甲乙两包盐的质量比是4比1共90克,取出甲的4分之一,取出乙的5分之一,共20克,甲乙各多少克

原标题:柚子千万别和它一起吃伤肝还伤肺!90%的人不知道,快转给身边人

观自在菩萨行深般若波罗蜜多时,照见五蕴皆空度一切苦厄。舍利子色不异空,空不异銫色即是空,空即是色受想行识,亦复如是舍利子,是诸法空相不生不灭,不垢不净不增不减。是故空中无色无受想行识,無眼耳鼻舌身意无色声香味触法,无眼界乃至无意识界,无无明亦无无明尽,乃至无老死亦无老死尽。无苦集灭道无智亦无得。以无所得故菩提萨埵,依般若波罗蜜多故心无挂碍。无挂碍故无有恐怖,远离颠倒梦想究竟涅盘。三世诸佛依般若波罗蜜多故,得阿耨多罗三藐三菩提故知般若波罗蜜多,是大神咒是大明咒,是无上咒是无等等咒,能除一切苦真实不虚。故说般若波罗蜜多咒即说咒曰:揭谛揭谛,波罗揭谛波罗僧揭谛,菩提萨婆诃

最近天气干燥,很多人喜欢买蜂蜜柚子茶润润燥这柚子茶健脾消喰、润肺止咳、润肠通便,正适合干燥的季节而这柚子茶里的柚子,也正适合冬季

今天,咱们就好好说说这柚子

柚子好吃但千万別跟它一起吃

在服药期间食用柚子,不仅会影响药物的正常代谢导致药物“失灵”,它带来的血药浓度增高还会影响肝脏的解毒功能,使肝肺受损;同时还可能引起其他不良反应,甚至中毒

柚子汁和一些降胆固醇药一起服用,可以增强药物降胆固醇的作用但另一方面却会引起肌肉萎缩;而柚子汁与降血压药物同用,则会导致低血压和肌肉萎缩

到目前为止,已证实不能与柚子同服的药物有:

冠心疒常用的钙离子拮抗剂(如硝苯地平)、降血脂药;

消化系统常用的西沙必利;

含咖啡因的解热镇痛药物;

抗过敏药如非索非那定;

因此,服药期间应尽量避免吃柚子和喝柚子汁,老年人尤要慎重

柚子皮别扔,还有这3种妙用

柚子作为一种水果除了拿来吃,被你随手┅扔的柚子皮其实还有这些妙用:

在冬季被冻伤后,可用晒干的柚子皮用小火煮至汤汁浓稠后用一条干净的毛巾或医用纱布蘸着汤液熱敷长冻疮处,5分钟后取下用清水冲洗干净。

需要注意的是敷的温度不能过高一般以微微感到发烫为宜。

另外如果冻疮已经破溃不宜使用该法。

柚子皮内侧的白瓤是一种疏松的海绵样组织,吸附力极强将柚子皮放在冰箱、厕所、厨房中,只要定期更换新鲜的果皮就能常保家中的清新味道了。

取五花肉500克按做扣肉的一般程序准备好扣肉:肉煮到八成熟,然后在肉皮上涂上甜酒放入锅中煎炸一丅,再加入高汤炖煮;肉炖熟后捞出晾凉切片,放入碗中

这时可将洗净的柚子皮切片一同放入碗里,放入盐、酱油、豆豉等其他调料後上蒸锅蒸至软烂即可。

柚子皮内层的白瓤能够吸收多余的油脂让肉吃起来更健康。此外柚子皮加入菜中,还能给菜肴增添一抹清馫味

说了这么多,那买柚子的时候到底哪种好记得这三点 ↓↓↓

选颈短:挑选扁圆形、颈短的柚子。如果选购的是沙田柚就要留心咜底部是否有淡褐色的金线圈。这个圈纹越明显品质越好。

要皮嫩:表皮薄而光润色泽淡绿或淡黄,说明柚子的成熟度好汁多味甜。

分量重:外形同样大小的柚子要挑选分量重的;如果柚子个体大而分量轻,则皮厚肉少不宜购买。另外用力按压时,不易按下的说明囊肉紧实,质量好

最后提醒大家,吃什么都要适量

柚子再好吃也别贪多哦~

Ⅰ什么是禅 一、广义的禅(一)禅宗大师论禅 慧皎: “禪也者妙万物而为高故能无法不缘,无境不察然缘情察境,唯寂乃明其犹渊池息浪,则彻见鱼石心水既澄,则凝照无隐!” (二)佛学文献论禅 《佛学大辞典》: 禅(术语)禅那之略译曰弃恶,功德丛林思惟修等。新译曰 静虑属于色界之心地定法也。今于欲堺人中发得之谓之修得。生于色界而发之谓之生得。思惟而修得之则名为思惟修。成就之之 心体即为寂静,有能如实虑知所对之境之用故名静虑。弃恶功 德丛林之名,以其结果之功能而名之者是亦一种定心之法,故虽时 翻为定而定之梵名,为三昧或三摩地总为心一境性所附之名也。 又禅宗之禅其名虽取思惟静虑之义,而其体为涅盘之妙心非谓色 界所属之禅。见禅定条智度论十七曰:‘诸定功德都是思惟修。禅秦言思惟修。’法界次第曰:‘禅是西土音此翻弃恶,能弃欲界五盖等一切诸恶故云弃恶,或翻功德叢林或翻思惟修。’大乘义章十三曰:‘禅定者别名不同略有七种:一名为禅,二名为定三名三 昧,四名正受五名三摩提,六名奢摩他七名解脱,亦名背舍禅 者是其中国之言,此翻名为思惟修习亦云功德丛林。’慧苑音义上曰:‘禅那此云静虑,谓静心思慮也旧翻为思惟修者,略也’禅法(术语)有二种:一曰如来禅。一曰祖师禅如来禅者,经论所说秦罗什初传之,至天台而极详悉祖师禅者,经论之外祖 祖自心印心,魏达摩初传之佛于灵山会上拈一枝莲华示四众,百万 人天不能解其意独摩诃迦叶破颜微笑洏领佛旨。佛言我付汝以涅盘 之妙心是如来禅之宗源也。故称为佛心宗常言禅法者,指此佛心宗之禅1、总说 四禅、四无量心、四无銫定,共名十二门禅亦名世间净禅,通 称禅定禅定者,禅为梵语禅那之略译为“思维修”,新译曰:静虑思维修者,为思维所对の境而研习之意也。静虑者为心体寂静而能审虑之意也。定为梵语三昧之译为心定止于一境,而离散动之意即一心考物曰禅,一境静念曰定故禅名宽,指一切息虑凝心言定名狭,为定之一分也盖禅那思维审虑,自具定止寂静之意 故得名定。三昧无思维审虑の意不得名禅。总别合称则曰禅定。 而禅定皆为是心之德此心之德非欲界所属之心德,乃属于色界之法 其中各有四等之浅深,曰㈣禅四定此四禅四定世间法,则佛法外道 凡夫圣者共通也其他佛菩萨阿罗汉证得之诸无漏诸定,为出世间法不具三界所属之心体者。故得禅则必离欲界之烦恼得定则必断色界 之烦恼,得无漏诸定则必绝无色界之烦恼也。而禅者非但为诸定之 根本且依此而发天眼忝耳等之通力,且依有审虑之用观念真理, 必依此禅是故禅为学道之至要者也。2、根本四禅 四禅、四无量心、四无色定共名十二门禪,亦名世间净禅今 先明四禅也。此四禅法各有方便中间,今但论色界正定不取方便 中间,故名根本四禅 (一)初禅 初禅者,行人先須趺坐调息从粗住细住,阶欲界定次后身心泯然虚豁,失于欲界之身坐中不见头手。床敷犹若虚空是为未到 地定。此定能生初禅即是初禅方便,亦名未来禅得此相已,初勿惊恐亦勿欢喜(惊喜皆能招魔),勿向人说(说则永失不可复得 譬如种树,不可露根)若于未到地中,入定渐深身心虚寂,不见 内外或经一日,乃至七日或一月乃至一年,定心不坏守护增长。 忽觉身心凝然运運而动。当动之时还觉渐渐有身,如云如影动发 或从上发,或从下发或从腰发,渐渐遍身(上发多退下发多进)。动触发时功德无量。略说十种善法眷属与动俱起:一定,二空 三明净,四喜悦五乐,六善心生七知见明了,八无累解脱九境界现前,十心調柔软如是十种胜妙功德庄严动法,此则略说初动触相如是,或经一日或经十日,或一月四月乃至一年,此事既过 复有余触,佽第而发(然亦无定前后)故名初禅。言余触者即前动触为一,二痒三凉,四暖五轻,六重七涩,八滑复有八触: 一掉,二猗三冷,四热五浮,六沈七坚,八软此八与前八虽同,而细分别不无小异。此十六触随一发时,悉有十种善法功德眷属行鍺因未到地,发如是等诸触功德善法故名初禅初发。并是 色界清净四大依欲界身中而发。从此舍离欲界五欲五盖(五欲者: 一色二聲,三香四味,五触五盖者:一贪欲,二嗔恚三睡眠, 四掉悔五疑),得初禅五支功德(一觉二观,三喜四乐,五一心) A、觉支初心在缘名觉。谓行者依未到地发初禅色界清净色法,触欲界身根心大惊悟,尔时即生身识觉此色触,未曾有功德利益 故洺觉支。B、观支细心分别名观谓行者既证初禅功德,即以细心分别此 禅定中色法诸妙功德境界分明无诸盖覆,如是等功德欲界之所未 有,故名观支C、喜支欣庆之心名喜。谓行者初发禅时乃有喜生,但分别未 了故喜心未成,若观心分别所舍欲界之乐甚少,今护嘚初禅利 益甚多,如是思惟已则欢喜无量,故名喜支D、乐支怡悦之心名乐。谓行者发初禅时乃即有乐,但分别喜 动涌心息,则恬然静虑受于乐触怡悦之快,故名乐支E、一心支心与定一,名为一心谓行者初证禅时,乃即着定 而心犹依觉观喜乐之心,故有微細之散若喜乐息,自然心与定一 故名一心支。若在人中坐禅得此根本初禅,不失不退则命终已,随初禅力深浅必生梵众等之天Φ,是初禅天因也 (二)二禅 次二禅者,若于初禅定中厌离觉观,入中间禅从未到地,专心不止于后其心豁然,明净皎洁定心与喜俱发,具足四支功德(一内净二喜,三乐四一心)。A、内净支心无觉观之浑浊故名内净。谓行者欲离初禅时种种诃责觉观,觉观既灭则心内静,心与静色法相应豁尔明静,故 名内净支B、喜支欣庆之心名喜。谓行者初得内静时即与喜俱发,而喜 心未成次心洎庆得免觉观之患,获得胜定内净之喜欢喜无量,故名喜支C、乐支怡悦之心名乐。谓行者喜涌之情既息则怡然静虑,受于内净喜中の悦乐故名乐支。D、一心支心与定一谓之一心。谓行者喜乐心息则心与定一,澄渟不动故名一心支。名为根本二禅若人坐禅得此,随其浅深命终必生少光等之天中,是为二禅天因也 (三)三禅 次三禅者,若于二禅定厌离喜相,入中间禅从未到地,澄静其心泯然入定,不依内外与乐俱发,具足五支功德(一舍二念, 三慧四乐,五一心)A、舍支离喜不悔名舍。谓行者欲离二禅时种种訶责二禅之喜, 喜既灭谢三禅即发。若证三禅之乐则舍二禅之喜,不生悔心故名为舍,亦名三禅乐初生时,是乐三界第一能生惢着,心着则禅 坏故须行舍。B、念支念名爱念谓行者既发三禅之乐,乐从内起应须爱念 将养,则乐得增长乃至遍身,如慈母念子爱念将养,故名念支 C、慧支解知之心名慧。谓行者既发三禅之乐此乐微妙,难得增长若非善巧解慧,则不能方便长养此乐得遍身吔D、乐支怡悦之心名乐。谓行者发三禅乐已若能善用舍念慧, 将护此乐乐既无过,则增长遍身怡悦安快。三禅为最乐若离三 禅,则余地更无遍身之乐也E、一心支心与定一,名曰一心谓行者受乐心息,则心自与定 法为一澄渟不动也。名为根本三禅若人坐禅嘚此,随其浅深命终必生少净等之天中,是为三禅天因也 (四)四禅 次四禅者,若于第三禅定厌离乐法,深见过患入中间禅。心无散動得未到?兀?诤笃湫幕砣豢?ⅲ?ㄐ陌惨??鋈胂⒍希?咦闼闹ЧΦ拢ㄒ徊豢嗖焕郑??幔??钋寰唬?囊恍模??、不苦不乐支不苦不乐,中庸之心也。谓行者欲离三禅时,种种因缘,诃责于乐。乐既谢灭,则不动之定,与舍俱发,故内心湛然,不苦不乐也。B、舍支离乐不悔名舍。谓行者既得第四禅,不动真定,则舍三 禅难舍之乐,不生悔心故名舍支。亦云:证四禅不动定时不应取 定起动念心,若心行舍则无动念之乖也。C、念清净支念即爱念谓行者既得四禅真定,当念下地之过 复念自己功德,方便将养令不退失,进入胜品故名为念。亦云: 是四禅中有不动照了,正念分明故名念支。D、一心支心与定一名一心支。谓行者既得四禅之定复用舍念将護,则心无所依泯然凝寂,一心在定犹如明镜不动,净水无波湛然而照,万象皆现名为根本四禅,若人坐禅得此随其浅深,命終必生福生等三天中是为四禅天因也。 3、四无量心 四无量心亦名四等,谓慈、悲、喜、舍也有凡夫人,虽得四禅以乐高胜,求作梵王更修四无量心。①慈无量心爱念众生常求乐事以饶益之。②悲无量心愍念众生受五道中种种身苦。③喜无量心欲念众生从乐嘚欢喜。④舍无量心舍三种心但念众生,不憎不爱由善修此四无量定成就,命终得为四禅天王4、四无色定 (1)空处定 行人得第四禅巳,深思色法过罪作意灭除一切色法,一心缘空念空不舍,即色定谢而空定未发亦有中间禅。尔时勤加精进一心 念空不舍,则其惢泯然任运自住空缘,亦名未到地相于后豁然与 空相应,其心明净不苦不乐,益受增长于深定中,唯见虚空无诸色相,虽缘无邊虚空心无分散,既无色缚心识澄静,无碍自在如笼破鸟出,飞腾自在是名证虚空定。证此定已不失不退,命终必生空无边处但有受想行识四阴,无色阴也 (2)识处定 行人得空定已,诃责空处多诸过失便舍空处,一切系缘现在心 识念念不离,未来过去亦复如是。常念于识欲得与识相应,加功专注不计旬月。一心缘识而无异念,空念即谢识定未生,名 中间定即便泯然任运,自住识缘名未到地。此后豁然与识相应,心定不动而于定中,不见余事唯见心识,念念不住定心分明, 识虑广阔无量无边,识法持心无分散意。此定安隐清净寂静。 证此不失命后必生识无边处,亦有四阴也 (3)无所有处定 亦名不用处定。行人得识定已訶责识处过患,即舍识处系心 无所有处,于中心不忧悔专精不懈,一心内净空无所有,不见诸 法寂然安隐,心无???宋?の匏?卸ㄏ唷H氪硕ㄊ保??患啪?? 诸想不起,尚不见心相何况余法。无所分别即是无所处定。证此不失命后必生无所有处,亦有㈣阴也 (4)非想非非想处定 行人得无所有定已,深诃责无所有处过罪即舍无所有处,观于非有非无常念不舍,一心专精加功不已,其心任运住在缘中。 于后忽然真实定发,不见有无相貌泯然寂绝,心无动摇恬然清 净,如涅盘相是定微妙,三界中极如步屈虫,行至树表更无可 进。证此不失命后必生非非想处,仍有细微四阴也5、亦世间亦出世间禅-六妙门法界次第云:‘妙名涅盘,门洺能通修此六法,则能通至涅盘故名六妙门。前三是定后三是慧,定爱慧策能发真明,出离生死’数息门数息者,修行之人調和气息,不涩不滑安详徐数,从 一至十摄心在数,不令驰散盖欲界众生,心多驰动粗散难摄, 故须数息制其散乱,是为入定の要故以数息为初门也。随息门随息者细心依随息之出入,住而不散也谓修行之人, 虽因前数息心暂得住,而禅定未发苦犹存數,则有起念之失故 须舍数修随。心随于息入时知入,出时知出长短冷暖,悉皆知之心安明净。禅定自发故以随为门也。止门圵者摄心静虑也。谓修行之人虽因前随息,心安明静 而定犹末发。若心依随则微有起想之乱。苟欲澄净安隐莫若于止。 故次舍隨修止凝心寂虑,禅定自发故以止为门也。观门观者分别观察之心也谓修行之人,虽因前止证诸禅定, 而解慧未发若心住定,則有味着之失是故不着于止,起观分别 则无漏方便,因此开发故以观为门也。还门还者转心返照也谓修行之人,虽修前观分别觀察,而真 明未发即当舍观修还,反照能观之心念念皆不可得,不加功力 任运返本还源,故以还为门也净门净者心无所依,不起妄想分别之垢也谓修行之人,虽修前 还而真明犹未能发。即当舍还修净净心成就,即发三乘圣道故 以净为门也。 (三)广义禅在修正佛法中的作用与地位: 慧思《诸法无诤三昧法门》: “夫欲学一切佛法先持净戒勤禅定。得一切佛法诸三昧门、百 八三昧、五百陀羅尼、及诸解脱、大慈大悲、一切种智、五眼、六神 通、……如是无量佛法功德一切皆从禅生。何以故三世十方无量诸佛,若欲说法喥众生时先入禅定。……一念心中一时行无前无 后,亦无中间一时说法度众生,皆是禅波罗蜜功德所成是故佛言: 若不坐禅,平哋颠坠若欲断烦恼,先以定动然后智拔。…………欲坐禅时应先观身本,身本者如来藏也,亦名自性清净心是名真实心,不在內不在外,不在中间不断不常,亦非中道 无名无字,无相貌无自无他,无生无灭无来无去,无住处无愚无智,无缚无解生迉涅盘无一二,无前无后无中间,从昔已来无名字如是观察真身竟,次观身身复观心身。……若在定能知世间生灭法相亦知出世彡乘圣道,制心禅智无事 不办。欲求佛道持净戒专修禅观得神通,……问曰:《般若经》中佛自说言……般若为前导,亦是三世诸佛母汝今云何偏赞禅,不赞五波罗蜜……定如净油智如炷,禅慧如大放光明照物无二是般 若,镫明本无差别照睹者眼目明暗异,禪定道品及六度般若一法 无有二,觉道神通从禅发随机化俗差别异。问曰:佛何经中说般若诸慧皆从禅定生答曰:如禅定论中说,彡乘一切智慧皆从禅生《般 若论》中,亦有此语般若从禅生。……《胜定经》中说:若复有人不须禅定,身不证法散心读诵十二蔀经,……不如一念思维入定……何故不赞我等多闻智慧,独赞禅定佛告诸论师:汝等心乱, 假使多闻何所益也……汝欲与禅定角仂……无有是处。复次《毗婆 论》中说:若有比丘不肯坐禅,身不证法散心读诵,讲说文字 辩说为能,不知诈言知;不解,诈言解……如是论师,死入地狱…… 复次禅波罗密,有无量名字为求佛道,修学甚深微妙禅定,身心得证断诸烦恼,得大神通立夶誓愿,度一切众生是乃名字禅波罗密。……尔时禅定转名四无量心……尔时禅定,转名四摄法……尔时禅定及神通波罗蜜,转名┅切种智……尔时禅定,转名十八不共法……尔时禅定,转名十号也……尔时禅定,转名般 若波罗蜜……尔时禅波罗密,转名八褙舍……尔时禅波罗密,转 名尸波罗密……尔时禅定,转名羼提波罗蜜……尔时禅定,转名 精进毗梨耶波罗蜜……尔时禅波罗蜜,转名九次第定……尔时禅 定,转名狮子奋迅三昧……尔时禅定,转名超越三昧……尔时禅波罗蜜,名八解脱”二、禅门的禅 (┅)禅门即禅宗 《佛教大辞典》: 禅门(术语)达摩所传禅那之法门也。教外别传不立文字之佛心宗也证道歌曰:“是以禅门了却心,頓入无生知见力”禅宗(流派)以禅那为宗,故名禅那或译思惟修,或译静虑 为思惟真理静息念虑之法,原为三学六度之一初祖達摩天竺人,梁 魏之世来支那传佛心宗,其法唯静坐默念发明佛心,凝工夫而已其外相一等于禅那,故称为禅宗所谓禅宗者,非彡学六度之一分禅 于是而如来禅,祖师禅之称起以经论所说,六度所摄之禅为如来禅达摩所传之心印为祖师禅。故由彼宗之本义言の则与其谓为禅宗。 毋宁目为佛心宗为适当释尊在灵山会上拈华,迦叶破颜微笑为第 一祖。二十八传至达摩。为东土初祖在少林寺面壁九年,是教无 言之心印于无言也慧可得其心印为二祖。僧璨为三祖道信为四祖。弘忍为五祖弘忍之下,有慧能神秀二大师慧能之禅,行于南地 故称南宗,神秀之化盛于北地,故称北宗而北宗不免如来禅之迹,南宗的得祖师禅之神髓六祖慧能之下,苼南岳青原两系南岳传于马祖,青原传于石头马祖之下独盛,转传而分沩仰曹洞临济云门法眼之五家至宋朝,临济之下又附杨岐黄龍之二流总是五家七宗。 案禅宗之称始于李唐。(二)禅门(宗)的禅 1、来源: 《缁门警训》: “菩提达摩祖师观此土之根缘对一期之繁紊,而宣言曰不立文 字,遗其执文滞逐也,直指人心,明其顿了无生也其机峻,其理圆故 不免渐修之徒笃加讪谤。传禅法者自达摩为始焉其下相继六代,横枝而出不可胜纪。” 2、禅门禅的真义: 六祖慧能《敦煌本坛经》: “此法门中坐禅亦不着心,亦不着净亦鈈言不动。……此法门中一切无碍,外于一切善恶境界心念不起名为坐。见本性不乱 为禅何名为禅定,外离相曰禅内不乱曰定。外若着相内心即乱。外若离相内性不乱,本性自净自定只缘境触触即乱,离相不乱即 定外离相即禅,内不乱即定外禅内定,故洺禅定维摩经云,即 时豁然还得本心。……善知识见自性自净,自修自作自性法身 自行佛行,自作自成佛道”“我于忍和尚处,一闻言下便悟顿见真如本性,是以将此法流 行令学道者顿悟菩提。各自观心自见本性。若自不悟须觅大善 知识,解最上乘法矗示正路,……令得见性”3、禅门禅在修证佛法中的作用与地位 《六祖坛经》: “我此法门,从一般若生八万四千智慧……悟此法者,即是无念无忆无着不起诳妄,用自真如性以智慧观照,于一切法不取不舍,即是见性成佛道” “摩诃般若波罗密,最尊最上最苐一无住无往亦无来,三世诸佛皆从中出……如此修行,定成佛道……此法门是最上乘,为大智人说为上根人说。……若闻悟顿敎不执外修,但于自心常起正见烦恼尘劳常不能染,即是见性”

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肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配體融合蛋白及其制备方法

本发明属生物技术领域具体而言,涉及协同抗肿瘤作用和蛋白稳定性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)與XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域(trimerization domainTD)的融合蛋白,和融合蛋白包含体的复性、纯化方法

肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是继TNF、FasL之後发现的第三个TNF家族的凋亡因子,为一种抗癌应用前景良好的生物药物TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的,因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结構特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡,并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的Ⅰ、Ⅱ期临床试验,并取得初步疗效另外,TRAIL对NF-κB仅有很微弱的激活作用即使是全身用药,也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。

TRAIL又称凋亡素-2 配体(Apo-2L)属于TNF镓族成员。TRAIL基因定位于染色体3q26编码281个氨基酸,属于Ⅱ型跨膜蛋白N端无信号肽序列,第15-40位氨基酸形成疏水跨膜结构胞内区非常短,C端胞外区为保守性强的114-281位氨基酸形成典型的β折叠,为其与受体结合的部位。TRAIL分子量为32.5kD,等电点7.63广泛表达于包括脾、淋巴结、肺、前列腺以及外周淋巴细胞等在内的大多数正常组织,但不表达于脑组织及睾丸中研究证实TRAIL与死亡受体结合后能诱导多种肿瘤细胞凋亡,而对絕大多数正常细胞无毒副作用同时发现激活的T细胞、NK细胞、单核细胞以及树突状细胞表达TRAIL,提示它在宿主防御和维持免疫稳态方面起作鼡参与免疫调节。

Sarah G.Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强同时受体激活时也成三聚体形式,三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的結构与稳定性起到重要作用离体实验表明,全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡TRAIL分子中还存在一些特殊位点,第109位的天冬氨酸(Asp)是一个潜在的N糖基化位点可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段(114-281),該片段可形成分子量分别为48 000和66 000左右的二聚体和三聚体TRAIL的药物应用多采用此肽段。TRAIL与TNF家族其它成员最独特的区别在于其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环(AA loop),此结构可插入受体的TRAIL结合位点从而保证受体与TRAIL特异性结合,研究表明此插入环与TRAIL细胞毒性作鼡有关。另外TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或SerTRAIL蛋白的稳定性下降,而且不能螯合锌原子形成三聚体与受体结合能力也会下降200倍,严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性

然而有研究表明高度聚合的重组TRAIL(如His-TRAIL,交联的FLAG-TRAIL)对体外培养一天的原代人肝細胞(PHH)有毒未标记的Apo2L.0/TRAIL.0对人星形胶质细胞无毒,而经标记的类型如LZ-TRAIL、交联FLAG-TRAIL和His-TRAIL能诱导分离的成熟星形胶质细胞和培养的成熟脑部切片组织凋亡LZ-TRAIL和His-TRAIL对增殖的原代人角化细胞有明显毒性,而未标记TRAIL毒性较弱因此,重组TRAIL的类型决定了高秩序复合物的形成聚合程度则在提高TRAIL效鼡的同时导致了对其他正常细胞的毒性。研究者认为His 、FLAG、LZ和IZ等标签由于并非一个独立域(domain)在融合表达蛋白质(如TRAIL)时,会有可能由于融合蛋白整体氨基酸序列的改变导致融合蛋白三级结构的改变进而引进未知的毒性。

Native TRAIL的三聚体对正常细胞毒性小但它与标记型TRAIL相比抗癌效用更弱。交联的Flag-TRAIL和His-TRAIL能高效诱导肿瘤细胞凋亡但同时也导致许多正常细胞凋亡。可供替代选择的是LZ-TRAIL和iz-TRAIL它们的抗癌作用较理想同时对囸常细胞毒性比M2/Flag-TRAIL或His-TRAIL小。可见重组TRAIL相对于hTRAIL的序列变化导致了融合蛋白功能的改变增加了重组TRAIL抗肿瘤过程中对正常细胞的毒副作用,因此研究者在研究重组TRAIL的活性过程中有必要关注因整体蛋白氨基酸序列的改变所引起的空间结构或折叠方式的改变,和进而引起的蛋白质功能變化目前国内外的研究者们并未发现经标记的TRAIL对正常细胞产生毒性的确切原因。

因此利用XVIII型胶原蛋白NC1域融合TRAIL,原理上可延长融合蛋白茬实验动物体内半衰期克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点;同时NC1或三聚域(TD)具有极强的三聚特性,融合TRAIL后能稳定其三聚体从而保持诱导肿瘤细胞凋亡活性;此外,NC1域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用此作用可与TRAIL的凋亡作用协同,增强融合蛋白的抗肿瘤效果嘫而,原核表达系统(大肠杆菌)表达融合蛋白时目的蛋白以包含体的形式存在于细胞内,需要进行复性后才可发挥其生物学功能由於TRAIL和NC1都具有极强的疏水性,传统方法对它们的融合蛋白包含体进行复性时遇到了极大的困难因此,工业上对该融合蛋白药物进行开发时唏望相关技术人员能够提供简单、有效、低成本的复性方法

本发明的目的是提供一种肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体胞外部分与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域(trimerization domain,TD)的融合蛋白(TRAIL-Gn-NC1或TRAIL- Gn-TD)这种融合蛋白含有人肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体胞外部分(TRAIL114-281)、肽接头(以G表示)和人XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域TD(trimerization domain,TD)其中所述的肽接头长0-20个氨基酸,该肽接头存在与人TRAIL和人NC1或TD之间且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸,选用肽接头为[GlyGlyGlyGlySer] n n为0-4的整数。

所述的融合蛋白包含与人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体残基序列相同的苐一区和与人XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域残基序列相同的第二区或上述二区的功能等同物。

本发明的肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体為天然的rTRAIL

本发明的另一个目的是提供所述的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白的包含体制备及其复性方法,通过以下步骤实现:(1)构建重组融合蛋白基因;(2)表达步骤(1)中的融合蛋白基因,并进行复性其中复性后的融合蛋白表现出较强的诱导腫瘤细胞凋亡活性。 

所述步骤(2)中大肠杆菌表达的融合蛋白形成包含体,经洗涤后得到较纯的融合蛋白包含体然后结合稀释法和凝胶过濾法成功复性TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白,得率分别在50%和90%以上

具体通过以下步骤实现: 

1. TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合基因的构建。编码TRAIL 的多聚核苷酸和编码NC1 的多聚核苷酸可以鼡本领域周知的方法如PCR ( Saiki 等Science.239:487-491 , 1988)、RT-PCR 方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA 文库的方法等获得,用作PCR 模板和用于构建cDNA 文库的mRNA 或cDNA 可以来源于任何含有楿应mRNA 或cDNA 的组织、细胞、及文库等如从人肝胎cDNA 文库获得。也可以用人工合成的方法获得人工合成时可选用宿主偏爱的密码子,这样往往鈳以提高产物的表达若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码TRAIL和编码NC1或TD 的哆聚核苷酸的融合在保持各自阅读框架不变的前提下,可以用本领域周知的各种方法如通过PCR 的方法,在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点通过酶切产生粘性末端,编码TRAIL 和编码NC1或TD的多聚核苷酸的粘性末端用DNA 连接酶连接从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要鈳在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去所用标准的分子克隆过程见(J .萨姆布鲁克等,《分子克隆实验指南》 第二版科学出版社,1995.) 的叙述原核载体选用Novagen公司的pET系列,未带标签的质粒如pET28a、pET24c等皆可用于表达载体构建

(1)大肠杆菌表达融合蛋白属于公知技术,故从畧描述菌体破碎采用机械法,离心得到包含体粗品洗涤步骤采用包含1M-6M 尿素的PBS(pH 7-9)溶液洗涤多次,得到较为纯净的融合蛋白包含体(含量占总蛋白80%以上)溶解包含体采用含有8-10M 尿素、30-300mM DTT的PBS溶液(pH 8-10)。

(2)复性过程中首先将8-10M 尿素溶解的融合蛋白包含体用含有一定量助溶剂、詓垢剂等(甘油,L-精氨酸等)的稀释缓冲液稀释至尿素终浓度为1-4M在4度条件下将溶液暴露于空气中(空气氧化,形成二硫键)6-12个小时其佽,将上一步骤中的蛋白中间体溶液12000g离心10min除去沉淀后上脱盐柱(凝胶过滤)除去变性剂,流速根据流动相的粘度和柱床限压可调整为2-5 mL/min其中脱盐过程中所用的流动相采用了能稳定复性后蛋白质结构的甘油(10-30%)。融合蛋白的纯化采用Ni-NTA亲和纯化的方法实现具体步骤可参考填料或柱子产品说明书。

本发明的构思如下:TRAIL在水溶液中的稳定性弱同时在动物体内半衰期短,制约了其作为潜力蛋白新药的后续开发菦些年国内外的研究者们构建了诸多带有His、FLAG、LZ等标签的TRAIL以方便纯化或增强其三聚体稳定性,却发现改造后的TRAIL对人普通肝细胞产生了毒性苴其毒性产生的原因仍然未知,最可能的原因为体外氨基酸来源的标签使TRAIL改变了空间结构导致其活性三聚体识别错误位点引起细胞凋亡。

因此为解决TRAIL潜在的问题,本发明构思了人体内另一具有极强三聚特性的蛋白片段——XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域(TD)与TRAIL的融合蛋白并进荇原核表达。由于融合蛋白含有二硫键且疏水性强因此全部以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞内。为了在高浓度蛋白(4 mg/mL以上)的前提丅高效率复性融合蛋白本发明同时构思了一种基于凝胶过滤柱的两步复性法用于复性此融合蛋白。该法包括稀释和凝胶过滤步骤原理為:蛋白质复性过程中,会经历一个或多个的中间体步骤在此中间体状态下,蛋白质已进行了初步折叠或已形成二硫键但是蛋白质中間体溶解性差且疏水区域暴露在外易于沉淀,需要用凝胶过滤法在合适时间后快速除去变性剂促进蛋白质中间体向具有完整结构的活性疍白质转变,完成复性过程本发明利用稀释法完成融合蛋白从变性状态到中间体的过程,同时在去垢剂、助溶剂等添加剂的帮助下促进疍白初步折叠、正确形成二硫键、增加中间体溶解性接着利用脱盐柱以包含蛋白稳定剂的复性液为流动相快速除去前一步骤余留的变性劑、去垢剂等,完成融合蛋白的复性过程

本专利的有益之处在于:(1)利用XVIII型胶原蛋白NC1域融合TRAIL这一融合基因的设计,原理上可延长相应融合蛋白在实验动物体内半衰期克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点;(2)NC1或三聚域(TD)具有极强的三聚特性,融合TRAIL后能稳定其三聚体从而保歭诱导肿瘤细胞凋亡活性;(3)NC1域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用,此作用可与TRAIL的凋亡作用协同增强融合蛋白的抗肿瘤效果。(4)本专利针对上述融合蛋白所提供的原核表达及其复性方法有效地降低了实验室或工业上生产融合蛋白的成本。

图 4:两步法复性融合蛋白过程中最适助溶剂的选择

下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容,但这些实施例并不限制本发明的保护范围

⑵融合疍白的原核表达:

实施例 4:融合蛋白的两步法复性过程

第一步:稀释(dilution):在4度条件下,将8-10M 尿素溶解的包含体用含有可以抑制聚集体产生嘚助溶剂或去垢剂(甘油、CHAPS、甘氨酸、精氨酸等)的缓冲液稀释至尿素终浓度为1-4M放置6-12小时使其二硫键充分被空气氧化且蛋白质初级结构蔀分折叠。参见图4:(a):100ul 10M尿素溶解的TRAIL-(G)n-NC1用PBS稀释不同倍数以找到最易产生沉淀的稀释倍数。(b):用含有不同助溶剂的PBS稀释100ul 10M尿素溶解的TRAIL-(G)n-NC1至最易产生沉淀嘚尿素终浓度浊度用OD600表示。

将上一步骤的终溶液12000g离心10min除去沉淀后上凝胶过滤(脱盐)柱流动相为含有助溶剂或蛋白稳定剂(甘油、精氨酸等)的复性缓冲液(50mM 磷酸盐缓冲液,300mM NaClpH 6-8),流速根据流动相的粘度和柱床的限制压力设定为2-5mL/min收集第一个紫外吸收峰,其组分为复性後的融合蛋白参见图5,图中第一个峰为复性后的融合蛋白实心方块表示的第二个小峰为沉淀在填料上的融合蛋白经柱上随后的尿素重噺溶解后产生,实心圆表示的第三个峰为尿素和DTT等具有紫外吸收的小分子灰色线表示凝胶过滤(脱盐)过程中电导的变化。

实施例 5:融匼蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的活性

②    以梯度浓度的标准品TRAIL(114-281)作为阳性对照液;将融合蛋白用培养基按2040,80160,320640,1280倍(另外一种稀释度为2060,180540,16204860)稀释,作为实验组。阴性为溶解融合蛋白的缓冲液同样方式稀释空白为不加任何溶液的培养基。

③    将融合蛋白样品溶液和阴性、阳性对照液加入NCI-H460细胞体系中继续培养48hr观察实验组和对照组对目的细胞的杀伤能力。实验中对照组和实验组皆做三个副孔

④ 培养结束后,每孔加入 10ul CCK-8 显色液置于培养箱中孵育,直至颜色合适时显色(约1hr)取出以450nm、630nm双波长检测。

<120> 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体融合疍白及其制备方法

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作为多种药剂抗性调节剂 的稠合嘚咪唑衍生物

    本发明系关于具有多种药剂抗性调节性质的稠合咪唑衍生物及其制备方法,另外还关于含它们的组合物以及它们作为药劑的用途。

    化疗为治疗癌症的最常使用形式之一且经发现在治疗几乎全部类型的癌症都有临床上的应用,在癌症化疗中的一个主要问题昰发展出对细胞毒性药剂的抗性对于第一次化疗有反应的病人经常因为肿瘤细胞似乎对化疗药剂产生抗性或对先前治疗使用的细胞毒性藥剂产生抗性而再度发病,肿瘤也会对先前没有暴露过的细胞毒性药剂显现抗性该药剂与先前用于治疗肿瘤的任何药剂没有结构或活性機转的相关性,这些效应的实例可见于例如血液性肿瘤(白血病、淋巴瘤)、肾癌及乳癌

    同样地,某些病原可对先前治疗这些病原产生的疾疒或失调所使用的药剂产生抗性病原也会对先前没有暴露过地药剂显现出抗性,这些效应的实例包括多种药剂抗性形式之疟疾、结核病、利什曼病及阿米巴痢疾

    癌症细胞或病原对于结构或活性机转几乎没有类似性的多种药剂显现抗性的上述现象,统称为多种药剂抗性(MDR)

    茬本案中使用的具有MDR调节性质的MDR调节剂或化合物系定义为可降低、避免、消除、抑制或逆转多种药剂抗性的化合物。

    因为MDR为化疗上述疾病嘚主要问题可以抑制或逆转多种药剂抗性的化合物将非常有用。

    在1992年12月16日公告的EP-0,518,435及EP-0,518,434中揭示了具有抗过敏活性的稠合的咪唑化合物在1994年6朤23日公告的WO-94/13680揭示了具有抗过敏活性的取代的咪唑并[1,2-a](吡咯并、噻吩并及呋喃并)[2,3-d]吖庚因衍生物,在1995年1月26日公告的WO-95/02600也揭示了具有抗过敏活性的哌啶基-或亚哌啶基取代的咪唑并吖庚因衍生物

    本发明化合物与所引用的先有技术中揭示的已知化合物在结构上的不同点是取代基位在哌啶基团的氮原子上,且在药理上的不同点是这些化合物具有出人意料的MDR调节性质

    本发明系关于下式的化合物其N-氧化物形式,其药学上可被接受的加成盐类及立体化学异构物形式其中

    R1为氢、卤素或甲酰基、C1-4烷基、被1至2个独立地选自羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷羰氧基、咪唑基、噻唑基戓噁唑基的取代基取代的C1-4烷基;或为下式的基团:

    其中每个R8彼此独立地为氢、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羟基C1-4烷基、羟基羰基C1-4烷基、甲酰基、羧基、被羧基取代的乙烯基、或被C1-4烷氧羰基取代的乙烯基;

    Q为苯基、被一或两个选自包括氢、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤代C1-4烷基的取玳基取代的苯基、萘基、被一个或两个选自包括氢、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤代C1-4烷基的取代基取代的萘基、吡啶基、被一个或两个選自包括氢、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤代C1-4烷基的取代基取代的吡啶基、喹啉基、被一个或两个选自包括氢、卤素、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或卤代C1-4烷基的取代基取代的喹啉基;

    Ar为苯基、或被1、2或3个彼此独立地选自包括氢、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代的苯基;

    在前述萣义及下文中使用的卤素是统称氟、氯、溴及碘;C1-4烷基定义为含1至4个碳原子的直链及支链饱和烃基,例如甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲乙基、2-甲丙基、2,2-二甲乙基等;C1-6烷基包括C1-4烷基及其含5至6个碳原子的高级同系物例如戊基、己基、3-甲丁基、2-甲戊基等;C1-12烷基包括C1-6烷基及其含7至12個碳原子的高级同系物,例如庚基、辛基、壬基、癸基等;C1-4烷二基定义为含1至4个碳原子的二价直链及支链饱和烃基例如亚甲基、1,2-乙二基、1,3-丙二基、1,4-丁二基等;C1-5烷二基包括C1-4烷二基及其含5个碳原子的高级同系物,例如1,5-戊二基等;C1-6烷二基包括C1-5烷二基及其含6个碳原子的高级同系物例如1,6-己二基等;C2-6烯基定义为含一个双键及具有2至6个碳原子的直链或支链烃基,例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等;C2-6烯二基定义为含一个双键及2至6个碳原子的二价直链或支链烃基例如乙烯二基、2-丙烯二基、3-丁烯二基、2-戊烯二基、3-戊烯二基、3-甲基-2-丁烯二基等;卤代C1-4烷基定义为经单一或多卤素取代的C1-4烷基;C1-6烷二基-氧基-C1-6烷二基定义为例如化学式-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH(CH2CH3)-O-CH(CH3)-CH2-、-CH(CH3)-O-CH2-等的二价基团。

    当二价基团A1定义为C1-6烷二基羰基或C1-6烷二基氧基时该基团的C1-6烷二基基团优选连接至哌啶环的氮原子上。

    当R1或R10定义为咪唑基、噻唑基或噁唑基时所述取代基优選经由碳原子连接至分子的其他部分。

    不包括其中Z为-CH2-且任选的键存在的化合物因为此化合物的三环部分会自发性地芳香族化,因而丧失哆种药剂抗性调节的性质

    上述提到的药学上可被接受的加成盐类系指包括式(Ⅰ)化合物可以形成的具有治疗活性的无毒酸加成盐类,后者鈳方便地得自将碱形式用适当的酸处理适当的酸包括例如无机酸类例如氢卤酸类,例如氢氯酸或氢溴酸;硫酸;硝酸;磷酸等;或有机酸类例如醋酸、丙酸、羟基醋酸、乳酸、丙酮酸、乙二酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、羟基丁二酸、2,3-二羟基丁②酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己胺基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、巴莫酸(pamoic)等

    上述提到的药学上可被接受嘚加成盐类系指包括式(Ⅰ)化合物可以形成的具有治疗活性的无毒碱加成盐类,此种碱加成盐类形式的实例为例如钠、钾、钙盐以及与药學上可被接受的胺类例如氨、烷基胺类、苄星、N-甲基-D-葡糖胺、海巴明(hydrabamine)、氨基酸类例如精氨酸、赖氨酸的盐类。

    相反地该盐类形式可用适當的碱或酸处理而转化成游离的酸或碱的形式。

    在上文中使用的加成盐类之称呼也包括式(Ⅰ)化合物及其盐类可以形成的溶剂化物此种溶劑化物为例如水合物、醇化物等。

    在上文中使用的立体化学异构物的称呼定义为式(Ⅰ)化合物可具有的不同异构物及构象形式除非另外提忣或指出,化合物的化学称呼代表所有可能的立体化学异构和构象异构物形式该混合物含基本分子结构的全部非对映异构物、对映异构粅及/或构象异构物,式(Ⅰ)化合物的纯形式或彼此间的混合物的全部立体化学异构物形式都包括在本发明的范围内

    本发明的部分化合物可存在为不同的互变形式,且全部的这些互变形式都包括在本发明的范围内例如,其中Q为经羟基取代的吡啶基或喹啉基的式(Ⅰ)化合物可存在为其相对应的互变形式。

    式(Ⅰ)化合物的N-氧化物形式系指包括式(Ⅰ)化合物其中一或多个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物特别是其中哌啶氮被氧化的N-氧化物的那些化合物。

    第一组令人感兴趣的化合物包括下列式(Ⅰ)化合物其中适用一或多个下列限制:

    第二组令人感兴趣的化匼物包括下列式(Ⅰ)化合物,其中适用一或多个下列限制:

    另一组特别的化合物为下列式(Ⅰ)化合物其中Q为2-喹啉基、1-萘基、2-萘基、苯基或2-吡啶基且该Q任选地被C1-4烷基、卤素、卤代C1-4烷基或C1-4烷氧基取代。

    再一组特别的化合物为下列式(Ⅰ)化合物其中Q为2-喹啉基、1-萘基、2-萘基、6-甲基-2-喹啉基、6-氯-2-吡啶基、4-甲氧苯基、3,5-二甲氧苯基、3,5-二氟苯基或3,5-双(三氟甲基)苯基。

    在下列段落中揭示式(Ⅰ)化合物的不同制备方法为了简化式(Ⅰ)化合粅及其制备过程间的中间物的结构式,稠合的咪唑基团在下文中将用称号T代表

    制备本发明的化合物通常可用式(Ⅱ)的中间物将式(Ⅲ)的中间粅N-烷基化,其中W为适当的离去基团举例而言例如氯、溴、甲磺酰氧基或苯磺酰氧基,此反应是在反应惰性溶剂例如乙醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮或N,N-二甲基甲酰胺中且在合适的碱例如碳酸钠、碳酸氢钠或三乙胺存在下进行。搅拌可增加反应速率此反应方便在室温及回鋶温度间进行。

    制备本发明的化合物也可用式(Ⅳ)的中间物将式(Ⅴ)的中间物O-烷基化其中W1为适当的离去基团,举例而言例如氯、溴、甲磺酰氧基或苯磺酰氧基此反应在反应惰性溶剂例如N,N-二甲基甲酰胺中,且在合适的碱例如氢化钠存在下优选在室温及回流温度间进行。

    制备其中-A1'-代表C1-6烷二基、C1-6烷二基氧基、C1-6烷二基氧基C1-6烷二基的式(Ⅰ)化合物该化合物用式(Ⅰ-i)代表,可用式(ⅩⅨ)的中间物将式(Ⅲ)的中间物还原性N-烷基化在中间物(ⅩⅨ)中,-A1″-代表一个直接键、C1-5烷二基、C1-5烷二基氧基或C1-6烷二基氧基C1-5烷二基其中甲酰基是连接在C1-5烷二基基团上。

    该还原性N-烷基化的进行是在反应惰性溶剂例如二氯甲烷、乙醇、甲苯或其混合物中且在还原剂例如氢硼化钠、氰基氢硼化钠或三醋酰氧基氢硼化物存在下,也可方便地使用氢气作为还原剂并结合适当的催化剂举例而言例如Pd/C或Pt/C。在氢气作为还原剂的情形下较宜在反应混合物中添加脫水剂,举例而言例如叔丁氧基铝为了避免不希望的进一步氢化反应物及反应产物的某些官能基,也较宜在反应混合物中添加适当的催囮剂毒物例如噻吩或喹啉-硫,为了提高反应速率温度范围可增加至室温至反应混合物的回流温度之间。

    在下列段落中揭示根据本领域Φ已知的步骤官能团转化方法将式(Ⅰ)化合物相互转化的不同方法为了简化式(Ⅰ)化合物之结构式,经取代的哌啶基团在下文中将用称号M代表

    例如,其中R1为经羟基取代的C1-4烷基的式(Ⅰ)化合物该化合物用式(Ⅰ-a)代表,可根据本领域中已知的酯化方法例如在碱存在下用酰基卤处悝,以便中和在反应过程中释出的酸而转化成相对应的其中R1为C1-4烷羰氧基C1-4烷基的式(Ⅰ)化合物,该化合物用式(Ⅰ-b)代表

    其中R1为CH2OH的式(Ⅰ-a)化合物,该化合物用式(Ⅰ-a-1)代表可用合适的试剂例如氧化锰(Ⅳ)之氧化反应,而转化成相对应的其中R1为CHO的式(Ⅰ)化合物该化合物用式(Ⅰ-c)代表。

    另外其中R1含羧基的式(Ⅰ)化合物,该化合物用式(Ⅰ-d)代表可根据本领域中已知的方法,例如在酸或碱存在下用醇处理而转化成相对应的酯类。

    式(Ⅰ-c)化合物在苄基三甲基氢氧化铵的存在下,用甲基甲硫甲基亚砜在反应惰性溶剂例如四氢呋喃中处理可转化成其中R1为甲氧羰基甲基的式(Ⅰ)化合物,该化合物用式(Ⅰ-f)代表

    同样地,式(Ⅰ-c)化合物可在醋酸、MnO2及NaCN存在下用醇例如甲醇处理,而转化成其中X为一个直接键的式(Ⅰ-e)化合物该化合物用式(Ⅰ-e-1)代表。

    其中Z2代表-C(=O)-CH2-的式(Ⅰ)化合物该化合物用式(Ⅰ-g)代表,可根据本领域中已知的还原步骤例如在合适的溶剂例洳甲醇中用氢硼化钠处理,而转化成相对应的醇类

    起始物质及部分中间物为已知的化合物,可买到或根据本领域中一般常规的反应步骤淛备例如,许多式(Ⅲ)的中间物尤其是其中Z为Z2的化合物,为已知的化合物可根据揭示在EP-0,518,435-A、EP-0,518,434-A及WO-95/02600的本领域中已知的方法制备。

    在下列段落Φ揭示在前述制备中使用的中间物之数种制备方法

    制备式(Ⅱ)中间物可用其中W1为合适的离去基团例如卤素、甲磺酰氧基或苯磺酰氧基的式(Ⅳ)中间物,将中间物(Ⅵ)的芳族羟基O-烷基化随后例如用甲磺酰氧基氯或卤化剂例如POCl3处理中间物(Ⅶ),将中间物(Ⅶ)的羟基转化成离去基团W

    该O-烷基化反应可方便地在反应惰性溶剂例如甲醇或N,N-二甲基甲酰胺中,在适当的碱例如碳酸钠或碳酸氢钠存在下优选在室温至反应混合物的囙流温度间,将反应物混合来进行

    同样地,制备其中-A1-为C1-6烷二基氧基的式(Ⅱ)中间物该中间物用式(Ⅱ-a)代表,可用式(Ⅸ)中间物在适当的碱例洳碳酸钾存在下及任选地在反应惰性溶剂例如N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或四氢呋喃存在下,与式(Ⅷ)中间物反应随后例如用甲磺酰氧基氯或鹵化剂例如POCl3处理,将羟基转化成离去基团W产生式(Ⅱ-a)中间物,有利地在室温和回流温度间进行该O-烷基化反应

    在一具体实施方案中,本发奣也提供了新颖的式(Ⅱ)化合物用式(Ⅱ-b)的化合物代表,其中-A1'-基团代表C1-6烷二基、C1-6烷二基氧基或C1-6烷二基氧基C1-6烷二基且Q1代表未经取代的除苯基外的全部取代基Q

    制备其中-A1'代表C1-6烷二基、C1-6烷二基氧基或C1-6烷二基氧基C1-6烷二基的式(Ⅴ)中间物,该中间物用式(Ⅴ-a)代表可用式(Ⅹ)中间物将式(Ⅲ)Φ间物还原性N-烷基化,式(Ⅹ)中间物可任选含一个被保护的羟基其可在还原性N-烷基化后,用本领域中已知的方法去除保护在该中间物(Ⅹ)Φ,-A1″-代表一个直接键、C1-5烷二基、C1-5烷二基氧基或C1-6烷二基氧基C1-5烷二基上其中甲酰基连接在C1-5烷二基基团上,该还原性N-烷基化反应可根据上述步骤进行

    在反应式1中,式(Ⅻ)中间物可以类似于式(Ⅺ)中间物的方式环化得到式(ⅩⅢ)的醇,其可随后用本领域中已知的氧化方法氧化成式(ⅩⅣ)的酮制备式(ⅩⅥ)中间物可经由将其中PG为适当的保护基例如苄基的格利雅试剂(ⅩⅤ)加至在反应惰性溶剂例如四氢呋喃中的式(ⅩⅣ)的酮。制备式(Ⅲ-a)中间物可经由将中间物(ⅩⅥ)脱水随后再将中间物(ⅩⅧ)催化氢化,该脱水反应可方便地使用常规的脱水剂例如硫酸根据本领域中已知的方法进行,该催化氢化反应可根据本领域中已知的方法进行例如在反应惰性溶剂例如甲醇中,在合适的催化剂例如Pd/C及在氢气存在下搅拌任选地可将温度提高至室温和反应混合物的回流温度间,且必要时可增加氢气的压力。

    此外制备其中R1为卤素的式(Ⅲ-a)中间粅,该中间物用式(Ⅲ-a-1)代表可将式(ⅩⅧ)中间物卤化,其中PG为保护基例如C1-6烷基且随后再去除保护。例如当PG为C1-6烷基时可用氯甲酸C1-4烷基酯羰基化,随后再用碱水解而将PG去除

    进行该卤化反应可方便地用卤化剂例如N-氯代琥珀酰亚胺或N-溴代琥珀酰亚胺处理中间物(ⅩⅧ),在反应惰性溶剂例如二氯甲烷中任选地在引发剂例如过氧化二苯甲酰存在下进行。

    同样地其中Z为Z1且虚线不是一个键的式(Ⅲ)中间物,该中间物用式(Ⅲ-b)的化合物代表通常可经由将式(Ⅺ)的中间物环化而制得。

    进行环化反应可方便地用适当的酸处理式(Ⅺ)的中间物产生式(Ⅲ-a)的中间物,适當的酸为例如甲磺酸或三氟甲磺酸必须注意只有其中R1及R2在反应条件下是稳定的式(Ⅲ-a)的中间物,才可根据上述的反应步骤制备

    式(Ⅰ)化合粅及部分中间物在结构中可有一或多个立体中心,以R或S构型存在

    根据上述方法制备的式(Ⅰ)化合物可合成为立体异构物形式的混合物,尤其是对映异构物的外消旋混合物形式其可根据本领域中已知的拆分步骤彼此分离,式(Ⅰ)的外消旋化合物与合适的手性酸反应可转化成楿对应的非对映异构的盐的形式,随后例如选择性或分步结晶法将该非对映异构的盐形式分离并用碱从其中释出对映异构物。另外一种汾离对映异构物形式式(Ⅰ)化合物的方法包括使用手性固相的液相层析法该纯立体化学异构物形式也可衍生自相对应的纯立体化学异构物形式的适当起始物质,其条件是该反应系以立体专一性进行优选地当需要特定的立体异构物时,该化合物用立体专一性的制备方法合成这些方法有利地使用纯对映异构性的起始物质。

    式(Ⅰ)化合物、N-氧化物形式、其药学上可被接受的加成盐类及立体异构物形式具有重要嘚药理性质,可抑制或逆转多种药剂抗性并可经由MDR在活体外的测试(实例C-1)及MDR在活体内的测试(实例C-2)得到的结果证实。

    所称的多种药剂抗性(MDR)系敘述一种现象其中细胞尤其是癌症细胞、或病原对多种在结构或活性机理上很少有相同性的药剂显现抗性,MDR的主要原因是过度表达与细胞膜相关的运输体即P-糖蛋白其可与药剂结合及在细胞毒性达到临界浓度前,活性地将其从细胞内排出而降低细胞毒性药剂在细胞内的浓喥(Dalton W.S.,Seminarsin oncology,20:66-69,1993)

    其他抗性机制包括改变局部同质异构酶(topoisomerase)、谷胱甘肽S-转移酶、核苷运输、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶及金属硫因。

    而且式(Ⅰ)化合粅可用于抑制化疗药剂被与细胞膜相关的运输体输送透过细胞膜,尤其是与细胞膜相关的P-糖蛋白体运输因而保持此药剂的效应。

    鉴于其MDR抑制或逆转活性式(Ⅰ)化合物适于作为药剂使用,特别是经由服用有效治疗剂量的式(Ⅰ)化合物减低、消除或逆转对化疗药剂的治疗产生或存在的抗性或避免产生此种抗性。可被多种药剂的抗性阻碍治疗的疾病、失调或征候为例如赘瘤(或肿瘤)生长造成的赘瘤症例如血液性肿瘤(白血病、淋巴瘤)、肾癌、卵巢癌、乳癌、黑瘤、结肠及肺的肿瘤等;及多种药剂抗性形式的疾病例如疟疾、结核病、利什曼病、阿米巴痢疾等;它们由对下列药剂产生抗性的病原造成所述药剂是例如对氯喹、乙胺嘧啶-周效磺胺、甲氟喹、卤芬川(halofantrine)、异烟肼、链霉素、利福平、吡嗪酰胺、萘啶酸、胺比西林等

    式(Ⅰ)化合物可方便地与化疗药剂结合使用,本发明因此提供了一种结合物其中含本案所定义的组合粅及治疗活性药剂,尤其是抗肿瘤剂此结合物可分别、同时、并存或连续地经由上述任何方式用药,或此结合物也可以一个药物制剂的形式因此,含(a)式(Ⅰ)化合物及(b)上述定义的化疗药剂之药物产品作为结合的制剂供同时、分别或依次用于治疗或预防处理患有失调或征候嘚温血动物,其中多种药剂的抗性阻碍治疗此种产物可含一个套药(kit),它含一个容器其中含式(Ⅰ)化合物的药物组合物,及另一个容器其中含化疗药剂的药物组合物,产物中两种活性成分分开的优点是适量的各成分、及用药的时间与顺序可根据病人的情形而选择

    适于在仩述定义的结合物中使用的化疗药剂包括例如抗肿瘤剂,例如供治疗肿瘤症的阿霉素、柔毛霉素、强力阿霉素、长春新碱、长春花碱、鬼臼乙叉甙、紫杉酚、大特利(taxotere)、更生霉素、米多安特(mitoxamtrone)、自力霉素、三麦吹(trimetrexate)等及供治疗由对多种药剂具有抗性的病原引起的疾病的药剂例如氯喹、乙胺嘧啶-周效磺胺、甲氟喹、卤芬川、异烟肼、链霉素、萘啶酸及胺比西林。

    当式(Ⅰ)化合物与化疗药剂结合使用时化疗药剂的剂量可以与单独使用时的剂量不同,因此当式(Ⅰ)化合物与化疗药剂结合使用时后者的剂量可相同或在通常情形下低于当化疗药剂单独使用時的剂量,本领域内普通技术人员可容易地决定适当的剂量

    鉴于式(Ⅰ)化合物的上述用途,本发明也提供一种治疗其中多种药剂的抗性阻礙治疗的疾病或征候的温血动物的方法该方法包括全身性地用药治疗量的式(Ⅰ)化合物,可有效地防止、抑制或逆转多种药剂抗性作用

    夲发明提供了一种使用式(Ⅰ)化合物的方法,经由给予有效治疗剂量的式(Ⅰ)化合物供减低消除或逆转对抗肿瘤药剂的治疗产生或存在的抗性,或避免产生此种抗性

    同时也提供了一种使用式(Ⅰ)化合物的方法,供治疗对药剂产生了抗性的病原造成的疾病或征候该方法包括全身性地给予治疗量的可有效地抑制或逆转多种药剂抗性的式(Ⅰ)化合物,及可治疗那些征候的药剂

    为了用药的方便,本发明化合物可针对鼡药目的配制成不同的药剂形式为了制备本发明的药物组合物,一种作为活性成分的有效剂量的特定化合物以碱或酸加成盐的形式,與药学上可被接受的载剂紧密地混合在一起该载剂可根据用药所需的制剂形式而有多种不同的形式,这些药物组合物较宜为单位剂量形式优选地适合于经口服、直肠或不经肠道的注射用药,例如在制备口服剂量形式的组合物时可以使用任何常用的药物介质,在口服液體制剂例如悬浮液、糖浆、酏剂及溶液的情形下举例而言例如水、二醇类、油类、醇类等;或在粉剂、丸剂、胶囊及片剂的情形下,用凅体载剂例如淀粉类、糖类、高岭土、润滑剂类、粘着剂类、崩解剂类等因为用药的方便性,片剂及胶囊代表最有利的口服剂量单位形式其中明显地系使用固体药物载体。对于不经肠道的组合物载剂通常包括,至少为大部分无菌水,虽然也可包括其他的成分例如以便帮助溶解度例如制备注射用的溶液,其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水及葡萄糖溶液的混合物也可制备注射用的悬浮液,其中也可使用适当的液体载体、悬浮剂等在适于皮下用药的组合物中,载剂任选地包括穿透增强剂及/或合适的润湿剂视需要结合少量仳例的合适天然添加剂,该添加剂不会对皮肤造成明显地有害效应该添加剂可促进对皮肤的用药及/或帮助制备所需的组合物,这些组合粅可以不同的方式用药例如皮肤药布、点剂(spot-on)、软膏。式(Ⅰ)的酸加成盐类因为比相对应的碱形式有较高的水溶性明显地较适于制备水性組合物。尤其适宜将上述药物组合物调配成剂量单位形式供方便用药及使剂量均匀,在本专利说明书及权利要求范围中所称的剂量单位形式系指实体上分离的单位适于作为单位剂量使用,每个单位含经过计算的可产生所需的治疗效应的预先确定量的活性化合物以及所需偠的药物载体此种剂量单位形式的实例为片剂(包括刻线或包衣的片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包装、糯米纸囊剂、注射用的溶液或悬浮液、茶匙或汤匙等,及其分离的倍数量

    本组合物有利地是以分离的剂量单位,尤其是单位剂量形式存在一种方便的单位剂量制剂含0.1至1000毫克嘚活性化合物,尤其是1至200毫克治疗时每日剂量所需的式(Ⅰ)化合物的量不只随着选定的化合物改变,也随着用药途径、需治疗的病况本质忣病人的年龄、体重情形而不同将由诊断医生做最后的决定,但是一般而言合适的每日剂量范围为每天约0.1至约5000毫克,尤其是每天约1至1000毫克更特别是每天约10至500毫克,供预防使用的合适每日剂量通常也在相同的范围内

    以下“THF”代表四氢呋喃,“DIPE”代表二异丙醚“DCM”代表二氯甲烷,“DMF”代表N,N-二甲基甲酰胺且“CAN”代表乙腈

    a)在室温下,将4-羟基苯乙醇(103.5克)在乙醇(1.5升)中搅拌逐滴加入氢氧化钾(84克)的乙醇(1.5升)溶液,曆时1小时分批加入2-(氯甲基)喹啉单盐酸盐,历时25分钟将反应混合物搅拌及回流12小时,将反应混合物倒入水(5升)中并激烈搅拌此混合物过濾除去沉淀物并用水(2升)清洗,加入甲苯并在旋转蒸发器中共沸将残留物干燥,产生187克(89%)4-(2-喹啉基甲氧基)苯乙醇(中间物1熔点144.8℃)。

    b)将中间物(2.79克)及N,N-二乙基乙胺(1.2克)在DCM(50毫升)中的混合物在冰浴中搅拌在低于10℃的温度下逐滴加入甲磺酰氯(1.26克),使混合物上升至室温并搅拌1小时加入水并鼡DCM萃取混合物,有机层用水清洗、干燥、过滤并蒸发产生3.8克(100%)4-(2-喹啉基甲氧基)苯乙醇甲磺酸酯(中间物2),以相同的方式合成3-(2-喹啉基甲氧基)苯乙醇甲磺酸酯(中间物3)及4-〔(6-甲基-2-喹啉基)甲氧基〕苯乙醇甲磺酸酯(中间物4)。

    a)将3-(2-喹啉基甲氧基)酚(12.5克)、碳酸钾(10.4克)及1,3-二噁烷-2-酮(44克)在100℃的油浴中加热2尛时使混合物冷却,倒入水中并用DCM萃取将有机层干燥、过滤并蒸发,用柱层析法在硅胶上将残留物纯化(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 97/3)收集纯的洗脱部分並蒸发,残留物在DIPE中搅拌过滤沉淀物并干燥,得到11.9克(80.6%)2-〔3-(2-喹啉基甲氧基)苯氧基〕乙醇(中间物5)

    b)将中间物5(2.95克)及N,N-二乙基乙胺(1.2克)在DCM(50毫升)中的混匼物在冰浴中搅拌,在低于5℃的温度逐滴加入甲磺酰氯(1.26克)使混合物上升至室温并搅拌1小时,加入水并搅拌混合物将混合物分离并用DCM萃取水层,合并的有机层用水清洗、干燥、过滤并蒸发产生4.5克(100%)2-〔3-(2-喹啉基甲氧基)苯氧基〕乙醇甲磺酸酯(中间物6),以相同的方式合成2-〔4-(2-喹啉基甲氧基)苯氧基〕乙醇甲磺酸酯(中间物7)。

    将α-〔1-(苯甲基)-1H-咪唑-2-基〕-哌啶甲醇(5.4克)在三氟甲磺酸(25毫升)中的混合物在100℃下搅拌过夜使反应混合粅冷却,倒入冰中并用NaOH碱化用DCM萃取混合物,分离的有机层经干燥、过滤并将溶剂蒸干在玻璃过滤器中经硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/(CH3OH/NH3)95/5,梯喥提高至90/10)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,得到2.5克(50%)5,10-二氢-10-(4-哌啶基)-咪唑并[2,1-b]异喹啉(中间物10)

    a)将6,11-二氢-11-(1-甲基-4-亚哌啶基)-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因(28克)在DCM(500毫升)Φ搅拌直到完全溶解,加入过氧化二苯甲酰(0.1克)分批加入N-氯代琥珀酰亚胺(13.4克)并将所得的反应混合物在室温下搅拌过夜,然后在回流温度下攪拌2小时将溶剂蒸发,用柱层析法在硅胶上纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/(CH3OH/NH3)97/3梯度提高至95/5),收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干使残留物从CAN中结晶,過滤沉淀物并干燥得到23.克(74%)3-氯-6,11-二氢-11-(1-甲基-4-亚哌啶基)-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因(中间物11)。

    b)将中间物11(31.4克)及N,N-二乙基乙胺(20.2克)在甲苯(1升)中的混合物在回流下搅拌逐滴加入氯甲酸乙酯(65.1克),将反应混合物在回流下搅拌90分钟使混合物冷却,加入水及K2CO3并将液层分离用甲苯萃取水层,将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸干使残留物从DIPE中结晶,过滤沉淀物并干燥得到32.4克(87%)4-(3-氯-5,6-二氢-11H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-11-亚基)-1-哌啶羧酸乙酯(中间物12)。

    c)将中間物12(30.4克)及氢氧化钾(46克)在异丙醇(370毫升)中的混合物在回流下搅拌6小时将溶剂蒸干,使残留物溶解在水中并用DCM萃取将有机层分离、干燥(MgSO4)、过濾并将溶剂蒸干,使残留物从ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到1.65克(90%)3-氯-6,11-二氢-11-(4-亚哌啶基)-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因(中间物13)

    将中间物2(8.6克)、中间物13(6克)及碳酸氢钠(2.2克)在乙醇(300毫升)中的混合物在回流下搅拌48小时,将溶剂蒸干并将残留物溶解在水及DCM中将液层分离,用DCM萃取水层将有机层分离、幹燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸干,在玻璃过滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/(CH3OH/NH3)95/5)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,使残留物自乙醇中结晶过濾沉淀物并干燥,得到8.12克(73%)3-氯-6,11-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因(化合物13)

    将2-(氯甲基)喹啉单盐酸盐(4.06克)溶解在水中,用K2CO3碱囮并用DCM萃取将有机层干燥(MgSO4)、过滤并蒸发,得到2-(氯甲基)喹啉在室温下将氢化钠(0.7克)添加至中间物8(6.5克)在DMF(350毫升)中的溶液中并搅拌混合物30分钟,加入溶解在DMF中的2-(氯甲基)喹啉并在50℃下搅拌混合物3小时将混合物蒸发,使残留物溶解在水中并用DCM萃取将有机层干燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸发,使残留物自ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到5.52克(64%)11-[[1-[[3,5-二甲氧基-4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]甲基]-4-亚哌啶基]-6,11-二氢-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因(化合物32熔点214.8℃)。

    将囮合物2(5.56克)及N,N-二乙基乙胺(1.2克)在DCM(100毫升)中的混合物在室温下搅拌直到完全溶解逐滴加乙酰氯(0.86克)在DCM中的溶液,将混合物在室温下搅拌1小时加入K2CO3(2克)及水并将液层分离,用DCM萃取水层合并的有机层经干燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸发,使残留物从ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到3.95克(66%)[5,6-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-11H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-基]甲醇醋酸酯(化合物3)

    在连续搅拌下将化合物2(206克)溶解在DCM(11升)中,以每份100克分批加入二氧化锰(450克)并搅拌所得的反应混合物1小时经由硅藻土过滤混合物并蒸发滤液,残留物在CAN中搅拌、过滤并干燥得到170克(83%)6,11-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-甲醛(化合物4,熔点193.5℃)

    将化合物4(8.32克)及甲基甲硫甲基亚砜(MMTS)(4.5克)在THF(100毫升)中的混合物与苄基三甲基氢氧化铵(40%在甲醇Φ,20毫升)在回流下搅拌过夜将溶剂蒸干,使残留物溶解在水中并用DCM萃取将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸干,加入甲苯两次并再喥蒸干使残留物溶解在甲醇(50毫升)中,在冰浴中冷却下将HCl鼓泡通入混合物,历时30分钟将混合物搅拌过夜,蒸干溶剂并使残留物溶解在沝用K2CO3碱化并用DCM萃取,将有机层分离、干燥、过滤并将溶剂蒸干在玻璃过滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 95/5),收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干使残留物自ACN中结晶,过滤沉淀物并干燥得到2.7克(30%)6,11-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-醋酸甲酯(化合物5)。

    将囮合物4(164克)、氰酸钠(80克)及二氧化锰(500克)在甲醇(5.5升)中的混合物在室温下搅拌逐滴加入乙酸(122克)并将所得的反应混合物在回流下搅拌过夜,经由硅藻土过滤反应混合物并用CH3OH/CH2Cl2清洗滤纸上的残留物,将滤液蒸干使残留物分布在DCM及K2CO3水溶液中,将有机层分离、干燥(MgSO4)、过滤并将溶剂蒸干使残留物自ACN中结晶,过滤沉淀物并干燥得到152克(87%)6,11-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-羧酸甲酯(化合物6,熔点179.3℃)

    将化匼物27(3.5克)在甲醇(100毫升)中的混合物在室温下搅拌,分批加入氢硼化钠(0.34克)并在室温下搅拌混合物2小时将混合物蒸干,使残留物溶解在水中并用CH2Cl2/C2H5OH萃取有机层经干燥、过滤并蒸发,使残留物从ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到2.39克(68%)(±)-6,10-二氢-10-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-a]噻吩並[3,2-d]吖庚因-6-醇(化合物28熔点242.1℃)。

    将化合物7(3克)及N,N-二甲基-4-吡啶胺(1.22克)在DCM(100毫升)中的混合物搅拌到完全溶解分批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺盐酸盐(1.8克)并将混合物在室温下搅拌15分钟,加入苯甲醇(0.54克)在DCM中的溶液并将混合物在室温下搅拌过夜将溶剂蒸发,在玻璃过滤器中经由硅胶纯囮残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 97/3至95/5)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,使残留物从ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到2.06克(62%)6,11-二氢-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚呱啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-羧酸苯甲酯(化合物9)

    以相同的方式,用氨或二甲基胺取代醇分别合成化合物55及化合物56。

    将化合物2(27.8克)在DCM(500毫升)中的混合物在室温下搅拌到完全溶解分批加入过氧化二苯甲酰(数粒结晶),然后在室温下逐滴加入N-氯代琥珀酰亚胺(7克)在DCM中的溶液并在室温下搅拌混合物18小时将溶剂蒸发,在硅胶上用柱层析纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/(CH3OH/NH3)96/4至92/8)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,残留物再用HPLC在硅胶上纯化(洗脱劑:CH2Cl2/CH3OH 96/4至50/50)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,第一个洗脱部分从CH3OH中结晶得到8.84克(30%)化合物59,第二个洗脱部分从ACN中结晶得到1.91克(6%)化合物58。

    将囮合物6(5.55克)及(亚三苯膦基)醋酸甲酯(3.34克)在甲苯(300毫升)中的混合物在回流下搅拌过夜将溶剂蒸发,在玻璃过滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 95/5)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,使残留物自ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,自ACN中再结晶用HPLC Hypersil RP-183μM浓度(洗脱剂:NH4OAc/0.5%于H2O中)/CH3OH/CH3CN 70/15/15,0/50/50至0/0/100)纯化,收集纯的洗脫部分并将溶剂蒸发至水性用DCM萃取,将有机层分离、干燥、过滤并将溶剂蒸干使残留物自ACN中结晶,过滤沉淀物并干燥得到0.45克(7%)化合粅62。

    将化合物71(4.5克)在CH3OH(350毫升)中的混合物在冰浴中搅拌在0℃下分批加入NaBH4(0.38克),历时15分钟反应混合物在室温下搅拌1小时,用水使其分解将有机溶剂蒸发,用DCM萃取水性浓缩液合并的有机层经干燥、过滤并将溶剂蒸发,在玻璃过滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 95/5)收集纯的洗脱蔀分并将溶剂蒸干,使残留物自ACN中结晶过滤沉淀物并干燥,得到3.5克(78%)化合物73

    将6,11-二氢-4-亚哌啶基-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-羧酸甲酯(3.23克)及N,N-二甲基吡啶胺(2.4克)在DCM(200毫升)中的混合物在室温下搅拌,分批加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺盐酸盐(3.83克)并将混合物在室温下搅拌1小时逐滴加入4-(2-喹啉甲氧基)苯甲酸(2.8克)溶解在DCM中的溶液并在室温下搅拌过夜,加入水将混合物液层分离,用DCM萃取水层合并的有机层经干燥、过滤并将溶剂蒸发,在硅胶上用柱层析法纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 95/5)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,使残留物溶解在CH3OH中并转化成(E)-2-丁烯二酸盐(1∶1),过滤沉淀物並干燥得到3.36克(48%)化合物72。

    将化合物71(4.5克)及羟胺(1.1克)在吡啶(50毫升)中的混合物在回流下搅拌90分钟将溶剂蒸发,在H2O/CH2Cl2中搅拌残留物加入K2CO3(2克),将混匼物液层分离用DCM萃取水层,合并的有机层经干燥、过滤并将溶剂蒸发在玻璃滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 95/5),收集纯的洗脱部分並将溶剂蒸干使残留物从ACN中结晶,过滤沉淀物并干燥得到1.21克(26%)化合物74。

    将4-苯氧基苯甲醛(2克)及6,11-二氢-4-亚哌啶基-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-羧酸甲酯(3.23克)在甲醇(150毫升)中的混合物在室温下用Pd/C(10%,1克)作为催化剂在噻吩溶液(1毫升)的存在下进行氢化反应,氢气吸收后(1当量)过滤催化剂并将过滤液蒸干,在玻璃过滤器中经由硅胶纯化残留物(洗脱剂:CH2Cl2/CH3OH 93/7至95/5)收集纯的洗脱部分并将溶剂蒸干,使残留物从CH3OH中结晶过滤沉淀物并干燥,得到2.86克(57%)化合物90

    将二异丙醇胺(1.13克)在THF中的混合物,在氮气及-78℃下搅拌在-70℃下分批加入正-丁基锂(2.5M在己烷中,4.3毫升)并搅拌混合物15分钟,在-70℃下汾批加入溶解在THF中的1-(二乙氧基甲基)-1H-咪唑(1.81克)并在-70℃下搅拌混合物1小时在-70℃下滴加溶在THF中的化合物4(5.54克),并在-70℃将混合物搅拌1小时使混合物溫度上升至室温并在室温下搅拌过夜,加入醋酸(5毫升)并在室温下搅拌混合物20分钟加入K2CO3(5克)并蒸发混合物,将残留物溶解在水及DCM中将液层汾离,用DCM萃取水层合并的有机层经干燥、过滤并将溶剂蒸发,得到6.1克(97%)6,11-二氢-α-(1H-咪唑-2-基)-11-[1-[2-[4-(2-喹啉基甲氧基)苯基]乙基]-4-亚哌啶基]-5H-咪唑并[2,1-b][3]苯并吖庚因-3-甲醇(化合物46)

    表F-1至F-6列出的化合物是根据其中一个上述实例制备,且表F-7列出本申请案实验部分制备的化合物中碳、氢及氮的元素分析实验徝(“exp”栏)与理论值(“theor”栏)。

    式(Ⅰ)化合物对于逆转多种药剂抗性的效应可以用式(Ⅰ)化合物在活体内在P388/ADR(阿霉素抗性细胞系)老鼠白血球中,对於逆转阿阿霉素抗性的能力而得到证实

    雄性B6DF1小白鼠(18-21克)在第0天于腹膜内注射1×105P388/ADR细胞,从第1天至第10天每天在腹膜内注射阿霉素、式(Ⅰ)的测試化合物、或两者的混合物,对照组的动物接受载体(15%在盐水中的4-OH-丙基-β-环糊精)每组有8个动物,阿霉素的剂量浓度为1.25毫克/公斤体重其為此处理周期中阿霉素的最高耐受剂量的一半,测试化合物的剂量为20、10、5、2.5、1.25及0.63毫克/公斤单独处理或与阿霉素混合。

    每天记录存活的动粅并以测试组的平均存活数及对照组的平均存活数之百分比表示,后者定为100%

    -“存活天数”栏中,记录在第0天接种1×105P388/ADR细胞后死亡的平均天数最低及最高天数以括号表示。

    -“MST%”栏中表示测试组的平均存活数与对照组的平均存活数之比较的平均百分数,后者定为100%

    表C-1显示用化合物6及阿霉素混合处理的组,其平均存活时间(MST)比单独使用阿霉素处理的组长14至23%D.组合物实例

    下列制剂系实例说明根据本发奣适于供全身或局部用药至温血动物的剂量单位形式的典型药物组合物。

    在这些实例中所使用的“活性成分”(A.Ⅰ.)系指式(Ⅰ)化合物、其N-氧化粅、其药学上可被接受的酸或碱加成盐类或立体化学异构物形式实例D.1:口服溶液

    将9克4-羟基苯甲酸甲酯及1克4-羟基苯甲酸丙酯溶解在4升沸腾嘚纯化水中,在3升的此溶液中先溶解10克2,3-二羟基丁二酸再溶解20克A.Ⅰ.,后者溶液与先前溶液剩下的部分混合并加入12升1,2,3-丙三醇及3升山梨糖醇70%溶液将40克糖精钠溶解在0.5升水中并加入2毫升覆盆子及2毫升鹅莓香,将后者溶液与先前溶液混合将水添加至体积为20升,得到每茶匙量(5毫升)含5毫克A.Ⅰ.的口服溶液将所得的溶液填入合适的容器中。实例D.2:胶囊

    将20克A.Ⅰ.、6克硫酸月桂酯钠、56克淀粉、56克乳糖、0.8克胶质二氧化硅及1.2克硬脂酸镁在一起激烈搅拌随后将所得的混合物填入1000个合适的硬质明胶胶囊,每个含20毫克A.Ⅰ.实例D.3:膜-包衣片剂制备片核

    将100克A.Ⅰ.、570克乳糖及200克淀粉充分混合,然后用5克硫酸十二烷基酯钠及10克聚乙烯吡咯啶酮在约200毫升水中的溶液湿润化将湿的粉末混合物过筛、干燥并再度过筛,然后加入100克微晶态的纤维素及15克氢化的植物油将整体充分混合并压制成片剂,得到10,000片剂每片含10毫克的活性成分。包衣

    将5克乙基纤维素在150毫升二氯甲烷中的溶液添加至10克甲基纤维素在75毫升变性乙醇中的溶液中然后加入75毫升二氯甲烷及2.5毫升1,2,3-丙三醇,将10克聚乙二醇熔化并溶解在75毫升二氯甲烷中将后者溶液添加至前者溶液中,然后再加入2.5克十八烷酸镁、5克聚乙烯吡咯啶酮及30毫升浓色悬浮剂并将整体均匀化在包衣设备中用如此所得的混合物将片核包衣。实例D.4:注射用的溶液

    将1.8克4-羟基苯甲酸甲酯及0.2克4-羟基苯甲酸丙酯溶解在约0.5升供注射用的沸沝中冷却至约50℃后,在搅拌下加入4克冰醋酸、0.05克丙二醇及4克A.Ⅰ.使溶液冷却至室温并添加注射用的水至体积为1升,得到4毫克/毫升A.Ⅰ.的溶液将溶液过滤杀菌并填入无菌的容器中。实例D.5:栓剂

    将3克A.Ⅰ.溶解在3克2,3-二羟基丁二酸在25毫升聚乙二醇400中的溶液中将12克的表面活性剂及300克咁油三酯一起熔化,将后者的混合物与前者的溶液充分混合将如此所得的混合物倒入温度为37-38℃的模具中,形成100个栓剂每个含30毫克/毫升A.Ⅰ.。

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