚了，但肯定没有之后修复机制的10^-3，即便出错率降低到了10^-6，合成大片段正确率依旧很低。这就是个数学问题：正确合成率 = (1 - 出错率)^(bp数)10^-5出错率合成10kbp正确率是90%，100kbp正确率是36.8%。10^-6出错率合成10kbp正确率是99%，100kbp正确率是90%，1mbp正确率是36.8%。10^-10出错率合成1mbp大约是99.9%的正确率，合成10mbp正确率是99%。结果显而易见。
十年之后，我终于等到了这一刻。眼前，积满灰尘的试验台上，整整齐齐摆满的，是七七四十九台24k纯金镶钻的PCR仪，不会有人知道，为了集齐它们，这十年之间，我走过了多少地方，越过了多少艰难险阻，付出了怎样的艰辛努力。随手倒满一杯香醇的EB溶液，我的心里，早已悲伤逆流成河。十年之前，我便早已明白，人工合成大片段基因的瓶颈，也不过是三件事，足够好的运气，足够多的金钱，以及不顾一切的勇气。当然，如果不是遇见她，这一切都还无从谈起。那是十年之前的某个昏黄夏日，在校园的一角，吃完八个炸鸡腿，我无意中轻轻回眸，刚刚好看到白衣飘飘、笑靥如花的她。同学，你节操掉了。她指了指我随手扔掉的塑料袋，轻启朱唇，对我含笑低语。人生若只如初见，疑是银河落九天。后来我从同学口中得知，她是生物系的系花，名字叫朱香翠。攒峦业崿射朱光，丹霞翠雾飘奇香。美人四向回明珰，雪山冰谷晞太阳。那是多么诗情画意的名字。我本以为，我这辈子都不会再去生化实验室那种鬼地方了，但就是因为这怦然心动的瞬间，我决定改写我的人生道路。两个月后，我如愿转到了生物系，和香翠成为了一个实验室的同门。每天，翠都在废寝忘食的做实验，她曾对我说，人类已经得到了许多物种的完整碱基序列，却仍然无法将其基因人工合成，目前也仅成功了序列较短的酵母菌基因。为什么基因合成做不到像3D打印一样？如果能完全人工合成一大段完整、自洽的基因序列，就可以升级我们人类自身，甚至可以创造出一个崭新的生命，那将是一件多么了不起的事。每次听她兴高采烈的描述着她那流光溢彩的梦想，我都只会在她的身侧，低着头长久的沉默不语。就算成功了那又如何，试想，被肆意改造升级的自己，还能算是原来的那个真实的自己吗。两个月后的一天， 她突然兴高采烈地对我说，她已经推算出了最完善的试验方法，那一刻，正在洗刷刷的我的手中的锥形瓶轰然落地。她说，引物我已经设计好了，现在，就差集齐七七十四九个24k纯金镶钻的PCR仪，然后，实验便可以顺利开展，我们便也因此将迈入一个全新的时代。这是第一次，我看着她微笑的样子，却一点也高兴不起来。我只是试探着问她，那49个PCR仪该怎么弄，要知道，她父亲是摊煎饼果子的，她母亲也是摊煎饼果子的，虽然月入不菲，但是能一下子拿出买49个纯24k金镶钻的PCR仪的钱，也是有些困难的。而我，虽然又高又帅，但是每个月的生活费也只有五百块。所以我在那时候还心存侥幸地想，她是不可能轻易开展那疯狂的实验的。但是，天有不测风云，人有旦夕祸福，福不双至，祸不单行，行万里路，读万卷书，书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。当天晚上，一直哈哈哈哈哈大笑的翠突然提议请我吃大餐，她说，有一个惊天的好消息要告诉我，那时候，我隐隐的已经有了些不祥的预感。那天，翠儿点了五盆我最爱吃的锅包肉，可是，对我来说，却是那般的食之无味，仿若嚼蜡。她告诉我，她在知乎上发了一个帖子，把自己大概的想法说了出来，然后，一个神秘的黑衣人很快私信了她，决定无条件给她金钱上的帮助。并且，一个小时后就给她的账户上面打过来了000美元。我当时好奇的问她，你怎么知道那是一个黑衣人。当时，她已经眉开眼笑的忘乎所以，竟还告诉我不要在意这些细节。翠儿啊，收手吧，小心掉进万劫不复的陷阱，我善意而理智地提醒她。那钱已经打过来了，我也要开工了，你如果不支持我，就请安静的走开。还有，希望你能够暂时帮我保守秘密。那晚，由于谈的并不开心，锅包肉我们吃的竟还剩了一盆，并且最终，倔强的我们还是闹个不欢而散。第二天，翠就从学校神秘地消失了，没有人知道她去了哪里，当时，我觉得我的世界都塌了。我万万没有想到，她竟然会如此决绝地离开，只是为了那个危险的梦想。于是，我毫不犹豫的退了学，背上行囊飞奔向火车站，不管天涯海角，我都要找到她！找到她！找到她！人海茫茫，我也没有什么明确的目标，但我坚信，只要她暂时不离开地球表面，便总会留下些蛛丝马迹。当然，我是一个非常上进的阳光美男子，我在寻找她的同时，也一直不忘努力拼搏，最后，经过三年的不懈努力，我终于成了全球最大的生化集团之一——噗噗呼啦啦啦啦啦国际的总裁。为什么是之一，因为，还有一个和我们在这方面势均力敌的生化集团，叫做神秘生物集团，就和他们的名字一样非常的神秘。可是，这么多年过去，我已悄然升职加薪，当上总经理，出任CEO，走上人生巅峰。可我却依然没有找到她。那个明媚忧伤的美丽女子，就仿佛人间蒸发了一般，再也没有重归我的视线。这几年，我一直都在拼命努力的收购各种大大小小的去研究人工合成大片段基因的科研机构，一是希望得到些关于翠儿的线索，二是我从始至终都是这项技术忠实的反对者。我也知道，这项技术的实现可以使生物学研究进入一个崭新的时代，但同时，我也知道，如果失控的话，它将给人类带来怎样的灭顶之灾。很不幸的，这灭顶之灾，在几亿年前，我曾亲身经历过一次，并且，作为幸存者，我现在唯一的信念就是阻止这悲剧的再次重演。那时候，我还不是现在这个模样的我，只是一条普普通通的噗噗呼啦啦啦啦啦虫，没房没车，也没有像模像样的好工作，但是每天还是活的非常开心哒，因为非常非常喜欢我的一个邻居，一条非常非常非常美丽的女噗噗呼啦啦啦啦啦虫。对了，我们族类可是当时地球的唯一智慧生命，虫均智慧非常高，文化水平非常高，生活水平非常高，而且福利待遇也非常的好。并且，已经掌握了先进的合成大片段基因创造新物种的核心科技。可是，天有不测风云，人有旦夕祸福，福不双至，祸不单行，行万里路，读万卷书，书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。一个无聊的家伙突然有一天无意中培养出来了一种合成新物种——人类，他们的繁殖速度非常非常快，十几二十年就能繁殖一代，要知道，我们种族繁殖一代需要一千年的时间啊！后来，人类越来越多，越来越多，越来越多，并且，有一天，他们种族爆发了一种疾病，人流感，虽然，这种疾病对他们没什么大碍，但对我们的肉体来说，却是完全致命的打击，无论多么高科技，根本就是无药可医。最后，没有办法，一个噗噗呼啦啦啦啦啦科学家被逼研究出来一个新的技术，就是把我们的所有基因片段移植到一些人类的身上，这样，这个噗噗呼啦啦啦啦啦虫的思维便会完全占领这个人类的思维，并且，这个被移植的人以后的世世代代，都会延续被移植来的那个噗噗呼啦啦啦啦啦虫的全部思维，换句话说，我们只是把人类当做寄生的躯壳而已，并且，在某种层面上，我们得到了另一种意义上的永生。可是， 并不是所有人都愿意生娃，或者能生出个娃， 所以，经过几亿年之后，我想，像我这样，寂寞而坚韧地存活下来的家伙，应该已经寥寥无几了吧。我曾痛恨我这个陌生的样子，讨厌用别的种族的样子这样存活下去，即使，可以活的如此的久。但我也承认，我就是个懦夫，即使这样自以为苟且地偷生，却始终没有自行了断的勇气。这样多年，我都无聊而低调的活着，看过很多很多不一样的风景，不同的时代变革，变得越发的麻木与坚强，甚至，有时候，都觉得自己已然和人类没有什么不同了。即使是使我们渐渐灭亡的人类，我渐渐也不再那么的恨了，他们也无过错，活下去，是所有文明的祈望，当自己的种族经历那样的磨难之后，我终于明白，没有什么，比活下去是更有意义有希望的事情了。记得翠说过，人工合成大片段基因，说不定可以给我们带来永生的希望。当时我没有说，这也许是一把双刃剑。转眼，十年过去。虽然对我而言，也不过仅仅是生命中的一瞬而已。这十年，我前所未有的努力，终于，集齐了那49个24k纯金镶钻PCR，要知道， 那不仅仅是金的那么简单，复杂的技术让它非常难以制作，所以，即使是当年得到那笔资金，她也不一定能弄出三台来。我做这些，想法非常简单甚至愚蠢，就是为了引她出来，我想在有生之年再见她一面。我的有生之年也许会生生不息，但是她不一样。这么多年，这是我第二次感受到爱上别人的感觉。所以，才会如此的不顾一切。集齐之后，我在各大论坛贴吧放出话来，宣布我的公司集齐了所有硬件设备，今天晚上，就将开工正式实验。地点，就是我多年前的学校的生物实验室改装的超级实验大楼。她会来吧。她一定回来的。我的潜意识不止一次这样告诉自己。半夜十二点。呼啦一声惊天动地，一队全副武装的人马冲进了实验室。没错，神秘集团的人，他们比我们更胜一筹的就是，连军方都能联合起来。为首的，是一个美如画的红衣女子。我就知道，你会来。呵呵。她冷笑。把技术交出来，我或许会放你一条活路。她对我说。十年前你是骗我的吧，你根本没有研究出实验方案，也没有神秘黑衣人资助你，对不对。她点了点头。你知道我掌握这个技术，就差那些PCR仪了对不对？我又问。她又点了点头。我后来才知道，还是因为收买了你的贴身小秘书才知道的，你怎么知道我的秘密的？这是困扰我十年的一个问题。这一次，她看了我一眼，沉默不语。当时为什么不直接问我，让我告诉你具体怎么做。因为没钱啊，我想，给你些时日，你一定会想办法筹齐经费去制造PCR的。你可真了解我。我呵呵呵呵。因为，我认识你很久了，很多年前，我们是邻居啊，呵呵呵呵。你你你你，敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦，我听见自己吐血的声音。没错，我和你是同类，只不过我的信念和你的是完全相反的，我需要这个技术，恢复我们原本的样子,想当年，不就是你发明了这个技术才使我们种族遭遇灭顶之灾的么，现在，你就应该对此事负责……敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦……可是，我已经听不清她继续再说神马了，这么多年，我从来没有想过，我会因为过度悲伤百感交集，带着这个核心技术，吐血离开人世。于是，人工合成大片段基因的瓶颈将继续存在，至于接下来大家会怎么去突破瓶颈，就和我没有半毛钱关系了。。。。。。。。。。。。
怎么debug？
关于合成DNA的原理，楼上各位已经介绍很多了。的确，目前在DNA分子的合成层面，最大的技术困难就是如何合成长链的DNA分子。另一个重要的问题是，合成的DNA分子如何进行高效的组装？传统的限制性内切酶效率低、限制多；新兴的gibson assembly方法依赖于PCR，但只要是PCR，在基因组水平的DNA组装上，就一定会发生突变；不依赖于PCR的golden gate方法目前是最可靠最高效的方法，新近一系列基因组水平DNA合成的文章大都采用了此方法。然而即便如此，也只是一次组装5~8个长度在1k~2k之间的片段，比起基因组水平动辄以百万碱基作为单位的长度，还是小巫见大巫。通量低必然导致成本高，也就成了合成大片段DNA的最大门槛。
因为没有这方面的需求。具体的回头补充。被催了简单说两句，我们现在对生命的认识，都是基于已有生命来的，因此合成新生命，最简单的办法还是基于已有生命的改造。
关于题主最后一个问题，有兴趣可以研究下一门叫做合成生物学的学科。
现在最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法，从3‘到5'合成，1、脱保护基 (Deblocking)用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。2、活化 (Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。3、连接 (Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。4、封闭 (Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。5、氧化 (Oxidation)缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。因此每增加一个碱基需要5步反应，即使假设每一步效率是99%，那么总的效率也是0.99^(5*碱基长度)，用科学计算器很容易算出来100bp的最终目标产品的占总量的比例。因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。在纯化过程中，这种合成不完全的短片段是可以被去除的，因此化学合成的精确性是没有问题的；但是Hecker,KH使用两条长123和126的化学合成的DNA，用DNA聚合酶进行primer,extension并且酶切连接转化后检查in vivo的复制发现： Five of the ten inserts sequenced contained errors, including seven single-base-pair deletions, one four-base-pair deletion and one G--&C transversion. The origins of the latter two errors are unclear, but single-base deletions are inconsistent with e thus, the most common sequence errors of chemical synthesis are deletion mutations. Deletions are most likely to result from incomplete capping or de-tritylation. 好像不知道为什么合成的DNA复制错误率还是挺高的，这篇太老了下不到我就懒得再找全文了……现在也全基因合成，乃是把基因组分别设计成很多短片段然后一步步PCR得到的(Hoover, D. M., & Lubkowski, J. 2002)，要合成一个10kb的全基因，想想就真是一件天怒人怨的事情啊……
@ 泻药，问题提得非常好，我就曾幻想有一种分子摄影机，它可以像拍电视似得记录细胞内各种分子的动态，那样我们就不必去验证各种分子机理（谁激活谁，谁抑制谁，谁和谁一同发挥作用blabla），不去花大量的时间制样做电镜，我们想知道什么看个video 就好了么。但是我们不能，因为目前工程技术还不能够达到这样随心所欲的水平。利用3D打印技术合成全基因组，从分子层面操纵生命？现阶段同理也不能实现。直接获得大片段基因，只能借助克隆。而所谓的从头合成大片段基因，是靠一小段一小段的DNA拼接而来，其中的缘由知友已经解释过了，不再详述。我们可以寄希望于工程师，或许他们能设计出3D打印分子技术？！也未可知。话说回来，即便能够合成基因，也不意味着能够制造生命，这样有点唯基因论了。细胞的生命是由其物质环境和能量环境所控制的，而不是其基因。基因只不过是用于细胞、组织和器官构造的分子蓝图。而环境却像一个“承包商”，解读、运用那些基因模型，并最终为细胞的生命性状做准备。使生命机制投入运作的，是单个细胞对环境的“认知”，而不是基因。——《信念的力量：新生物学给我们的启示》美 布鲁斯·H·利普顿我的理解，合成基因是制造生命的一小步。一个很有意思的人——已经开始着手研究，参见。他的团队用合成一段基因，置换一个自然细胞的基因组，得到了Mycoplasma laboratorium，这大概是我们现阶段为人工制造生命做出的努力，但正如克莱格自己所说的“我们并不认为这是‘从零开始创造生命’，更确切地说，我们能用合成的DNA，从已经存在的生命创造新生命。”总之，实现de novo 合成生命，“任重而道远”。
谢邀，正如评论所说，每一句问题描述都是一个课题。对于我这种得个目的片段用PCR，合成DNA片段找公司的人来说，我尚未遇到瓶颈哈哈。对于题主的问题也只能翻翻文献给个我认为能解释的答案。回答这个问题，不明确的地方有：大片段基因有多大，多少bp算大？题主所指的基因概念模糊，是单个基因还是基因组？目前单个基因以及多个基因的合成技术很成熟了，但是大片段的（≥100kbp）DNA合成研究的较少，难度也很大。目前人工合成基因的方法除了从自然界中获取样品再通过PCR（聚合酶链式反应）扩增外，就是用化学合成的方法合成而不需要模板。化学方法合成主要是固相亚磷酰胺三酯法，原理看下面参考文献，也有其他人提到了，合成的寡核苷酸链越长，得率越来越低，出错率越来越高，因此目前不可能用化学方法愣头愣脑直接合成哇长哇长的DNA片段。大片段DNA合成的基本策略是：1、将dNTP(也就是原料)按照要求的DNA序列合成寡核苷酸；2、将寡核苷酸组成较短的DNA序列（400-600bp）；3、将短的DNA序列通过融合连接的方法连成长的基因序列（＞1kbp）；4、通过普通的酶连接法或细胞体内重组合成更长的基因和组成基因组的长片段(≥ 10kb)；5、在大肠杆菌及酵母中依次组装，最后达到超过1 Mb的基因组；6、将合成的基因组移植到细胞中去，并使合成的基因组的基因按要求表达。大片段基因的合成难点在哪？大致的理由其他人也说了，DNA长，周期长、易出错。1、合成成本高。合成1Mbp的双链DNA大约需要20w美元。这只是碱基的价钱，还有时间、基因设计分析等等；2、DNA合成过程易出错，出错概率在1-11个/kbp,那么，每合成一段DNA则需要测序比对，找到突变位点并修复，这个过程复杂又漫长；我们离人工制造生物还有多远？世界上有很多课题组有基因合成和人工生命合成尝试。想要得到像人这样复杂的生命体还要很久，目前都是合成原核生物的基因组。以下是个例子：2010年《Science》杂志发表的文章“Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome”介绍了 J. Craig Venter课题组人工合成1.08Mbp的基因组导入到 M. capricolum的受体细胞中并创造出新的M. mycoides细胞，可以认为是人工合成的生命结构，该细胞内只含人工合成的DNA序列并且有预期的表型，同时能够连续复制。下图是该课题组人工合成基因的方法大致流程是在体外合成110个10kbp的DNA（蓝色片段）并在酵母细胞中装配，这110个DNA片段10个为一组连成11个100kbp的片段（绿色片段），最后将这11个大片段连接成基因组（红色环）。整个基因组包括4个watermarker及若干酶切位点以保证有选择性标记。大致流程是在体外合成110个10kbp的DNA（蓝色片段）并在酵母细胞中装配，这110个DNA片段10个为一组连成11个100kbp的片段（绿色片段），最后将这11个大片段连接成基因组（红色环）。整个基因组包括4个watermarker及若干酶切位点以保证有选择性标记。其实单纯的合成大片段基因只要有钱有时间有精力，慢慢搞肯定能搞出来，更难的在于基因的排列、非结构基因分析、代谢通路、蛋白组学的研究等等，这些问题没有解决的情况下，人造生物的合成那还差得远。不知此回答题主满意否 参考：Gibson DG et al. Creation of a bacterial cell controlled by achemically synthesized genome. Science, : 52-56王冬梅.从碱基到人造生命——基因组的从头合成.生命的化学
吐槽下知乎不能编辑表格还要我截图。大肠杆菌复制相关蛋白我的意思很简单，就算是大肠杆菌这么简单的原核生物，DNA复制都需要这么多酶。我的意思很简单，就算是大肠杆菌这么简单的原核生物，DNA复制都需要这么多酶。目前基本上合成DNA都是用的化学方法，想要完整不出错的复制完高等生物那几个G的DNA链，难度不下于猴子随意敲键盘，结果打出来一部莎士比亚全集。
赞同 和 的回答，人工合成大片段基因第一步就是合成长核苷酸链的问题，因为核苷酸是一个个加上去的，即使每一步得率都很高，但一旦长了就没有办法。现在我们在invitrogen合成引物（单核苷酸链），单条在56个（好像？）核苷酸以下的一个价，56个以上的另一个价，最长不能超过120个（好像？），这似乎就是目前用固相亚磷酰胺三酯法合成引物的极限了。因为基因组是双链的，我们可以通过合成互补的两条单链退火得到需要的双链，这样得到的不过是一百来个碱基对的DNA双链。而最小的有细胞结构的生物的基因组也有160kb之巨。为了得到更长的DNA双链，我们可以用分子生物学的工具来做到。比如，在模板存在的情况下，我们可以通过PCR的方法，使用高保真的聚合酶，一次性扩增产生10kb以上的片段；我们还可以通过限制性内切酶和连接酶的工具，将多个DNA片段连结上；我们也能通过使用quikchange诱变的方法对DNA序列进行小范围的修改；我们还能通过BAC、YAC等载体将得到的超长片段在细菌或酵母内保藏、扩增。如果不考虑基因组的装配，以现在的技术，我们是能够获得长达一万kb的DNA双链的，请看这货的工作：。基因合成无法做到像3D打印的原因是尺度不同，3D打印是在宏观尺度上材料的构筑，而基因合成是在分子尺度上的化学反应，它们的原材料服从的物理规律不一样。除非咱能得心应手地操作单分子。如果我们硬要从一堆无机物，de novo做一个生命出来，俺不知道还有多远，不过乐观估计是以十年为单位计算的。这个问题可能是没有意义的，因为以现有的生物资源，我们似乎只用在它们的基础上进行修改、不断地修改，就能够满足人类的需求了。而这样的事情，不是有人在做么？此所谓：转基因。
合成越到后面，效率越低。最后得到的产物少得可怜，又有非常多的杂片段，得想办法纯化。
如果你能完全人工合成一大段完整、自洽的基因序列，也就意味着你可以创造一个生命。基因都是“活着”的。基因不是计算机程序代码，装在硬盘里就可以实现调用、运行、拷贝等等。这也是DNA测序计划完成数十年后，再也没有什么飞跃性进展的原因之一。人类想要工业化利用已知的基因序列知识，目前还很难。这也是为什么网上很多人吐槽生物科学研究周期慢、效率低的原因。1.模拟活体生物分子活性所需的环境，代价太过昂贵。很多生物分子，包括基因序列，都只是在人体的某个非常苛刻的环境下才发挥那一点点作用，采用理科的思维，将其剥离到人工环境下观察，需要的代价太大。2.寻找可以被人类利用，来进行简单而精确的逻辑操作的“工具酶”很难（酶是由生物自己产生的，生物进化到现在不可能会允许自己的基因被别人随意当作“工具”）3.这类研究经济效益很低。人体本身就是一个最好的“生物工厂”，就算你费尽心机去摸透了人体所有基因的表达和运行方式，我们大部分人还是该吃吃，该喝喝。并且，从伦理上、道德上，想要改变生命自身的规律是“禁忌”的。连一个“转基因”食品，各界人物都可以在完全不知内情的情况下随意品评的社会，大刀阔斧地深入研究，很难。以上三点，可以看出生物研究、基因研究还处在“黑箱实验”阶段。类似于物理学中的“薛定谔之猫”的表述。我们的实验对象、实验途径都是自己不可控制的。我们产出的产品甚至可能不如野花野草熬成的苦水汤有效。对于这些，我们只能“讲道理”。但是道理，永远在消费者一边。以上。
即便是每一步产率都有95%，每一步能精确连接1个核糖，那么1000个核糖的单链DNA总产率就是0.95的1000次方 5.29e-23....有机狗内流满面，全合成狗倒地不起_(:з」∠)_
因为真的很难“精确合成”就像你弄出个10节车厢的火车还好，弄出个100000节车厢的火车，有点难度离人工制造生物距离大概100年吧，当然，人工修改也许六七十年就可以做到
问题在于连接效率。片段越长连接效率越低。
已有帐号？
无法登录？
社交帐号登录}