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课程名称：微生物学检验技术 授課专业：医学检验 学时：2学时 实验十二 大肠埃希菌、产气杆菌检验 一、实验目的 1.掌握E.coli、产气杆菌的分离培养与鉴定方法； 2.掌握E.coli、产气杆菌嘚形态、染色特性、培养特性、生化反应及鉴定依据 二、实验器材与试剂 1.菌种： 普通E.coli、产气杆菌 2.培养基：SS,中国兰,KIA,MIU,蛋白胨,葡萄糖蛋白胨水,枸橼酸盐琼脂斜面, 硝酸盐 culture media 3.试剂： 20%尿素， 0.4%酚红水溶液 1%中国兰水溶液，20%乳糖水溶液 1%玫瑰红酸酒精液1%溴麝香草酚兰酒精溶液 靛基质试剂 甲基紅试剂 VP试剂（40%KOH肌酸溶液）， 氧化酶试剂与纸片3%过氧化氢， 4.革兰染液擦镜纸，电吹风显微镜，恒温箱 三、实验内容 ㈠ 标本的采集： 肠噵细菌感染可采集粪便肠道外感染可根据临床感染情况采集中断尿液，血液脓汁，胆汁脑脊液，痰分泌物，水等 ㈡检验程序 E.coli、產气杆菌 接种 SS，中国兰KIA，MIU蛋白胨水，葡萄糖蛋白胨水 枸橼酸盐琼脂斜面，硝酸盐 culture media 37℃ 24h 观察分析结果 吲哚试验 VP试验 甲基红试验 GS 报告结果 ㈢培养基的制备（Producting culture media）: 1.SS culture media(Samonella-Shigella培养基) （重点 ） ⑴成分： ①营养物：示胨，蛋白质牛肉膏 ②抑制物：煌绿，胆盐硫代硫酸钠，枸橼酸钠（抑制非病原菌生长） ③促进剂：胆（碱）盐 （促进病原菌生长） ④鉴别用糖：乳糖 ⑤指示剂：中性红（酸红碱黄） ⑵原理： 能利用乳糖的细菌產酸使指示剂变红色；枸橼酸铁能使产H2s的菌落中心呈黑色；硫代硫酸钠有缓和胆盐对痢疾杆菌沙门菌的有害作用，并能中和煌绿和中性紅的毒性 ⑶用途： 是一种强选择culture media 用来分离肠道致病菌 用（附：现在Ssagar一般使用成品，只要按一定的量加入蒸馏水即可无需调PH值，无需灭菌） ⒉中国兰 culture media ：弱选择culture media ⑴成分： 普通ager 100ml 乳糖（20%水溶液） 1g（5ml） 1%中国兰水溶液 2ml 1%玫瑰红酸乙醇液 1ml 配好后culture media呈淡红色 ⑵原理： 玫瑰红酸能抑制G+菌的生长因其是酒精配制无需灭菌，但加时应避免开火焰 能分解乳糖的细菌产糖，菌落呈蓝色不分解乳糖细菌呈淡紫红色。 中国兰与玫瑰红酸的变色范围如下： 指示剂 酸性 碱性 中国红 蓝色 微蓝至无 玫瑰红酸 黄色 红色 ⑶用途： 分离肠道致病菌用 ⒊KIA culture media（双糖铁培养基）（重点、难点） ⑴成分： 蛋白胨 FeSO4 NaCl 硫代硫酸钠 葡萄糖（1g） agar 乳糖（10g） 0.4%酚红 牛肉膏水 （附：现一般使用成品，0.7kg 15min 高压灭菌制成斜面培养基） ⑵原理： ①葡萄糖，乳糖的分解： 细菌分解葡萄糖乳糖产酸产气使斜面与底层钧成黄色（酚红指示剂变色范围：酸黄碱红），具有气泡若细菌分解葡萄糖而不分解乳糖，分解乳糖产酸使culture media的PH下降因此斜面和底面均成黄色，但葡萄糖含量较少（葡萄糖：乳糖=1：10）所产生的酸可因接触空氣而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氧物质生成碱性化合物使斜面部分又变成红色底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸┅时不被氧化而保持黄色 ②细菌产H2S可与culture media内的FeSO4作用形成黑色的沉淀。 ③硫代硫酸钠是防止FeSO4被氧化 (3)用途: